Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1 Многофакторные заболевания и феномен сочетания болезней 17
1.1.1 Общее представление 17
1.1.2 Классификация и основные термины 20
1.2 Сердечно-сосудистый континуум (ССК) 23
1.2.1 Предпосылки и основные факторы риска 23
1.2.2 Формулировка концепции 27
1.2.3 Основные модели 28
1.3 Генетические основы болезней сердечно-сосудистого континуума 30
1.3.1 Ассоциация однонуклеотидных полиморфизмов с болезнями ССК 30
1.3.2 Связь вариаций по числу копий участков ДНК с болезнями ССК37
Глава 2. Материал и методы исследования 45
2.1 Дизайн исследования. Объем и структура материала исследования 45
2.2 Пробоподготовка образцов 49
2.3 Молекулярно-генетические методы исследования 50
2.3.1 Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов с помощью биологических микрочипов 50
2.3.2 Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов с помощью масс-спектрометрии (MALDIOF) 51
2.3.3 Детекция вариаций числа копий участков ДНК с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации (array-CGH) 56
2.3.4 Детекция вариаций числа копий участков ДНК с помощью TaqMan-зондов при ПЦР в режиме реального времени 63
2.4 Биоинформатическая обработка данных 67
2.4.1 Анализ однонуклеотидных полиморфизмов 67
2.4.2. Оценка спектра вариаций числа копий участков ДНК (CNV) при болезнях ССК 70
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3.1 Однонуклеотидные полиморфные варианты и коморбидность болезней сердечно-сосудистого континуума 73
3.1.1 Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом «униморбидная ИБС» 74
3.1.2 Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом «коморбидная ИБС с артериальной гипертензией» 81
3.1.3 Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом сердечнососудистый континуум 88
3.1.4 Валидация генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов с помощью MALDIOF масс-спектрометрии 96
3.1.5 Оценка прогностической эффективности однонуклеотидного полиморфизма в отношении риска развития заболеваний сердечно сосудистого континуума 98
3.2 Детекция CNV у пациентов с фенотипом «сердечно-сосудистый континуум» с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации 104
3.2.1 Общая характеристика идентифицированных CNV 104
3.2.2 Идентификация CNV у больных с фенотипом «ССК» 105
3.2.3 Верификация и анализ частоты идентифицированных CNV 132
Заключение 137
Выводы 148
Список сокращений 150
Список литературы 153
Приложения 201
- Ассоциация однонуклеотидных полиморфизмов с болезнями ССК
- Детекция вариаций числа копий участков ДНК с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации (array-CGH)
- Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом сердечнососудистый континуум
- Идентификация CNV у больных с фенотипом «ССК»
Введение к работе
Актуальность исследования
Исследование природы феномена сочетания болезней имеет фундаментальное значение для развития медицины. Причин этому несколько: стойкая тенденция увеличения числа лиц со множеством заболеваний, обусловленная увеличением продолжительности жизни; сочетание широко распространённых многофакторных заболеваний (МФЗ) изменяет их клиническую картину и течение, характер и тяжесть осложнений, а также затрудняет лечебно-диагностический процесс. Предполагается, что важным условием для развития сочетания заболеваний являются общие паттерны патогенетических событий и процессов, существующие между заболеваниями.
Широкое распространение среди многофакторных заболеваний в России и мире имеют болезни системы кровообращения, главным образом, ишемическая болезнь сердца (ИБС) (ВОЗ, 2015; Росстат, 2015). Известно, что ИБС без сопутствующей патологии или «униморбидная ИБС» встречается в 15-20%, а, в большей степени, она сочетается с артериальной гипертензией (АГ), дислипидемией (ДЛЕ) и/или сахарным диабетом 2 типа (СД2; Khot U.N. et al., 2003; Шальнова С.А. et al., 2016). Исследователями Dzau V. J. и Braunwald E. (1991) предложена концепция «сердечнососудистого континуума» (ССК), согласно которой «цепь событий, приводящая к сердечной недостаточности и летальному исходу, обусловлена сочетанием нескольких сердечно-сосудистых факторов риска и заболеваний (ИБС, АГ, ДЛЕ и СД2)» (Dzau V. J., Braunwald E., 1991; Dzau V.J. et al., 2006). Концепция ССК выдвинута после ряда клинических и эпидемиологических исследований. Автор концепции Dzau V. J. (2006) заключает, что изучение генетических маркеров для оценки риска, ранней диагностики и прогноза ССК, имеет важное значение (Dzau V.J. et al., 2006).
Несмотря на то обстоятельство, что феномен сочетания болезней имеет клиническую доказательную базу, «классические» исследования, изучающие отдельные заболевания, по-прежнему, превалируют (Jansen H. et al., 2015; Au Yeung S.L., Lam H.S., Schooling C.M., 2017; Murphy A. et al., 2018). Имеется существенный пробел в изучении генетической компоненты ССК, поскольку работы, проведенные в данном направлении, единичны и, в некоторой степени, имеют неоднозначные результаты (Wu C. et al., 2012; Gottesman O. et al., 2012; Rankinen T. et al., 2015).
Вариабельность генома человека также представлена и структурными вариациями, которые, наряду с однонуклеотидными полиморфными вариантами (SNP), могут вносить определенный вклад в риск развития заболеваний (Sachidanandam R. et al., 2001; International T. et al., 2003; Sneddon T.P., Church D.M., 2012). Только за последнее десятилетие, возникновение таких технологий, как массовое параллельное секве-нирование и матричная сравнительная геномная гибридизация (array comparative genome hybridization, сокр. aCGH), позволило оценить спектр и характер структурных вариаций у фенотипически здоровых индивидов (Sneddon T.P., Church D.M., 2012). Вариации по числу копий участков ДНК (copy number variation, CNV) представляют собой большую группу структурных вариаций, имеющих широкий диапазон размер-
ности (от одной тысячи пар оснований до одного миллиона), которые затрагивают большое количество генов и/или регуляторных регионов, что, в итоге, может обусловливать целый ряд фенотипических проявлений. Предполагается, что данный вид генетической вариабельности имеет важное значение для формирования предрасположенности многофакторных заболеваний, а также является потенциальным источником «недостающей наследуемости» (Almal S.H., Padh H., 2012).
Таким образом, оценка генетической компоненты заболеваний сердечнососудистого континуума по SNP и CNV-маркерам представляет существенный интерес. Выявление молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе заболеваний ССК, в значительной степени определит разработку новых стратегий профилактики и лечения данных патологий.
