Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов диф-іеренциальной экспрессии генов, лежащих в основе клеточной диффе-енцировки и органогенеза, находится на стыке генетики, молекулярной иологии и биологии развития и представляет собой одно из центральных аправлений в современной биологии.
Кристаллины, структурные белки хрусталика глаза позвоночных и гспозвоночных животных, являются удобными маркерами для исследова-ия таких проблем как: дифференцировка, эмбриональная индукция, ре-:нерация, старение, молекулярная эволюция.
В результате усилий ряда исследовательских групп в США, Канаде, понии и др. выделены и структурно охарактеризованы гены, кодирую-ие основные классы белков хрусталика высших позвоночных: а-, Р-, у- и кристаллинов (Wistow et al 1994, Piatigorsky et al., 1988, Kondoh et al. 183).
Наши исследования посвящены изучению уникального белка кристаллина, специфического для лягушек рода Rana.
р-кристаллин принадлежит к суперсемейству НАДФ-Н-зависимых дуктаз - ферментов углеводного обмена (Watanabe К., et al., 1988). Сравне-іе аминокислотных последовательностей р-кристаллина и белков семей-ва альдо-кеторедуктаз различных видов животных и человека показало ачительную гомологию между ними (50-70%). Во всех белках вышеука-ного семейства были обнаружены высококонсервативные области, в стности сайты связывания кофермента НАДФ-Н. Такого рода сайты оке были обнаружены в аминокислотной последовательности р-исталлина (с 45 по 53 и с 268 по 274), полностью совпадающие с сайтом «ывания НАДФ-Н для альдозоредуктазы из печени человека и простаг-адин-Р-синтазы из легких быка. Однако, ферментативная активность у фисталлина не обнаружена (Carper et al., 1987). Особый интерес пред-івляют структурные исследования регуляторных областей эволюцион-
но-родственных генов р-кристаллина и ферментов альдо-кето-редуктаз. что является предметом наших исследований.
В последние годы структурно-функциональные исследования регу ляторных областей генов кристаллинов приобретают особое значение і связи с установлением участия ряда гомеобоксных белков в регуляциі экспрессии кристаллинов (Dorn et al., 1994, Cvekl et al., 1994,1995).
Выяснение молекулярных механизмов тканеспецифической экспрес сии, идентификация факторов, отвечающих за активацию генов кристал линов имеет не только теоретическое значение, но возможно, будет ис пользовано в медицинской практике, в частности при разработке методо лечения некоторых заболеваний глаза связаных с нарушением функциі хрусталика, например, диабетической катаракты (Kinoshita et al.,1990). Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является структур но-функциональная характеристика гена р-кристаллина лягушк; R.temporaria.
Задачи исследования сформулированы следующим образом:
-
Получение и определение первичной структуры полноразмерной кДЦ] р-кристаллина, которая необходима для поиска соответствующего гена.
-
Анализ тканевой специфичности экспрессии гена р-кристаллина.
-
Создание представительного банка геномных клонов и выделение клс нов, содержащих фр агменты гена р-кристаллина.
-
Построение рестрикционных карт полученных клонов.
-
Структурно-функциональная характеристика гена р-кристаллина. Уст: новление экзон-интронной структуры исследуемого гена.
-
Идентификация и структурная характеристика промоторного участі гена р-кристаллина.
Научная новизна. В диссертационной работе впервые представлена детал: ная структурно-функциональная характеристика гена р-кристаллина л:
лики. Идентифицирован и структурно охарактеризован 5'-ланкирующий участок гена р—кристаллина.
Основные положения, отражающие новизну работы:
Впервые выделена и отсеквенирована полноразмерная кДНК -кристаллина.
Впервые получены доказательства тканеспецифической экспрессии на р-кристаллина в хрусталике глаза лягушки Rana temporaria.
Из геномного банка выделены и проанализированы клоны, содержа-ие информацию о полной структуре гена р-кристаллина.
Впервые построена полная экзон-интронная карта гена р-кристаллина. олучена информация о сходстве экзон-интроннон композиции генов -іисталлина лягушки и альдозоредуктазы крысы.
Идентифицирован и структурно охарактеризован участок гена кристаллина, имеющий гомологию с промоторным участком эволюци-іно-родственного гена карбамил фосфат синтетазы-1 (CPS-1) Rana tesbeiana. В полученной структуре идентифицирован ряд регуляторных ементов, характерных для промоторов генов некоторых кристаллинов. іактическая значимость. Полученные нами данные могут использоваться заботе ряда лабораторий, занимающихся исследованием пространствен-й структуры кристаллинов (Институт белка РАН), исследованием моле-пярных механизмов развития и регенерации (Институт биологии разви-ч), а также могут быть использованы исследователями-генетиками и цицинскими генетиками (Институты общей генетики и биологии гена Н, Институт генетики человека РАН).
бликации и апробация результатов. Основные научные результаты, пред-вленные к защите, опубликованы в 12 печатных работах. Материалы ;сертации докладывались на 4 международных и 2 Всесоюзных научных іференциях. Апробация диссертации проведена на объединенном семи->е лабораторий генетики, молекулярно-генетических основ онтогенеза, химической эмбриологии, проблем регенерации Института биологии вития им. Н.К.Кольцова РАН.
Структура и объем работы . Диссертация состоит из введения, обзора лі
тературы, описания материалов и методов, изложения полученых результ;
тов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой научной литератур
. Работа изложена на//^^страницах машинописного текста, иллк
стрирована рисунками и таблицами.