Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ. 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. АФК - зависимые процессы и их регуляция 11
1.1.1. Источники активных форм кислорода 12
1.1.2.Механизмы защиты от токсического действия кислорода и 16
его активных форм
1.1.3. Окислительный стресс и ДНК 25
1.2. Адаптация и резистентность 31
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
Постановка эксперимента 37
Получение биологического материала 39
Получение плазмы крови 39
Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов 39
Приготовление гомогенатов тканей 40
2.3. Биохимические методы исследования 40
2.3Л. Хемилюминесцентный (ХЛ) анализ 40
Определение содержания диеновых конъюгатов 41
Определение содержания шиффовых оснований 42
Определение содержания малонового диальдегида 43
Определение содержания белка 44
Определение активности супероксиддисмутазы 44
Определение активности каталазы 45 2.3.8.0пределение концентрации гемоглобина в гемолизате 45
2.3.9. Определение оксидазной активности церулоплазмина 46
2.3.10. Определение суммарной пероксидазнои активности в 47
плазме
2.4. Генетические методы исследования 47
2.4.1. Приготовление препаратов для подсчета анафаз и МИ в 47
эпителиоцитах роговицы глаза крыс
2.4.2. SOS-lux тест 48
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 48
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
3.1. Интенсивность свободно-радикальных процессов и активность 51
антиоксидантних ферментов в отдаленные сроки после воздействия
ГБО на новорожденных животных
3.2. Интенсивность НгОг-лгоминол зависимой ХЛ в тканях 61
предадаптированных животных при ГБО-индуцированном
окислительном стрессе
3.2.1. Интенсивность ХЛ в плазме предадаптированных крыс при 62 окислительном стрессе, индуцированном ГБО (0,5 МПа) 3.2.2 Влияние предадаптации на выживаемость животных в условиях 64 ГБО при давлении 0,7 МПа
3.2.3. Интенсивность ХЛ в различных тканях предадаптированных 66
крыс при окислительном стрессе, индуцированном ГБО (0,7 МПа)
3.3. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в 70
тканях предадаптированных животных при ГБО-индуцированном
окислительном стрессе
Интенсивность перекисного окисления липидов в плазме и 70 эритроцитах предадаптированных животных при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 0,5 МПа - 1ч
Интенсивность ПОЛ в различных тканях предадаптированных 74 животных при ГБО-индуцированном стрессе 0,5 МПа - 1ч
3.3.3. Интенсивность ПОЛ в плазме и эритроцитах 78
предадаптированных крыс при ГБО-индуцированном стрессе 0,7 МПа
до судорог.
3.3.4. Влияние предадаптации на интенсивность ПОЛ в тканях 79
животных при ГБО-индуцированном стрессе 0,7 МПа до судорог.
3.4. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и тканях 83
предадаптированных животных при ГБО-идуцированном стрессе.
Влияние предадаптации на активность антиоксидантных 84 ферментов в эритроцитах и тканях животных при ГБО-индуцированном стрессе 0,5 МПа - 1ч
Влияние предадаптации на активность СОД и каталазы в 94 эритроцитах и тканях крыс при ГБО-индуцированном стрессе 0,7 МПа до судорог
3.5. Мутационные процессы у животных пред адаптированных к 98 окислительному стрессу
3.5.1. Влияние предадаптации на генотоксичность тканей животных 98
при ГБО-индуцированном окислительном стрессе
3.5.2. Кластогенная адаптация к ГБО-индуцированному 100
окислительному стрессу
3.5.3. Пролиферативная активность эпителиоцитов роговицы 106
3.5.4. Аберрации хромосом и пролиферативная активность 108
эпителиоцитов роговицы у потомков предадаптированных животных
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 112
ВЫВОДЫ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АО - антиоксиданты
АФК - активные формы кислорода
АХр - аберрации хромосом
ГБО - гипербарическая оксигенация
ДК - диеновые конъюгаты
К — контрольные животные
МГЭ - мобильные генетические элементы
МДА - малоновый диальдегид
МИ - митотический индекс
МПа - мегапаскаль
ПА — предадаптированные животные
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД - супероксид дисмутаза