Степень разработанности темы исследования:
Существует большое количество генетико-эпидемиологических исследований в отношении заболеваний ССК, однако в данных работах в фокусе внимания исследователей находится анализ ассоциаций SNP с униморбидными состояниями – ИБС, АГ, ДЛЕ или СД2 (Saxena R. et al., 2007; Samani N.J. et al., 2007; Kathiresan S. et al., 2009; Kristiansson K. et al., 2012).
Отмечается значительный пробел в представлении генетической компоненты ССК (Tinoco Mesquita E. et al., 2016). Существует ряд работ в области исследований ко-морбидности некоторых болезней ССК (Пузырев В.П., Макеева О.А., Голубенко М.В., 2006; Wu C. et al., 2012; Gottesman O. et al., 2012; CARDIoGRAMplusC4D Consortium et al., 2013; Jansen H. et al., 2015; Rankinen T. et al., 2015). Тем не менее, эти исследования представляют собой мета-анализ результатов GWAS по унимор-бидным состояниям болезней ССК.
Кроме того, задача по оценке вклада CNV в формирование ИБС, особенно при болезнях ССК, остается нерешенной. В настоящее время, существует небольшой ряд работ, посвященных исследованиям CNV при некоторых заболеваниях ССК в различных популяциях, которые имеют неоднозначные результаты (Sale M.M., Woods J., Freedman B.I., 2006; Kathiresan S. et al., 2009; Gancheva K. et al., 2009; Surti A. et al., 2009; Sha B.Y. et al., 2009; Jeon J.P. et al., 2010; Bochukova E.G. et al., 2010; Shia W.C. et al., 2011; Costelloe S.J. et al., 2012; Zhao W. et al., 2012; Ascencio-Montiel I.D.J. et al., 2017; Aerts E. et al., 2018; Iacocca M.A., Hegele R.A., 2018).
Цель работы:
Изучить генетическую структуру подверженности к униморбидной ишемической болезни сердца (ИБС), ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечнососудистому континууму (сочетание ИБС, артериальной гипертензии, дислипидемии и сахарного диабета 2 типа).
Задачи:
-
Провести сравнительный анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с риском развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума.
-
Оценить прогностическую эффективность SNP-маркеров, ассоциированных с риском развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума.
-
Осуществить полногеномный поиск вариаций числа копий участков ДНК (CNV) у больных с фенотипом «сердечно-сосудистый континуум».
-
Выполнить сравнительный анализ ассоциаций идентифицированных вариаций числа копий участков ДНК с риском развития ИБС в сочетании с артериальной ги-пертензией, и сердечно-сосудистого континуума.
Научная новизна.
Впервые оценена генетическая структура подверженности для униморбидной ишемической болезни сердца, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума. Установлено отличие структуры подверженности данных заболеваний по генетическим маркерам, SNP и CNV.
Выявлены особенности генетической компоненты болезней ССК относительно вовлеченности белковых продуктов генов в такие биологические процессы, как ли-пидный обмен и иммуновоспалительный ответ.
Впервые оценен спектр вариаций числа копий участков ДНК у больных с сердечно-сосудистым континуумом с помощью высокоразрешающих микрочиповых технологий. Впервые выявлена ассоциация CNV-делеции в гене SFMBT1 (3p21.1) с сердечно-сосудистым континуумом (ССК). Установлены две CNV-амплификации, включающие гены ERLIN1 (в локусе 10q24.31), и UNG и ACACB (в локусе 12q24.11) только у больных с ССК и при ИБС в сочетании с АГ, тогда как у здоровых индивидов идентифицируется только уменьшение числа копий данных участков ДНК.
Рассчитана прогностическая эффективность SNP-маркеров в отношении унимор-бидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и сердечно-сосудистого континуума.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты диссертационной работы имеют фундаментальное значение для исследований в области изучения коморбидности. Идентифицированные в результате комплексного анализа SNP и CNV при униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и ССК расширяют имеющиеся представления о концепции коморбидности, а также прогноза их риска развития.
В работе установлены наиболее информативные генетические маркеры для прогноза риска развития ИБС, ИБС в сочетании с АГ, и сердечно-сосудистого континуума, а также оценена их прогностическая эффективность. Выявлены как новые, так и известные SNP-маркеры подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям и
факторам риска. Характеристика выявленных SNP-маркеров по сетям генных онтоло-гий расширяет имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах заболеваний ССК. Установлено, что сердечно-сосудистый континуум, главным образом, характеризуется вовлечением генов липидного обмена, а униморбидная ИБС и ИБС в сочетании с АГ как генов липидного обмена, так и генов иммуновоспалитель-ного ответа. В целом, несмотря на ожидаемую картину выявления генов липидного обмена в данном исследовании, гены, показавшие ассоциацию с униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с АГ, и ССК, между собой не пересекаются, что указывает на особенности генетической конституции при данных патологических состояниях.
Оценен спектр структурной вариабельности, в частности по CNV, размером от 1 тыс.п.о. до 2 млн.п.о., у больных с фенотипом «ССК», которые могут быть использованы для дальнейшего исследования при МФЗ в других популяциях. Установлена статистически значимая ассоциация CNV-делеции в гене SFMBT1 (3p21.1) с риском развития сердечно-сосудистого континуума, а также показано присутствие CNV-амплификации в хромосомных субсегментах 10q24.31 (ERLIN1) и 12q24.11 (UNG и ACACB) только при ИБС в сочетании с АГ и сердечно-сосудистого континуума. Данные CNV-маркеры потенциально могут быть использованы для прогноза риска развития ССК.
Разработан программный пакет на платформе статистической среды R (“aggi”), который позволяет оптимизировать анализ данных микроматричной сравнительной геномной гибридизации. Результаты диссертационного исследования опубликованы в виде учебно-методического пособия и внедрены в педагогический процесс на кафедре медицинской генетики ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Методология и методы исследования.
Теоретическую и методологическую основу работы обеспечили исследования в области изучения многофакторных заболеваний, а также разработки в области изучения однонуклеотидных полиморфных вариантов и вариаций числа копий участков ДНК. Кроме того, за основу были взяты наработки в области изучения концепции ко-морбидности, в том числе сердечно-сосудистого континуума.
В диссертационном исследовании была оценена общность и специфичность генетической структуры предрасположенности униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с АГ, а также сердечно-сосудистого континуума, в целом. Особенностью работы является изучение как SNP, так и CNV-маркеров для проведения анализа ассоциации с заболеваниями ССК.
