Введение к работе
Актуальность темы. В современной генетике человека одной из наиболее интенсивно разрабатываемых областей является изучение информационного содержания генома человека. Уже около 10 лет развернут прямой анализ геномной ДНК человека в рамках международной научной программы "Геном человека" (Celis, 1991). Параллельно, в целях выяснения информационного содержания генома человека, достаточно активно ведутся комплексные исследования белковых продуктов генной экспрессии (ЕПГЭ), которые в последние годы все больше приобретают черты международной кооперации, получившей специальное название - "Протеом" ("From genome to proteome"; 2nd Sienna 2D Electrophoresis Meeting Abstract-, 1996). Методологической основой протеомных исследований стали наделено установленные закономерности в реализации генетической информации и так называемый системный подход, дающий возможность параллельного изучения сотен и тысяч БПГЭ, содержащихся в каком-либо биологическом объекте, благодаря очень высокой разрешающей способности метода двумерного электрофореза по О'Фарреллу (Celis J, 1991, Klose J, 1989).
Исследования БПГЭ отдельных тканей и органов человека образуют важную составляющую в создаваемой программе «Протеом человека» (Sanchez J, 1995). Они, фактически, дают возможность охарактеризовать особенности функционирования генома в конкретном виде клеток или тканей, например, в поперечнополосатой мышечной ткани. Именно БПГЭ этой ткани сталії объектом исследования в данной работе. Исхода из представлений о генетическом контроле за клеточной дифференцировкой, задача описания специфических наборов БПГЭ, имеющихся в определешых клеточных линиях или образцах тканей и органов, рассматривается как способ прямого анализа той части генома, функционирование которой обеспечивает конк]эетный тип дифференцировки. Постепенно углубляя знания об этой части генома и иакагошиая данные о выявляенньтх БПГЭ, последователи
получают реальную возможность искать новые гены человека и расширять представления об информационном содержании генома.
Другой аспект актуальности протеомной стратегии связан с тем, что она, в конечном счете, предполагает построение полного каталога БПГЭ человека с идентификацией каждого БПГЭ в каждой ткани, сопоставление БПГЭ, экспрессирующихся в различных тканях и выявление тканеспецифичных БПГЭ (Sanchez J, 1995, Celis J, 1996). Подобные каталоги БПГЭ позволят наиболее эффективно проводить поиски молекулярных маркеров наследственных и ненаследственных заболеваний, а также изучать онтогенетические, патогенетические и фенотипические особенности функционирования геномов.
К настоящему времени уже создан ряд баз данных, которые содержат сведения о БПГЭ печени, почки, сердца, плазмы, красных кровяных клеток, спинномозговой жидкости человека, экспрессирущихся как в норме, так и при некоторых патологических состояниях, а также сведения о максимальных фенотишиеских отклонениях по некоторым белкам (Golaz О., 1996, Jungblut Р., 1994)..
Вместе с тем, продолжение исследований БПГЭ поперечнополосатой мышечной ткани человека представляет значительный интерес как в связи с необходимостью углубления представлений о особенностях функционирования генома в этих тканях, а также о структурно-функциональных свойствах мышечных белков в связи с возможностью выявления изменений на молекулярном уровне, ассоциированных с протеканием различных заболеваний ( Dunn M.J., 1996, Jungblut P., 1994). Особый интерес при этом вызывает разработка подходов к анализу тех БПГЭ, которые непосредственно связаны с функционированием генома, например ДНК-метилаз, которым приписывается ключевая роль в обеспечении стойкой репрессии генов при дифференцировке (Альберте Б., Брей Д., 1994). Этим ферментам поперечно-полосатой мышечной ткани посвящен специальный раздел представляемой работы.
