Структурная и эпигенетическая вариабельность генома человека при атеросклеротическом поражении коронарных и сонных артерий Назаренко Мария Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 24

1.1 Генетика многофакторных заболеваний человека в контексте проблемы «недостающей наследуемости»

1.2 Современные представления о молекулярно-генетических механизмах атеросклероза

1.3 Структурная вариабельность генома при атеросклеротическом поражении артерий

1.4 Эпигенетические модификации генома при атеросклеротическом поражении артерий

1.5 Резюме 74

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

2.1. Дизайн исследования 81

2.2. Формирование и характеристика выборок, сбор коллекции биологического материала

2.3 Анализ микроструктурных перестроек хромосом на микрочипах и биоинформационная обработка данных .

2.4 Анализ уровня метилирования ДНК на микрочипах и 86 биоинформационная обработка данных .

2.5 Анализ уровня транскрипции на микрочипах и 88 биоинформационная обработка данных .

2.6. Количественная ПЦР в режиме реального времени 89

2.7. Бисульфитное пиросеквенирование 90

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 94

3.1 Идентификация и характеристика вариабельности числа копий участков ДНК при атеросклерозе

3.2 Характеристика профиля метилирования ДНК в лейкоцитах и клетках сосудов у больных атеросклерозом .

3.3 Анализ дифференциально метилированных генов, потенциально связанных с атеросклерозом

3.4 Оценка профиля экспрессии генов в клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных .

3.5 Интегральный анализ вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК с экспрессией генов при атеросклерозе .

Заключение 181

Выводы 189

Список литературы

• Структурная вариабельность генома при атеросклеротическом поражении артерий
• Эпигенетические модификации генома при атеросклеротическом поражении артерий
• Анализ микроструктурных перестроек хромосом на микрочипах и биоинформационная обработка данных
• Анализ дифференциально метилированных генов, потенциально связанных с атеросклерозом

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Определение вклада наследственной компоненты в этиологию многофакторных заболеваний (МФЗ) является одним из актуальных направлений современных исследований в области медицинской генетики (Пузырев В.П. и др., 2014; Khera A.V., Kathiresan S., 2017). В настоящее время достигнуты определенные успехи в идентификации локусов сложнонаследуемых признаков и болезней человека. Огромные массивы данных, накопленные в последние годы, и, в частности, благодаря широкогеномным исследованиям ассоциаций (Genome-Wide Association Studies – GWAS), выявили тысячи генетических вариантов, которые связаны с сотнями фенотипов (Welter D. et al., 2014). В то же время, однонуклеотид-ный полиморфизм (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) объясняет малую долю наследуемости большинства МФЗ (не более 10%), формируя так называемую проблему «недостающей наследуемости» (Manolio T.A. et al., 2009; Eichler E.E. et al., 2010).

В последнее десятилетие наблюдается сдвиг парадигмы в исследовании МФЗ от оценки отдельных генов-кандидатов к анализу вариабельности на уровне генома, эпигенома и транскриптома с помощью высокоразрешающих технологий, таких как микрочипы и массовое параллельное секвенирование, с последующей биоинформационной обработкой полученного массива муль-тиомных данных (Cui H. et al., 2015). Использование данных технологий позволяет получить «непредвзятый» портрет молекулярных событий, происходящих в различных тканях и органах не только между индивидами в популяции, но и на уровне отдельного организма. Предполагается, что в результате будут идентифицированы новые механизмы формирования подверженности МФЗ, а также оценена функциональная значимость ранее обнаруженной связи генетических вариантов с отдельными эндофенотипами или комплексным фенотипом заболевания.

По своей природе варианты предрасположенности МФЗ могут быть представлены не только SNP, но и, как показывают недавние исследования, структурным полиморфизмом в виде вариаций числа копий участков ДНК (Copy Number Variation – CNV), а также эпигенетической изменчивостью, которая включает метилирование ДНК (Girirajan S. et al., 2011). Патогенез МФЗ представляет собой комплексный и многостадийный процесс, который включает сложные взаимодействия на молекулярном и клеточном уровнях, реализуемые в тесной связи с факторами среды. Возможно, что одни частые генетические варианты, которые обычно выявляются с использованием анализа ассоциаций, играют важную роль на ранних стадиях формирования предрасположенности МФЗ, а другие, в частности структурные и эпигенетические варианты, «канализируют» заболевание, определяя его специфичность, в том числе орган-мишень поражения. Неслучайно, многие МФЗ тесно связаны друг с другом общи-3

ми факторами риска и генетическим полиморфизмом, но также одновременно имеют в своей генетической архитектуре предрасположенности специфические варианты. Несмотря на то, что роль вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК в патогенезе МФЗ представляется весьма заметной, исследований, в которых оценивается степень сходства и различий данных молекулярных профилей в тканях, а также их связь с патогенетически значимыми признаками заболеваний, относительно немного.