В диссертационной работе использованы современные молекулярно-генетические методы, такие как: матричная сравнительная геномная гибридизация (array-CGH) для идентификации вариаций по числу копий участков ДНК, гибридизация на биологических микрочипах для определения генотипов по однонуклеотидным полиморфным вариантам, ПЦР в режиме реального времени с помощью технологии TaqMan для верификации выявленных CNV и масс-спектрометрия MALDI-TOF для верификации SNP-маркеров.
Статистические методы и подходы, примененные в данной работе, включали первичный анализ данных на базовом проприоритарном программном обеспечении производителей оборудования и анализ данных с помощью разработанных ранее пакетов прикладных программ (из репозиториев CRAN и Bioconductor) для статистической среды R, а также разработанным пакетом для оптимизации работы с ними.
Положения, выносимые на защиту:
1. Униморбидная ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и сердечно
сосудистый континуум различаются по генетической компоненте подверженности,
оцененной с использованием комплекса SNP-маркеров.
-
Отдельные SNP-маркеры, ассоциированные с риском развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, сердечно-сосудистым континуумом, обладают средней прогностической эффективностью. Для униморбидной ИБС аддитивный эффект SNP-маркеров, ассоциированных с данной патологией, имеет высокую прогностическую эффективность.
-
Делеция фрагмента интрона 2 гена SFMBT1 (3p21.1) ассоциирована с риском развития заболеваний сердечно-сосудистого континуума. Увеличение числа копий участка ДНК гена ERLIN1 (10q24.31) наблюдается при ССК и ИБС в сочетании с артериальной гипертензией; CNV-амплификация, включающая фрагменты генов UNG и ACACB (12q24.11), встречается только у больных с сердечно-сосудистым континуумом.
Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность и обоснованность результатов исследования достигнута благодаря большим объемам выборок (общее количество – 923 образца), клинико-лабораторным исследованиям, проведенным квалифицированными специалистами Кемеровского кардиологического центра (Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний»), а также современными молекулярно-генетическими методами и статистическими подходами анализа данных.
Апробация материалов диссертации.
Основные результаты исследования по теме диссертационной работы представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция, посвященная памяти Ю.Г. Рычкова (г. Москва, 2013); Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии (г. Томск, 2013); Мутагенез и его роль в различных проблемах генетики человека, посвященная памяти Н.П. Бочкова (г. Москва, 2013); Медицинские и социальные проблемы орфанных болезней: диагностика, лечение, профилактика (г. Томск, 2014); VI Съезд ВОГиС (г. Ростов-на-Дону, 2014); International symposium "Human genetics" (г. Новосибирск, 2014); Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины (г. Томск, 2014); The European Human Genetics Conference (г. Милан, Италия, 2014; г. Копенгаген, Дания, 2017); VII съезд Российского общества медицинских генетиков (г. Санкт-Петербург, 2015); The
European Atherosclerosis Society Congress (г. Инсбрук, Австрия, 2016; г. Прага, Чехия, 2017); The 13th International Congress of Human Genetics (г. Киото, Япония, 2016); 10-я Международная мультиконференция по биоинформатике регуляции и структуре геномов и системной биологии (г. Новосибирск, 2016); American Society of Human Genetics 66th Annual Meeting (г. Ванкувер, Канада, 2016); Актуальные проблемы медицинской генетики (г. Томск, 2016); 50 лет ВОГиС: успехи и перспективы (г. Москва, 2016); IХ Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017» (г. Москва, 2017); VIII международный конгресс «Кардиология на перекрестке наук» (г. Тюмень, 2017); Современные подходы и перспективы генетических исследований в Якутии (г. Якутск, 2017); XI научная конференция «Генетика человека и патология», посвящённая 35-летию НИИ Медицинской Генетики (г. Томск, 2017).
Публикации.
Всего по теме диссертации опубликована 31 научная работа, в том числе восемь статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, одно учебно-методическое пособие, две статьи в сборниках, 20 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций.
Личный вклад автора.
Основные результаты диссертационной работы получены автором исследования. Анализ литературных данных по теме диссертации, экспериментальная работа, био-информатическая обработка данных, статистический анализ, описание и обобщение полученных результатов, а также подготовка публикаций по результатам исследования выполнены лично автором.
Структура и объем диссертации.
Ассоциация однонуклеотидных полиморфизмов с болезнями ССК
Учитывая, что заболевания ССК тесно связаны друг с другом с эпидемиологической и патофизиологической точек зрения, можно предположить, что их генетическая составляющая имеет много общего. Для описания генетической компоненты коморбидности, в том числе и ССК, был предложен термин «синтропные гены», которые характеризуют общие гены для данных патологических состояний, пути которых сопряжены в контексте патологических процессов [Пузырев В.П., Макеева О.А., Голубенко М.В., 2006; Пузырёв В.П., Степанов В.А., Макеева О.А., 2009].
Спектр генетических вариантов, предрасполагающих к заболеваниям ССК, варьирует от редких мутаций, с сильным негативным влиянием на фенотип (моногенные формы) до частых полиморфизмов со слабым эффектом, которые одни (олиго-) или, чаще, в комбинации (полигены), модулируют риск развития патологии.
С эпидемиологической точки зрения, редкие и вредные мутации являются важным фактором риска ИБС/инфаркта миокарда у их носителей, однако вклад данных мутаций на уровне популяции очень мал. Например, это мутации в гене LDLR при семейной гиперхолестеринемии [Bouhairie V.E., Goldberg A.C., 2015]. И, наоборот, полиморфизм гена APOE по причине своей высокой частоты имеет большое влияние на уровне популяции, несмотря на слабый индивидуальный эффект [Eichner J.E. et al., 2002].
Завершение проекта по изучению генома человека, появление новых технологий генотипирования и проведение крупномасштабных полногеномных ассоциативных исследований (Genome-Wide Association Study, сокр. GWAS) позволило не только продвинуться в понимании полигенной природы отдельных комплексных фенотипов, но и предоставило возможность для оценки гомогенности генетической архитектуры заболеваний ССК.
В настоящий момент охарактеризованы однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism, сокр. SNP) и гены, ассоциированные с болезнями ССК. Так, например, известно 138 SNP, ассоциированных с риском развития коронарного атеросклероза и ИБС, и около 83 SNP, ассоциированных c риском развития СД2, по данным GWAS исследований [Wang Q., 2005; Pranavchand R., Reddy B.M., 2013; Stankov A., Laakso M., 2016]. Исследования болезней ССК не всегда имеют однозначную трактовку. С одной стороны, описано большое количество генетических вариантов, ассоциированных с ИБС [Yu W. et al., 2008; HuGE Navigator, 2017]. С другой стороны, в некоторых работах отсутствует ясность относительного того, изучалась ли униморбидность или была неописанная коморбидность.