СПА - суммарная пероксидазная активность
СРО - свободно-радикальное окисление
СРП - свободно- радикальные процессы
ХЛ — хемилюминесценция
ЦП - церулоплазмин
ШО - шиффовые основания
Введение к работе
Проблема повышения устойчивости организма к воздействию экстремальных факторов среды является весьма существенной, поскольку расширяет спектр исследований природы от космоса до глубин океана. В качестве одного из способов повышения устойчивости организма к воздействию экстремальных факторов была предложена предварительная обработка организма малыми дозами токсического агента, которая получила название предварительной адаптации или предадаптации. Согласно концепции, сформулированной Ригером и Михаэлисом (1978), предобработка организма малыми дозами мутагенов или стрессорных агентов повышает устойчивость клеток к последующим мутагенным воздействиям. Феномен повышения устойчивости организма в результате предадаптации получил название адаптивного ответа (Samson, 1979). Показана неспецифичность феномена адаптивного ответа для различных факторов, условий воздействия (in vivo и in vitro) и объектов (микроорганизмы, растения и животные) (Спитковский, 1992; Joiner е.а., 1999; Опритов и др., 1999; Моргун и др., 2002; Васильева, 2004).
На клеточном уровне сигналом для запуска неспецифической адаптационной реакции служит сдвиг прооксидантно - антиоксидантного равновесия в направлении активации процессов перекисного окисления липидов в биологических мембранах и жидкостях - т.е., окислительный стресс (Ames, 1983; Барабой, 1991). Окислительный стресс является индуктором запуска неспецифических реакций, в результате которых реализуется каскад разнонаправленных метаболитических процессов, результатом которых может быть деструкция мембран, инактивация активности ферментов и гормонов, повреждения ДНК, нарушение клеточного цикла и, в конечном итоге, гибель клетки (Меерсон, 1981; Chiu et al., 1989, 1997; Jackson et al., 1998; Bunout, Cambiazo, 1999; Kang et al., 1999; Klein et al, 2003; Singh, 2004; Лю, 2005).
7 Ранее было показано, что предварительное воздействие малых доз может
повышать устойчивость организма к более сильным воздействиям в
результате предадаптации метаболических систем организма, приобретенной
в процессе реакции на первичное воздействие (Гаркави, Квакина, 1990). В то
же время, онтогенетический аспект этого явления ранее практически не был
освещен в научной литературе. Немногочисленные исследования,
посвященные этой проблеме и выполненные на низших позвоночных
(Тимофеева, 1997), оказались недостаточными для анализа механизма
установления устойчивости ювениальных форм, обработанных низкими
дозами агентов, к экстремальным воздействиям, которым подвергается
организм во взрослом состоянии. Однократное воздействие гипербарической
оксигенации на ранних этапах онтогенеза Xenopus laevis изменяет
способность антиоксидантных систем взрослого организма реагировать на
окислительный стресс, причем малые давления (0,2 МПа) способствуют
биохимической адаптации, в то время как высокие (0,7 МПа) приводят к
дисбалансу и ингибированию систем, ответственных- за антиоксидантную
защиту. Эти данные свидетельствуют о формировании онтогенетического
импринтинга после адаптивного воздействия окислительного стресса
(Гуськов и др., 1999).
Цель данной работы - оценить степень и длительность сохранения
метаболического следа после воздействия на новорожденных крысят низкой
дозы ГБО, оценить возможность повышения устойчивости
предадаптированных животных к воздействию стрессорных режимов агента в
отдаленные сроки после предадаптации, а также оценить изменение нормы
реакции на окислительный стресс в потомстве, полученном от реципрокных
скрещиваний предадаптированных крыс.
Задачи исследования:
1. Определить интенсивность хемилюминесценции, перекисного окисления
липидов, активность антиоксидантных ферментов, уровень аберраций
хромосом и генотоксичность различных тканей животных в отдаленные
8 сроки (б и 12 месяцев) после их обработки ГБО (0,2 МПа-1ч) в новорожденный период.
