Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная модель гомологической рекомбинации у E.coli предусматривает такую цепь реакций. 1)Раскручивание и экзонуклеазная деградация двунитевой (дн) донорной ДІЖ с образованием молекулы с однонитевым (он) 3'-концом. 2)Мультиме-ризация мономеров RecA, "заряженных" молекулой АТФ и ионом MgZt, с образованием рекомбинационно-активного филамента RecA-ДНК. 3) Гомологическое узнавание филаментом реципиентной днДНК, вовлечение ее в структуру филамента и образование триплексной ДНК. ^Переключение спаривания в составе филамента тнДНК/RecA с образованием гетеродуплексной ДНК. состоящей из реципиентной и донорной нитей, и одновременное вытеснение онДНК реципиента из филамента. 5) Спаривание вытесняемой нити с комплементарной нитью донора -возникновение "структуры.Холидея". 6) Миграция-структуры Холидея вдоль взаимодействующих молекул, сопровождающаяся расширением гетеродуплексной ДНК. 7) Эндонуклеазное расщепление структуры Холидея, завершающее рекомбинацию на уровне либо вставки онДНК донора в днДНК реципиента, либо полного двунитевого обмена (кроссовера).
Для гомологической рекомбинации RecA важен тем, что контролирует реакции 2-6. Однако, до сих пор остается открытым вопрос о зго структурно-функциональной организации: каким образом осущест-зляется взаимодействие мономеров RecA и каков механизм взаимодействия в нуклеопротеиновом филаменте, образуемом белком RecA на 1НК. Это особенно актуально в связи с последними данными об уни-зерсальности структуры нуклеопротеинового филамента RecA: иденти-шость организации филаментов, образуемых на ДНК белками RecA, Iad51 и UvsX (аналог белка RecA у Т4).
Наличие RecA-подобных филаментов у эукариот предполагает кон-іервативность в эволюции этого нуклеопротеинового комплекса и мо-іекулярного механизма узнавания и обмена нитей между гомологичными :олекулами ДНК для про- и для эукариот. Таким образом, данные изу-ения белка RecA могут быть полезны для исследования механизмов ^комбинации и репарации у высших, включая и человека.
Цель работы. Структурно-функциональный анализ белка RecA. зучение функций карбоксил-концевого домена белка.
Задачи работы. Получение методом сайт-направленного мутаге-эза новых мутаций в предполагаемых функционально-значимых облап-чх белка RecA. Изучение генетических и биохимических свойств по-
- 4 -лученных мутантов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен подход получения функционально-термочувствительных мутантов. Получено 3 новых термочувствительных и 4 нетермочувствительных мутанта в гене гесА. Локализована ранее описанная мутация гесА200. Показано, что молекула АТФ стабилизирует С-концевой домен"RecA и что С-концевой домен важен для его мультимеризации и взаимодействия с днДКК.
Апробация работы. Материалы диссертационный работы были доложены на 1 съезде ВОГиС в 1994 году, на семинарах лаборатории биофизики белка и лаборатории молекулярной генетики Университета Г.Осака (Япония), лаборатории энзимологии CNRS (Франция).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введеіГия, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения! выводов и списка цитируемой литературы (147 наименований). Работа изложена на 122, страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 23 рисунка. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.