Существуют единичные работы, в которых проводился мета-анализ результатов исследований GWAS с отдельными заболеваниями и факторами риска ССК у индивидов в разных выборках [Пузырев В.П., Фрейдин М.Б., 2009; Wu C. et al., 2012; Gottesman O. et al., 2012; Prasad R.B., Groop L., 2015; Rankinen T. et al., 2015].
Мета-анализ ассоциаций генов с некоторыми болезнями ССК показал ряд общих генов «синтропии» [Пузырёв В.П., Степанов В.А., Макеева О.А., 2009]. Для выявления данных генов использовалась балльная система оценки частоты упоминания гена в статьях, изучающих те или иные компоненты ССК. Однако, во-первых, результаты примененного подхода являются «приближенными», отражающими лишь общую концепцию, в виду того, что использовалась оценка частоты изучаемости гена по отношению к патологии, а не его фактическое отношение к последней. Во-вторых, текст-майнинг проводился в базе данных HuGENet, обладающей рядом недостатков, таких как: включение в базу данных не воспроизведённых результатов исследований, отсутствие системы контроля «публикационного смещения» и селективной отчетности [Ioannidis J.P.A. et al., 2005; Yu W. et al., 2008; Yu W. et al., 2009]. Нужно отметить, что «публикационное смещение» или «эффект выдвижных ящиков» (польск. «efekt potwierdzenia») – это результаты исследования, вступающие в противоречие с ожидаемыми результатами, которые отвергаются как «провал» и никогда не публикуются, являются одной из проблем мета-анализа [Rothstein H.R., Sutton A.J., Borenstein M., 2006].
Gottesman O. и соавторы, проанализировав 107 GWAS, выделили 44 общих гена, как минимум, для трех и более болезней ССК (атеросклероз коронарных артерий, ИБС, ожирение, СД2, АГ, ДЛЕ и хроническая почечная недостаточность (ХПН)) [Gottesman O. et al., 2012]. Четырнадцать генов (APOB, APOC1, BSND, CELSR2, PDGFD, PSRC1, SMARCA4, TRIB1, ZNF259, FAM84B, KLHL29, LDLR, LPL, PCSK9) были общими для ИБС и дислипидемии, а девять генов (ADAMTS9, BCL11A, C6orf223, FTO, MAGI1, VEGFA, COBLL1, DMRTA1, EIF3FP3) – для СД2 и ожирения. Семь генов (APOB, ATG4C, C6orf223, DMRTA1, GCKR, KLHL29, VEGFA) ассоциированы с тремя и более патологическими фенотипами. Гены APOB и KLHL29 обладали наиболее широкой сферой компетенции в отношении ИБС, АГ, дислипидемии и ХПН. Однако регион гена KLHL29 был идентифицирован в результате GWAS в популяциях африканского происхождения. Только три гена (GCKR, C6orf223, VEGFA) были общими для трех и более фенотипов ССК при анализе европейских популяций. Используя программу «Gene Relationships Among Implicated Loci» (GRAIL), общие гены заболеваний ССК были объединены в основные биологические процессы: транспорт и метаболизм липидов (PCSK9, LDLR, LPL, APOB, APOC1) и ростовые факторы (PDGFD и VEGFA).
В работах Rankinen T. и соавт. обозначены 87 регионов генома (181 SNP или 56 генов) продемонстрировавших ассоциацию с двумя и более фенотипами (атеросклерозом коронарных артерий, ИМТ, СД2, АГ, уровнем липидов (ЛПВП, ЛПНП, общий холестерол и триглицериды) и С-реактивного белка в крови) [Rankinen T. et al., 2015]. Одиннадцать регионов генома были общими для ИБС и уровней липидов в крови, в том числе они содержали гены APOB, APOE-APOC1, LPL, TRIB1 и кластер ZNF259-APOA5-APOA1. Для ИБС и других факторов риска (ИМТ, СД2, АГ) обнаружено восемь общих регионов генома. Они содержали гены IL6R, SH2B3, FURIN-FES и GUCY1A3. Кластер APOE-APOC1 показал ассоциацию с несколькими фенотипами ИБС, ИМТ, уровней липидов и С-реактивного белка в крови. При функциональной аннотации белковых продуктов плейотропных генов выявлена преимущественная их вовлеченность в сигнальный путь ядерных рецепторов, контролирующих гомеостаз холестерина (liver X receptor (LXR)/retinoid X receptor (RXR) and farnesoid X receptor/RXR nuclear receptor signaling). Гены, связанные с ИБС и стеатозом печени, составляют основу плейотропных ассоциаций с рассматриваемыми в данном исследовании фенотипами. Анализ потенциальных функциональных взаимодействий показывает, что некоторые плейотропные локусы связаны с различными сочетаниями признаков напрямую (APOA1 с ИБС, ЛПВП и триглицериды) или опосредовано через другие гены (TCF7L2 и VEGFA через CREBBP). Исследование белок-белковых взаимодействий позволило выявить сеть из 18 тесно взаимодействующих друг с другом плейотропных генов. Большинство идентифицированных SNP были локализованы в регуляторных регионах генома (энхансеры и сайты, гиперчувствительные к действию ДНКазы). Результаты исследований Gottesman O. et al. (2012) и Rankinen T. et al. (2015) согласуются в отношении 12 плейотропных генов: APOB, APOC1, CDKN2BAS, LDLR, LPL, PCSK9, SH2B3, TRIB1, FTO, GCKR, IRS1, и ZNF259.
Менее масштабный мета-анализ отдельных GWAS атеросклероза коронарных артерий, СД2 и ожирения был проведен Wu С. и соавторами [Wu C. et al., 2012]. В данной работе для анализа генетической плейотропии заболеваний ССК был использован статистический подход GSMA (genome search meta-analysis), который позволяет комбинировать исследования полногеномного анализа сцепления. В результате авторы обнаружили, что регионы 9p21.1-q21.32 (CDKN2A/CDKN2B, CDKN2BAS) и 6q23.2-q25.3 (ENPP1) потенциально являются общими для ИБС, СД2 и ожирения, а 16q12.2-q23.1 (FTO) и 4q24-q28.3 (FABP2) для СД2 и ожирения [Wu C. et al., 2012].
