Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время важность разработки методоз анализа последовательностей биополимеров является общепризнанной. Среди задач такого анализа обращают на себя внимание две связанные проблемы: проблема классификации и структурно-функциональной разметки последовательностей. Часто такие задачи выступают в виде задачи множественного выравнивания и построения дендрограмм сходства.
Выравнивание последовательностей задает определенный набор отношений между входящими в них символами (т.е. структурными единицами биополимера). С точки зрения молекулярного биолога, адекватным является такое выравнивание, которое правильно ставит в соответствие друг другу либо зволюцнонно гомологичные, либо структурно (функционально) аналогичные фрагменты последовательностей. Существуют десятки методов множественного выравнивания последовательностей, использующих разные математические модели, разные алгоритмы и опирающихся на разные представления о предметной стороне проблемы (Chan et al. 1992). Однако, качество работы большинства методов (то есть их способность отражать наши представления о структуре, функции и эволюции реальных биополимеров) является неудовлетворительным (см. McCIure et al. 1994). Одной из основных причин этого является несоответствие задачи, которую ставят исследователи (выровнять аналогичные либо гомологичные остатки), и задачи, решаемой большинством методов (обычно это точный либо приближенный поиск экстремума целевой функции, определенной на пространстве возможных выравниваний). Отсюда проистекает необходимость поиска новых подходов к решению этой задачи.
Адекватное множественное выравнивание позволяет исследователю, изучающему конкретный биополимер, ответить на ряд вопросов и в первую очередь - определить место объекта исследования в общей системе. Примером такого исследования является анализ последовательности недавно итсеквенированного фермента бактериальной системы рестрикции-модификации - метилтрансферазы Sse9I, позволивший найти место этого фермента в рамках существующей классификации метилтрансфераз, расширить эту классификацию и уточнить определение консервативных мотивов, выявленных ранее в метилазах.
К одной из задач, предъявляющих требования качества и эффективности к используемому методу выравнивания, относится задача анализа последовательностей пикорнавирусов. Геномная РНК нико-рнавирусов содержит 7.2-ь8.5 тысяч оснований, в базах данных имеется около 50 отсеквенированных полных геномов. Такой объем данных в совокупности со сравнительно хорошей изученностью молекулярной биологии пикорнавирусов делает их перспективным объектом исследо-
вания. В данной работе изучаются пути, темпы и режимы молекулярной эволюции пикорнавирусов а также особенности основного источника эволюционной изменчивости - процессов спонтанного мутагенеза в их РНК-решшкацнонных системах.
Цела исследовании. Первой целью работы было создание эффективного метода множественного выравнивания, который бы мог служить практичным инструментом для задач исследования последовательностей биополимеров. К такому методу предъявляются следующие требования: возможность получать биологически адекватные выравнивания при минимально возможном сходстве объектов сравнения; позволять обрабатывать на персональных компьютерах десятки последовательностей длиной в сотни символов за время, измеряемое минутами; быть легко адаптируемым для задач филогенетического анализа и поиска сходства в базах данных. Метод предполагалось использовать для решения последующих задач.
Вторая цель работы - исследование аминокислотной последовательности метилтрансферазы Sse9Iy секвенированной в 1996 г. сотрудниками предприятия СИБЭНЗИМ г. Новосибирска. В цели этого анализа входила идентификация структурно-функциональных мотивов последовательности, классификация новой метилтрансферазы и критическое рассмотрение существующих представлений о консервативных элементах метилтрансфераз системы рестрикции-модификации.
Третья цель работы - изучение молекулярной эволюции пикорнавирусов путем сравнительного анализа последовательностей их генов и белков: исследование путей, темпов и режимов их эволюции а также процессов спонтанного мутагенеза, обусловленного ошибочным включением оснований при репликации вирусной РНК. Задачи исследований. В ходе исследования ставились следующие задачи: разработка метода множественного выравнивания последовательностей биополимеров и реализация его в виде набора высокоэффективных программных модулей; анализ быстродействия и качества работы метода и сравнение его с существующими подходами; идентификация структурно-функциональных мотивов в последовательности метилтрансферазы Sse9I и классификация этого фермента; построение множественного выравнивания и анализ сходства последовательностей метилтрансфераз, сходных по структуре с Sse9I; уточнение существующих представлений о классификации и особенностях последовательностей метилтрансфераз прокариот; построение множественного выравнивания и дендрограмм сходства последовательностей генов и белков пикорнавирусов, исследование классификации вирусов этого семейства, сравнение реконструированных путей эволюции отдельных генов и регионов пикорнавирусного генома; расчет частот синонимических и несинонимических замен, а также вставок и делеций, в род-
ственных группах пнкорнавирусов; сравнение темпов и режимов молекулярной эволюции отдельных генов; расчет частот отдельных типов нейтральных, замен в генах пнкорнавирусов, определение параметров процессов спонтанного мутагенеза" при реплгпезглп: вирусной РНК, определение контекстной обусловленности частоты фиксации замен отдельных оснований.
зЗВ;№_ЛШїшнг, Разработакый метод множественного выравнивания последовательностей является оригинальным и, в отличие от большинства существующих методов, использует ряд представлений о структуре и эволюции биополимеров, что позволяет получать более здеісват-иыг выравнивания при небольших затратах вычислительных ресурсов.
С помощью предложенного метода впервые произведен анализ нос.пкдонагельиікіти меіилтрансферази Ssc?I, усгигзмгпа. пріг"?,'^'!?-носгь этого фермента к. классу 3 металтраігсфераз. Впервые предложено разделение данного класса ферментов на две подгруппы п уточнены позиции консервативных элементов метилаз подгруппы Sse9I.
Молекулярная эволюция генов и белков пнкорнавирусов проанализирована на материале, превосходящем по объему материал предыдущих исследований (Stanway 1990). Впервые исследованы соотношения между отдельными типами элементарных зволюционных событий (синонимическими и нееннонимическнми заменами, вставками и деле-шкмии) у пнкорнавирусов, отмечено различие типов структурно-функциональных ограничений на организацию последовательностей между отдельными белками пнкорнавирусов. Предложена оригинальная модель мнкроэволюцни вируса полиомиелита. Впервые исследованы характеристики процессов спонтанного мутагенеза в реплккацк-онной системе пикорназирусон.
Теоретическая а крзхютееаал иеясеста гпС'-зтм- Разработанный s?c-тод множественного выравнивания использует оригинальную процедуру поиска маршрута выравнивания, базирующуюся на представлениях о природе сходства реальных биополимеров. По качеству работы метод не уступает лучшим мировым образцам и пригоден при этом к использованию на персональных компьютерах. Уточнены представления о классификации и организации последовательностей ферментов, важных для генной инженерии и биотехнологии - метилтрансфераз бактериальной системы рестрикции-модификации. Исследована молекулярная эволюция пнкорнавирусов - патогенов человека и животных, уточнена классификация внутри семейства. Результаты исследования проливают свет на режимы эволюции пнкорнавирусов и на функционирование системы репликации вирусной РНК.
Апробалиа работы. Материалы исследования были частично представлены на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН 1993 и 1996 годов, на Четвертой Международной конференции Общества молекулярной
биологии и эволюции (Tucson, США, июнь 1996 г.) и на Втором Сибирском Конгрессе по Прикладной и Индустриальной Математике -ИНПРИМ-96 (Новосибирск, июнь 1996).
Структура работы. Работа состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Глава 1 содержит обзор литературы. Глава 2 содержит описание методов, использовнных в данном исследовании. Глава 3 содержит изложение и обсуждение полученных результатов. Работа изложена на 121 странице машинописного текста и содержит 14 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 187 ссылок.