Кроме того, данные о БПГЭ могли бы послужить основой для
создания патогенетически обоснованных методов точной диагностики
наследственных, генетігческих обусловленных и ненаследственных
болезней, затрагивающих мышечные ткани. Например, высокая частота
заболеваний миокарда человека при сравнительно малой
информированности о молекулярных основах организации этой ткани делают актуальными исследования БПГЭ именно сердечной мьппцы в норме и патологии. Очевидно, что банки данных о мышечных БПГЭ могли бы стать удобным инструментом исследованиях молекулярных изменений при протекании соответствующих патологических процессов. Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей генной экспрессии в поперечнополосатой мышечной ткани человека в норме и при некоторых патологических состояниях с помощью анализа структурно-функциональноых свойств БПГЭ на основе применения системного подхода, а также сравнение БПГЭ в зрелой мышечной ткани и в культивированных миоцитах человека.
В соответствіш с целью исследования в работе решались следующие задачи:
-
Провести сравнительное изучение 2-ЭФ белковых паттернов поперечнополостых мышц человека при использовании амфолинового и иммобилинового градиентов рН.
-
Охарактеризовать особенности функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани как комплекс наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии (БПГЭ) и по обобщенным результатам нескольких видов двумерного электрофоретического анализа построить новую, расширенную версию каталога мышечных БПГЭ человека, дополнив ранее полученные данные результатами анализа БПГЭ в системе двумерного электрофореза IPG-DALT.
-
На основе особенностей генетически детерминируемой первичной структуры БПГЭ идентифицировать ряд новых фракций на двумерных картах сердечной и скелетной мышцы, осуществить поиск новых БПГЭ, а также тканеспецифичных БПГЭ.
-
Показать, что свойства ДНК-метилаз - ферментов, участвующих в регуляции генной экспрессии, могут исследоваться в поперечнополосатой мышечной ткани человека прямым анализом в рамках системного подхода.
-
Изучить изменения спектра БПГЭ при наследственных и ненаследственных заболеваниях миокарда.
-
Исследовать особенности генной экспрессии в культивируемых миобластов человека по БПГЭ в сравнении с мышечной тканью и оценить возможные изменения генной экспрессии при влиянии различных факторов роста.
Научная новизна работы. Получены новые данные об особенностях функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани - построена новая расширенная версия каталога БПГЭ поперечнополосатой мышцы человека, в которую включены дополнительные сведения о 34 БПГЭ, обладающих рі в зонах кислых и щелочных значений рН. Эти БПГЭ удалось выявить благодаря использованию новой модификации 2-ЭФ с применением иммобилизованного градиента рН. Построенная версия каталога содержит также новые результаты идентификации БПГЭ, установлено, что: №4328724 является фосфатидилэтаноламинсвязующим белком, №4462716 скелетномышечной карбоангидразой III, №4950704 - аконитазой, №4715547, №4701540, №4665531, №4645527, - 4 фракции десмина, №4394875 и № 4380895 - сердечная и скелетномышечная изоформы тропонина I. Обнаружен БПГЭ №4276623, в первичной структуре которого есть участок, соответствующий фрагмешу последовательности цитокератина, и два других участка, которые не присутствуют в каких-либо секвешфованных
БПГЭ человека (по банку данных SWISS-PROT). Таким образом, по-видимому, эта полипептидная цепь является новым БПГЭ.
Впервые показано, что в белковых фракциях, полученных 2-ЭФ, можно определять ДНК-метилазнуго активность, и, в частности, обнаружена ДНК-(цитозин-5) метилазная активность во фракции актина. Изучение спектра БПГЭ миокарда человека прп некоторых наследственных и
НенаСЛеЯГТВЙНТПЛУ ^ябоТТРТіЯННЯХ Ш,ТЯШГПГ> ПЯП НЄПЧПРГТНМУ пянее. И'чхтенр.тгой,
при ДКМП и реакции отторжения трансплантата моикарда. Научно-практическая значимость. Комплекс БПГЭ, выявленных в образцах поперечнополосатой мышцы человека, представляет собой интегральную характеристику функционирования генома человека, прошедшего процесс дифференцировки по мышечному тішу, и получение такой характеристики, очевидно, является важным и значимым научным результатом. Вместе с тем, значимость полученных данных в немалой степени будет определяться и возможностями дальнейшего использования их в разработке разлігчньїх генетических проблем, связанных с реализацией генетической информации при физиологических процессах и патологии. Представленная в работе новая версия каталога БПГЭ открывает дополнительные перспективы для исследований генной экспрессии в мышечной и других тканях человека, она позволит также улучшить направленность и повысить эффективность сравнительного анализа БПГЭ при разлігчньїх видах наследственной патологии миокарда.