Использование высокопроизводительных микроматричных технологий для анализа 50000 SNP, входящих в состав 2000 генов-кандидатов ССЗ и их факторов риска, не только подтвердило некоторые результаты GWAS, но и выявило ассоциацию целого ряда новых генов с заболеваниями ССК. Например, гены ABCG5/ABCG8, COL4A1/COL4A2, CYP17A1, IL5, LIPA, TRIB1 и Z3HC1 связаны с риском атеросклеротического поражения коронарных артерий [The IBC 50K CAD Consortium, 2011], гены AGT, ATP2B1, HFE, MTHFR-NPPB, NOS3, NPR3, LSP1/TNNT3 и SOX6 – с уровнем артериального давления [Johnson T. et al., 2011; Ganesh S.K. et al., 2013], гены DGAT2, GPIHBP1, HCAR2, PPARG и FTO – с ЛПВП; APOH, BRCA2, SOCS3, SPTY2D1, и VLDLR – с ЛПНП; BRCA2, CHUK, SOCS3, FCGR2A, UGT1A1, UBE3B, и INSIG2 – с общим холестеролом; а также C4B, GCK, GATA4, INSR, LPAL2 и SERPINF2 – с триглицеридами [Asselbergs F.W. et al., 2012], а гены SREBF1, GATAD2A/CILP2/PBX4 и TH/INS – с СД2 [Saxena R. et al., 2012]. Неудивительно, что генетическая архитектура таких эндофенотипов, как ЛПВП, ЛПНП, общий холестерол и триглицериды имеет между собой много общего. Шесть генов APOA1, APOB, APOE, CETP, FADS1-2-3 и TRIB1 ассоциированы со всеми четырьмя признаками, хотя не всегда это были одни и те же SNP [Asselbergs F.W., Lovering R.C., Drenos F., 2013].
Детекция вариаций числа копий участков ДНК с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации (array-CGH)
Принцип array-CGH основан на антагонистической гибридизации эквимолярных меченых фрагментов образцов ДНК, тестируемой и контрольной, на «подложку» с зафиксированными олигонуклеотидами («спотами» или гибридизационная точка/капля с одинаковыми последовательностями олигонуклеотидных CGH-зондов). Технология array-CGH реализована на анализе микрочипов по двум цветовым каналам, то есть тестируемая и контрольная ДНК «метится» двумя разными флюоресцирующими метками. При эквимолярном соотношении фрагментов тестируемой и контрольной ДНК, комплементарных одному «споту», уровень флюоресценции является равным. При избытке или недостатке одного из фрагментов, уровень флюоресценции отклоняется в преобладающую сторону. Каждый «спот» представляет собой олигонуклеотиды, специфически комплементарные к одному локусу в геноме. Отдельно стоит отметить, что микрочип SurePrint G3 CGH Microarray (Agilent Technologies, США) содержит 60-мерные олигонуклеотиды, расположенные в гексагональном порядке, что дает высокую плотность «зондов» на квадратный миллиметр. Количество «зондов» может достигать до одного млн., вместимых в стандартные размеры предметного стекла. Таким образом, array-CGH с помощью микрочипа SurePrint G3 CGH Microarray (Agilent Technologies, США) обладает высокой разрешающей способностью. Например, для использованного в настоящей работе микрочипа SurePrint G3 Human CGH+SNP Microarray 2x400 K (G4842A, Agilent Technologies, США) медиана расстояния между двумя пробами составляет 2,1 тыс. п.о. для генома (1,8 тыс.п.о. для генов).
Технология array-CGH сопряжена с рядом особенностей. Во-первых, на всех этапах минимизируется количество циклов замораживания-размораживания. Во-вторых, не допускается взбалтывание реакционной смеси, содержащей образец ДНК, а только перемешивание путём переворачивания микропробирки в руках или пипетирования. В-третьих, минимизируется попадание лучей света в смеси, содержащие флюоресцирующие метки. В-четвертых, для супрессии 7 высокоповторяющихся фрагментов генома используется Cot-1 ДНК.
Проведение array-CGH можно разделить на следующие этапы: пробоподготовка образцов ДНК (рестрикция ДНК), «мечение», очистка и гибридизация. Схематически данный алгоритм представлен на рисунке 2.3.
Пробоподготовка заключалась в подготовке образцов ДНК в количестве не меньше 0,5 мкг, но не более 1,5 мкг, и объемом до 20,2 мкл. В качестве референсного (контрольного) генома использована Agilent Human Reference DNA Male (p/n 5190-4240, Agilent Technologies, США), в концентрации 200 нг/мкл ДНК.
Рестрикция геномной ДНК ферментами AluI (Promega, США) и RsaI (Promega, США) выполнялась с помощью SureTag Complete DNA Labeling Kit (Agilent Technologies, США), согласно протоколу производителя. Состав реакционной смеси представлен в таблице 2.6. Программа рестрикции геномной ДНК включала два шага: первый – инкубация 2 часа при 37С, второй - 20 минут при 65С.
Оценка качества рестрикции геномной ДНК производилась на 0,8% агарозном геле. Для проведения электрофореза использовалось 2 мкл полученного «рестриктата» и 2 мкл SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Life Technologies, США). Электрофорез выполнялся с молекулярным маркером pUC19/MspI (СибЭнзим, Новосибирск). Оценка качества рестрикции геномной ДНК заключается в том, чтобы большая часть рестрикцированных продуктов геномной ДНК должна быть между 200 и 500 п.о..
Процесс «мечения» рестрикционных фрагментов происходил со «случайными» праймерами. К 24 мкл «рестриктата» добавляется 5 мкл «случайных» праймеров, которые входят в набор «SureTag Complete DNA Labeling Kit» (Agilent Technologies, США). Денатурация фрагментов рестрикции происходила при 95С в течении 3 минут и потом резком охлаждении до 4С не меньше, чем на 5 минут. После чего к продуктам рестрикции добавлена реакционная смесь для «мечения» (табл. 2.7), где тестовая ДНК «метилась» – Cyanine 5-dUTP (Cy5), а контрольная ДНК – Cyanine 3-dUTP (Cy3). Программа «мечения» проходит по той же программе, что и этап рестрикции, за исключением второго шага, где продолжительность составляет 10 минут.
После этапов «мечения» выполняется очистка готовых продуктов с помощью Agilent Purification Columns (Agilent Technologies, США). Протокол заключается в следующем:
1) Смешать продукт рестрикции или «мечения» с 430 мкл ТЕ-буфера (10мМ Tris HCl, pH8.0 и 1мМ ЭДТА) (Sigma Aldrich).
2) Перенести на Agilent Purification Columns и центрифугировать при 14000g в течение 10 минут при комнатной температуре.
3) Добавить в Agilent Purification Columns 480 мкл ТЕ-буфера и повторить шаг 2.
4) Перевернуть Agilent Purification Columns и поместить в новую 1,5 мкл микропробирку и центрифугировать при 1000 g в течение 1 минуты.