2. Определить интенсивность свободно-радикальных процессов и
антиоксидантный статус в различных тканях предадаптированных животных
(0,2 МПа-1ч, новорожденные) после повторного воздействия ГБО (0,5 МПа -
1ч или 0,7 МПа до судорог) на половозрелых крыс.
3. Оценить уровень аберраций хромосом, пролиферативную активность и
генотоксичность различных тканей предадаптированных крыс (0,2 МПа-1ч,
новорожденные) в ответ на повторное воздействие, индуцированное
токсическими режимами ГБО (0,5 МПа -1ч или 0,7 МПа до судорог), на
половозрелых крыс.
4. Оценить спонтанный и индуцированный ГБО (0,5 МПа-1ч) уровень
аберраций хромосом в соматических тканях потомства, полученного в
результате реципрокных скрещиваний предадаптированных родителей
(0,2МПа-1ч, новорожденные).
Научная новизна. Впервые показано, что однократное воздействие повышенного давления кислорода (0,2 МПа-1ч) на новорожденных крыс изменяет внутриклеточный метаболизм тканей, в частности систем, ответственных за перекисное окисление липидов, и формирует качественно новое соотношение про - и антиоксидантних систем в организме, которое способно сохранятся длительное время. Впервые показано, что предварительное действие низкого режима ГБО (0,2 МПа-1ч) на ранних стадиях постэмбрионального развития уменьшало выраженность стресс-индуцированного накопления продуктов перекисного окисления липидов во всех исследованных тканях после повторного воздействия ГБО (0,5 и 0,7 МПа) через 6 и 12 месяцев. Впервые показано, что предадаптированные в новорожденный период крысы, обладают повышенной устойчивостью генома. Таким образом, впервые показано, что для формирования устойчивой долговременной адаптации к стрессу достаточно однократного воздействия ГБО (0,2 МПа-1ч) в новорожденный период. Впервые показана возможность
передачи устойчивости к окислительному стрессу от животных, однократно
обработанных в новорожденный период низким режимом ГБО, своим потомкам, при этом более отчетливо это прослеживалось в случае, когда пред адаптированной была самка. Основные положения, выносимые на защиту:
После воздействия на новорожденных животных низкой дозы кислорода под давлением формируется качественно новое соотношение про-и антиоксидантных систем в организме.
Интенсивность ХЛ, количественное содержание продуктов ПОЛ и динамика активности антиоксидантных ферментов свидетельствуют о том, что предадаптированные животные приобретают повышенную устойчивость к токсическим режимам ГБО.
Однократная обработка животных низкой дозой ГБО в новорожденном возрасте снижает либо удерживает на стационарном уровне выход аберраций хромосом в ответ на повторное действие токсических режимов, и этот эффект сохраняется у потомков предадаптированных самок и не выявлен у потомства пред адаптированных самцов.
Для формирования устойчивой долговременной адаптации к окислительному стрессу достаточно однократного воздействия низкой дозы ГБО на животных в ранние сроки постнатального развития.
Теоретическое и практическое значение работы: В общетеоретическом плане выполненная работа расширяет существующие представления о механизмах предадаптации млекопитающих к окислительному стрессу. Данные, представленные в работе, позволяют как количественно, так и качественно оценить влияние предадаптации новорожденных животных на устойчивость к повреждающему воздействию на ткани организма ГБО — индуцированного стресса. Выявлена возможность пред адаптировать однократной обработкой ГБО в новорожденный период организм взрослых животных к окислительному стрессу. Установлен материнский эффект
наследования устойчивости к окислительному стрессу. Полученные в работе
данные представляют существенный интерес для раскрытия АФК-зависимых механизмов приспособления организма к постоянно меняющимся условиям окружающей среды, а также для разработки различных методов повышения резистентности организма к экстремальным условиям среды. Полученные результаты расширяют представления о свободно-радикальных и мутационных процессах в организме при окислительном стрессе, открывают новые перспективы их практического применения в адаптационной медицине. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются в курсах лекций «Свободные радикалы в живых системах», «Мутагены окружающей среды», «Химический мутагенез», «Концепции современного естествознания».