Дальнейшее изучение выявленного нового члена семейства цитокератинов (БПГЭ №4276623) возможно позволит или обнаружить новый ген, кодирутощий данньш продукт, или приведет к новому варианту альтернатішного сплайсинга какого-либо из известных цитокератиновых генов. Кроме того, этот результат демонстрирует значение исследований первичной структуры у БПГЭ, полученных 2-ЭФ, для поисков новых генов
Результаты анализа ДНК-метилаз, который, как показано в работе, успешно можно сочетать с 2-ЭФ и системньши исследованиями БПГЭ, могут сыграть важное значение в изучении клеточной дифферешшровки и ряда других генетически детерминируемых процессов.
Данные о влиянии фактора роста фибробластов и фактора роста эпителия на генную экспрессию в культивируемых миобластах человека представляют интерес для установления молекулярных механизмов контроля за клеточной пролиферацией и могут иметь определенное биотехнологическое значение.
Выявленное уменьшение альфа-В-кристаллина в сердечной мышце и увеличение содержания этого БПГЭ, а также продукта его деградации в тканях почки при реакции хронического отторжения трансплантата сердца позволяет приблизиться к выяснению молекулярных механизмов патогенеза этого грозного осложнения, возникающего после пересадок сердца. При подтверждении выдвинутого предположения о том, что кристалшш миокарда может из поврежденных мышечных клеток попадать в кровь, а затем в почки, можно рассчитывать на использование этого БПГЭ в качестве молекулярного маркера данного патологического процесса. Таким образом, возникнет возможность создания диагностикума на реакцию отторжения трансплантатов сердца. Следует отметить, что на настоящий момент реакция отторжения трансплантата сердца диагностируется только функционально (по развитию сердечной недостаточности) или морфологически, с использованием биопсии миокарда. Соответственно, можно думать, что тест на присутствие альфа-В-кристаллина в крови позволит осуществлять более раннюю и быструю диагностику данного осложнения.
Модифицированный полупрепаративный метод выделения белков из двумерных гелей позволяет получить высокоочшценные препараты индивидуальных белков, в количествах, достаточных для приготовления в
последующем антител и создания иммунологического диагностикума. Основные положения, выносимые на защиту,
1). Охарактеризованы особенности функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани, выражающиеся в виде формирования определенного комплекса из наиболее представленных БПГЭ и по обобщенным результатам нескольких видов двумерного электрофоретического анализа построена новая (третья) расширенная версия каталога этих БПГЭ, дополненная сведениями о 34 БПГЭ и результатами идентификации 10 БПГЭ.
2). Свойства ДНК-метилаз - ферментов, участвующих в регуляции генной экспрессии, могут исследоваться в поперечнополосатой мышечной ткани человека прямым анализом в рамках системного подхода, который показал, что во фракции актина присутствует ДНК-(цитозин-5) метилазная активность.
3) В аутопсийных образцах пациентов с дилятационной кардиопатией
4^^^^-^1^11^11110 -^пртдт»д_КПГЭ з_даи леактиш хроничрскпоі
отторжения трансплантата сердца происходит уменьшение содержания альфа В кристаллита, сочетающееся с накоплением альфа В кристаллита и продукта его деградации (или модификации) в тканях почки. 4). Фактор роста фибробластов и фактор роста эпителия оказывают влияние генную экспрессию в культивируемых миобластах человека.
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, вьшоды, заключение, список литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста и ііллюстрирована 8 табліщами и 25 рисунками. Список литературы содержит 258 источников, включая 208 работ зарубежных авторов.