5) Концентрировать в вакуумном концентраторе (Eppendorf Vacufuge Plus) около 20 минут при температуре 40С в режиме «V-AQ» до полного высыхания.
6) Добавить 24 мкл ТЕ-буфера.
Оценка специфичного мечения выполняется на приборе NanoDrop 1000 (ThermoFisher) в программе NanoDrop 1000 в опции главного меню MicroArray Measurment с опцией DNA-50. По длинам волн A260нм оценивается количество ДНК, A550нм – Cy3 и A650нм – Cy5 (рис. 2.4).
Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом сердечнососудистый континуум
В совокупности, при проведении анализа ассоциации выявлено 14 полиморфных вариантов, связанных с фенотипом ССК (табл. 3.3). Все SNP-маркеры показали высокую статистическую значимость различий при сравнительном анализе частот и генотипов между анализируемыми выборками (pexact 0,032 и pperm 0,023, соответственно). Локализация идентифицированных SNP-маркеров разнообразна. Так, три варианта представлены миссенс-заменами, где rs1726866 и rs10246939 расположены в гене TAS2R38, а rs66048 – в гене SEZ6L; три – являются синонимичными заменами: rs2291439 в гене RAD54B, rs1143674 в гене ITGA4 и rs688 в гене LDLR; три – локализованы в области 5 -UTR генов APOA2 (rs5082), KLF7 (rs7568369) и CETP (rs183130); два варианта в интронных областях генов LDLR (rs2738446) и MTAP (rs7023329) и три SNP-маркера локализованы в межгенных промежутках: rs1333048 и rs1333049 в области 9p21.3 вблизи 3 -UTR гена CDKN2B-AS1, и rs6501455, расположенный 8 между генами SOX9 и KCNJ2 [Макеева О.А. и др., 2015].
Вариант rs183130 расположен в 5 -UTR гена CETP. Проведение анализа ассоциации показало, что аллель дикого типа G является рисковым для фенотипа ССК (pperm = 0, 013; OR = 2,19 (1,13-4,32)). Как известно, продукт гена CETP является белком-транспортером нерастворимых эфиров холестерина. Мутации в гене CETP приводят к гиперальфалипопротеинемии 1, сопровождающейся высоким уровнем холестерина ЛПВП (ХС-ЛПВП) в крови (OMIM:143470). Тем не менее, согласно предыдущим исследованиям, аллель дикого типа C rs183130 ассоциирован с риском низкого уровня ХС-ЛПВП в крови индивидов [Spirin V. et al., 2007].
Два варианта rs2738446 и rs688, расположенные в интроне 11 и экзоне 12 гена LDLR, находятся в неравновесии по сцеплению. Анализ ассоциации показал, что носителями аллелей дикого типа C rs2738446 и G rs688 являются преимущественно здоровые индивиды по отношению к фенотипу ССК (pperm = 0,0045; OR = 0,38 (0,18-0,77)). Согласно Фрамингеймскому исследованию, rs688G A (минорный аллель) показал ассоциацию с риском развития ИБС и с увеличением уровней общего холестерина и ХС-ЛПНП в крови индивидов [Zhu H. et al., 2007]. Известно, что белковый продукт гена LDLR выполняет роль посредника эндоцитоза ЛПНП, богатых холестерином [Francke U., Brown M.S., Goldstein J.L., 1984]. Zhu H. и соавт. предполагают, что rs688G A является нейтрализующим экзонным энхансером сплайсинга [Zhu H. et al., 2007]. Исследование образцов печени in vivo показало, что минорный аллель rs688 связан со значительным снижением эффективности сплайсинга LDLR. С другой стороны, существуют сообщения, что минорный аллель А rs688, вероятно, связан с ИБС посредством модуляции активности фактора свертывания VIII [Martinelli N. et al., 2010].
Вариант rs5082 локализуется в области 5 -UTR гена APOA2. Продукт данного гена кодирует аполипопротеин А2 – белковую частицу ЛПВП. Анализ ассоциации выявил, что гомозиготные носители аллеля А в 2,42 раза чаще 0 подвержены риску формирования фенотипа ССК (pperm = 0,007; OR = 2,42 (1,22-4,82)). В настоящий момент механизм связи полиморфизма гена APOA2 с факторами риска и ССЗ остается неясным. С одной стороны, показано, что генотип GG rs5082 повышает риск развития ожирения [Corella D. et al., 2007], а с другой – является протективным по отношению к ИБС [Xiao J. et al., 2008]. Также было обнаружено, что существует связь между rs5082 и СД 2 типа [Noorshahi N. et al., 2016]. Однако, ранее проведенный мета-анализ вариантов в гене APOA2 (включая rs5082) на предмет ассоциации с СД 2 типа установил, что какая-либо связь с данным фенотипом отсутствует [Duesing K. et al., 2009].
Полиморфный вариант rs5082 располагается в D элементе промоторной области гена APOA2, который связывает несколько ядерных факторов и участвует в регуляции транскрипции данного гена [Cardot P. et al., 1994; van t Hooft F.M. et al., 2001]. В связи чем, предполагается, что аллель G ухудшает связывание ядерных факторов с данным участком и тем самым снижает экспрессию гена APOA2 [van t Hooft F.M. et al., 2001]. На модельных животных показано, что избыточная экспрессия гена APOA2 повышает продукцию функционально измененных ЛПВП и способствует большему распространению области атеросклеротического поражения артерий [Castellani L.W. et al., 1997; Hedrick C.C. et al., 2001]. Кроме того, клинические исследования выявили, что фракция ЛПВП, содержащая только apoAI, была значительно меньше, чем ЛПВП, содержащая и apoAI, и apoAII, у пациентов с ИБС. Тем самым предполагается, что фракция ЛПВП, содержащая только apoAI, имеет антиатерогенные свойства [Puchois P. et al., 1987; Parra H.J. et al., 1992]. Однако в настоящем исследовании оценка пропорций фракций подклассов ЛПВП не проводилась. Ранее предполагалось, что носители аллеля G имеют низкий риск постпрандиальной гипертриглицеридемии [Delgado-Lista J. et al., 2007]. Однако позднее ассоциация данного аллеля с уровнями липопротеидов не была обнаружена, и, по всей видимости, протективный эффект аллеля G обусловлен не только изменением уровня липопротеидов [Xiao J. et al., 2008]. Впервые установлено, что аллель А увеличивает риск развития фенотипа ССК, но не с фенотипами «униморбидная 1 ИБС» и «коморбидная ИБС с АГ».
Исходя из вышеописанного, гены CETP, LDLR и APOA2 имеют отношение к липидному обмену. В то же время, гены, относящие к иммунному ответу и воспалению, также были ассоциированы с фенотипом ССК. Среди них можно выделить такие гены как ITGA4, MTAP и CDKN2В. Так, вариант rs1143674 локализован в экзоне 17 гена ITGA4 и представляет собой синонимичную замену. Локализация данного варианта имеет важное значение, так как он расположен непосредственно в 3 -сайте сплайсинга экзона. Анализ ассоциации показал, что гомозиготные носители аллеля А rs1143674 подвержены риску развития фенотипа ССК (pperm = 0,0069; OR = 2,84 (1,27-6,47)). Ранее проведенные исследования rs1143674 связывают его с аутизмом и ревматоидным артритом [Conroy J. et al., 2009; Burkhardt J. et al., 2014]. Белковый продукт гена ITGA4 - интегрин альфа-4 является рецептором клеточной поверхности на активированных лимфоцитах и моноцитах, которые связывают лиганд VCAM1 с эндотелиальными клетками [Burkhardt J. et al., 2014]. Как известно, повышенная адгезия имеет важное значение в дисфункции эндотелия при воспалении, атеросклерозе и других патологических процессах [Brachtl G. et al., 2011; Vassiliadis E. et al., 2012]. Однако молекулярный механизм связи rs1143674 с данными фенотипами в настоящее время неизвестен [Heymann G.A., Kiesewetter H., Salama A., 2003].
Вариант rs7023329 локализован во интроне 2 гена MTAP. Анализ ассоциации показал, что гомозиготные носители аллеля дикого типа А подвержены риску развития фенотипа ССК (pperm = 0,0079; OR = 2,38 (1,2-4,76)). Ранее было установлено, что rs7023329 ассоциирован с риском развития меланомы кожи [Yang X.R. et al., 2010]. Как известно, регион 9p21.3, в котором содержатся гены MTAP, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2B-AS1 (ANRIL), ассоциирован с различными онкологическими заболеваниями [Pasmant E. et al., 2011; Gu F. et al., 2013]. Стоит отметить, что в области 3 -конца гена CDKN2B-AS1 (ANRIL) расположены полиморфные варианты rs1333048 и rs1333049, которые также показали ассоциацию с фенотипом ССК, где гомозиготные носители минорного аллеля А и С, соответственно, имели низкий риск развития данного фенотипа (pperm = 0,018; OR = 0,37 (0,15-0,87) и (pperm = 0,022; OR = 0,39 (0,16-0,88)). При этом rs1333048 и rs1333049 находятся в состоянии неравновесия по сцеплению (R2 = 0,98) [Guo J. et al., 2011]. Действительно, регион 9p21.3 демонстрирует ассоциацию не только с онкологическими заболеваниями, но и сердечно-сосудистой патологией [Burton P.R. et al., 2007; Helgadottir A. et al., 2007; McPherson R. et al., 2007; Samani N.J. et al., 2007; Lanktree M., Oh J., Hegele R.A., 2008; Schaefer A.S. et al., 2009].
Полученные результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов в регионе 9p21.3 с фенотипом ССК согласуются с литературными данными, где, главным образом, ассоциация проводится относительно ИБС. Анализ неравновесия по сцеплению полиморфизма в регионе 9p21.3 в предыдущих работах показал, что рекомбинантной 3 -«горячей» точкой является rs1333049 [Schaefer A.S. et al., 2009]. При этом, полиморфные варианты, расположенные вблизи rs1333049, ранее демонстрировали ассоциацию преимущественно с СД2 типа [Zeggini E. et al., 2007; Scott L.J. et al., 2007; Saxena R. et al., 2007]. В настоящее время, существуют работы по ассоциации полиморфизма локуса 9p21.3 как с ИБС, так и с СД 2 типа [Dauriz M., Meigs J.B., 2014; Helgeland . et al., 2015], что подчеркивает сложность формирования генетической компоненты фенотипа ССК. Данное утверждение, подтверждается недавними исследованиями, где лишь аддитивный эффект аллелей в данном регионе одновременно повышает риск развития как ИБС, так и СД2 типа [Rivera N. V et al., 2013; Helgeland . et al., 2015].
Идентификация CNV у больных с фенотипом «ССК»
Выявленные CNV можно подразделить на 3 типа: частые, наблюдаемые у шести и более пациентов; средние по частоте – у от трех до пяти пациентов и редкие – у одного или двух пациентов. Кроме того, среди частых CNV отдельно можно выделить подгруппу вариаций, стабильно регистрируемых у всех пациентов – «стабильные» CNV. Среди группы редких CNV можно выделить группу уникальных CNV. Данная подгруппа выделена отдельно, так как она включает редкие и часто уникальные CNV, в данном случае, встречаемые только у данного индивида.
Подгруппа «стабильных» CNV (n = 11), главным образом, представлена CNV-амплификациями – 8 (11%). Размеры данных CNV варьируют от 7,1 тыс.п.о. до 0,87 млн.п.о. (в среднем 253 тыс.п.о.). Из них девять CNV включают гены.
Наиболее крупные CNV ( 0,5 млн.п.о.), расположенные в хромосомных субсегментах 2p11.2, 8p23.1 и 14q32.33, содержат как большое число кластерных генов, так и незначительное число генов. Так CNV-делеция, расположенная в хромосомном субсегменте 2p11.2 (arr[GRCh37] 2p11.2(87364070_87940883)1), включает два гена (LINC00152, MIR4435-1). Согласно ранее проведенному комплексному анализу последовательности генома человека, ген LINC00152 имеет паралог аннотированный как MIR4435-2HG, а также несколько других гомологичных последовательностей, представленных сплайс-вариантами обоих генов (NR_024204, NR_024205 и NR_024206) [Ntzold L. et al., 2017]. Кроме того, было показано, что экспрессия длинной некодирующей РНК LINC00152 имеет важное значение для прогрессирования клеточного цикла в клетках HeLa [Ntzold L. et al., 2017].
Также в хромосомном субсегменте 2p11.2 располагается CNV амплификация (arr[GRCh37] 2p11.2(89163862_89319919)3) размером 156 тыс.п.о., которая включает каппа-локус легкой цепи иммуноглобулинов (IGK), т.е. группу кластерных генов IGKV. Кроме того, данная CNV-амплификация, занимающая 148 тыс.п.о. (arr[GRCh37] 2p11.2(89160739_89309519), совпадает с позицией гена LOC101928457 или XR_245045.1-локусом. Данная последовательность нкРНК была предсказана автоматически, согласно базе данных RefSeq. Не исключается, что произошла дупликация именно локуса XR_245045.1. Кроме того, данная CNV потенциально имеет важное значение в отношении иммунного ответа, тем не менее, ее роль в настоящее время неясна. По данным базы DGV, в области занимаемой этой CNV-амплификацией, ранее не было выявлено CNV.
Гены, расположенные в области CNV-делеции 8p23.1 (arr[GRCh37] 8p23.1(7239491_8079920)3), представлены преимущественно -дефензинами. Дефензины относится к белкам из класса «иммунного ответа», в связи с чем они имеют важное значение в развитии многих заболеваний. Ранее было показало, что дефензины активно экспрессируются преимущественно в интиме сосудистой стенки, и немного в медии, как в неизмененной артерии, так и в атеросклеротической бляшке [Barnathan E.S. et al., 1997]. Тем не менее, в результате относительно низкой плотности CGH-проб оценка CNV представляет собой отдельную сложность в интерпретации результатов, также это относится и к другой CNV-амплификации, расположенной в хромосомном субсегменте 14q32.33 (arr[GRCh37] 14q32.33(106334907_107214893)3). В данной CNV 107 амплификации расположены гены ADAM6, KIAA0125, LINC00226 и LINC00221.
Несмотря на то, что ADAM6 относится к классу псевдогенов, ранее на модельных животных (кролики), имеющих артериальную гипертензию и гиперхолестеринемию, было показано, что белок ADAM6, относящийся к классу металлопептидаз, имел низкую экспрессию в среднемозговой артерии [Ong W.Y. et al., 2013]. Кроме того, в области данной CNV включающей, главным образом, ген LINC00226, выявлено дифференциальное метилирование ДНК у детей женщин с артериальной гипертензией по сравнению с контрольной выборкой [Julian C.G. et al., 2015].
Отдельного внимания заслуживает CNV, расположенная в хромосомном субсегменте 3q26.1 (arr[GRCh37] 1p36.21(15788935_15808532)3), которая представлена амплификацией более чем на 4 порядка (log ratio 4) по сравнению с референсным геномом, и занимает 104,6 тыс.п.о. Стоит отметить, что данная CNV ранее наблюдалась в других популяциях в виде как CNV-делеции, так и CNV-амплификации. Однако чаще всего это были уникальные случаи [Kim J.Y.J. et al., 2009; Mokhtar S.S. et al., 2014]. Тем не менее, варианты данного CNV-0 полиморфизма, где стартовая «горячая» точка имеет относительно стабильную позицию в пределах 10 тыс.п.о., а «конечная» точка отличается вариабельностью своего положения, встречаются со средней частотой [Coe B.P. et al., 2014]. Данная CNV, также, как и CNV-амплификация в хромосомном субсегменте 7p14.1 (arr[GRCh37] 7p14.1(41280084_41307619)3), не включала гены.
На хромосоме семь в области субсегмента 7p15.2 также идентифицирована «стабильная» CNV-амплификация (arr[GRCh37] 7p15.2(26893878_26930209)3), размером 36 тыс.п.о., которая включает ген SKAP2. Количество проведенных исследований гена SKAP2 в настоящее время незначительно. Известно, что белковый продукт гена SKAP2 отнесён к семейству Src-киназ. Существуют предположения, что белковый продукт Skap2 необходим для хемотаксиса, миграции макрофагов и реорганизации актина [Alenghat F.J. et al., 2012]. Также было показано, что крупная по размеру CNV-амплификация, включающая ген SKAP2, выявлялась в биоптатах аденокарциномы протоков поджелудочной железы [Harada T. et al., 2008]. Таким образом, выдвинута гипотеза, что SKAP2 может быть отнесен к группе ген-кандидатов играющих важное значение в прогрессировании злокачественных новообразований [Shimamura S., Sasakis K., Tanaka M., 2013].
Гены MRGPRX1 и TUSC3, включенные в CNV-амплификации, расположенные в хромосомных субсегментах 11p15.1 (arr[GRCh37] 11p15.1(18955543_18963642)3) и 8p22 (arr[GRCh37] 8p22(15403439_15410655)3, соответственно, имеют важное значение в онкопатологии. Так, белковый продукт гена MRGPRX1 относится к семейству GPCR-рецепторов, связанных с онкогеном MAS1. С одной стороны, ген MRGPRX1 является геном-кандидатом для ингибирования ноцицепции [Li Z. et al., 2017], с другой, варианты данного гена ассоциированы с различными типами рака, преимущественно с раком толстого кишечника [Stransky N. et al., 2011; Cancer Genome Atlas Network D.M. et al., 2012]. В настоящее время, о потенциальных последствиях мутаций генов GPCR-рецепторов известно мало, оставляя широкую область для дальнейших исследований [O Hayre M. et al., 2013]. Другой ген, TUSC3, является опухолевым супрессором и высоко экспрессируется во многих тканях [MacGrogan D. et al., 1996; Zhou H., Clapham D.E., 2009]. Данный ген обладает плейотропным эффектом. Так было замечено, что мутации в гене приводят к несиндромальной аутосомно-рецессивной умственной отсталости [Garshasbi M. et al., 2008]. С другой стороны, мутации и пониженная экспрессия гена TUSC3 ассоциированы со злокачественными новообразованиями [Horak P. et al., 2015; Kratochvlov K. et al., 2015]. Тем не менее, различные CNV с вовлечением гена TUSC3 ранее обнаруживались у здоровых лиц [Redon R. et al., 2006; Wang K. et al., 2007].
В хромосомных субсегментах 6p11.2 и 9p24.1 идентифицированы «стабильные» CNV (arr[GRCh37] 6p11.2(57360339_57475441)3 и arr[GRCh37] 9p24.1(5304850_5335579)1, соответственно) включающие гены RLN1 и PRIM2, соответственно. Согласно базе данных DGV в области занимаемых данными CNV присутствует большое число ранее идентифицированных CNV. Не исключено, что выявленные в работе CNV являются отдельными более мелкими CNV. Известно, что гормон релаксин, белковый продукт гена RLN1, имеет важное значение во время родовой деятельности [Hudson P. et al., 1983]. Тем не менее, недавние исследования показали, что различные мутации в данном гене могут быть вовлечены в онкопатологии [Tevz G. et al., 2016]. Также в связи с онкопатологиями был замечен ген PRIM2 [Yatsula B. et al., 2006]. Кроме того, ранее показано, что полиморфные варианты гена PRIM2 ассоциированы с ожирением [Kaewsutthi S. et al., 2016].