Как правило, при проведении анализа ассоциаций генетических вариантов с МФЗ в качестве источника биологического материала используются лейкоциты периферической крови, взятые у индивида в определенный момент времени. Эти клетки могут содержать генетические варианты, не только унаследованные от предыдущих поколений, но и приобретенные человеком в течение жизни. В связи с этим, предполагается, что ненаследуемые изменения генома не только лейкоцитов, но и других соматических клеток играют важную роль в патогенезе МФЗ (Forsberg L.A. et al., 2012; Jacobs K.B. et al., 2012; Laurie С.С. et al., 2012; O’Huallachain M. et al., 2012; Zilina O. et al., 2015; Yadav V.K. et al., 2016; Forsberg L.A. et al., 2017). Действительно, современные высокоразрешающие методы широкогеномного исследования с использованием микрочипов обнаружили существование межтканевой генетической и эпигенетической гетерогенности (O’Huallachain M. et al., 2012; Gottlieb B. et al., 2014). Однако такие работы единичны. Неясным остается уровень, спектр и функциональные последствия вариабельности генома соматических клеток непосредственно в органах-мишенях МФЗ, где собственно и развиваются патологические изменения. В связи с этим, актуальным представляется комплексное изучение вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК соматических клеток для выяснения ее роли в формировании регионарной подверженности МФЗ.

Атеросклеротическая бляшка, которая является патоморфологическим субстратом развития таких сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), как ишемическая болезнь сердца (инфаркт миокарда) и хроническое нарушение мозгового кровообращения (ишемический инсульт), представляет собой объект для исследования и понимания проблемы «недостающей наследуемости» через анализ вариабельности генома соматических клеток. В связи с высокой медико-социальной значимостью данных заболеваний, изучение молекулярных механизмов развития и прогрессии атеросклеротического поражения артерий остается в фокусе внимания научного сообщества. С практической точки зрения, особенно ценным является использование полученных данных для прогнозирования развития и течения заболевания, его диагностики, а также поиска новых молекулярных мишеней для его лечения.

Патогенез атеросклеротического поражения артерий представляет собой многофакторный процесс, существенный вклад в развитие которого вносит генетическая компонента (Дзизинский А.А., Пузырев В.П., 1977). Подход

исследований ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма отдельных генов-кандидатов и широкогеномных исследований ассоциаций (GWAS) выявляет генетическую детерминированность факторов риска атеросклероза и, следовательно, ранних этапов атерогенеза, но не проясняет всего спектра молекулярных механизмов патологических изменений, происходящих в стенке артерий, особенно на поздних стадиях при развитии сосудистых осложнений. Несмотря на активное проведение исследований в области генетики атеросклероза и его осложнений, список генов, изменчивость которых может быть фактором риска развития и прогрессии данных заболеваний, относительно небольшой (Bjorkegren J.L. et al., 2015; Khera A.V., Kathiresan S., 2017). Одна из причин такого состояния дел в исследуемой предметной области может быть связана с вниманием к исключительно наследуемым полиморфным вариантам генов, тогда как вне поля зрения остаются вполне ожидаемые изменения структуры и функциональной активности генов в соматических клетках ходе онтогенеза или, по крайней мере, на этапах, предшествующих развитию заболевания (Пузырев В.П. и др., 2014). Не исключено, что накопленный груз и спектр мутаций может различаться в лейкоцитах и клетках артерий, внося вклад в подверженность и особенности течения атеросклероза и его клинических проявлений. На данный момент времени, в клетках ате-росклеротически измененных артерий не выявлено специфичных и частых изменений структуры и метилирования ДНК, которые представляют собой потенциальный маркер заболевания. В связи с этим, актуальным является комплексный анализ структурной и эпигенетической вариабельности генома, а также функциональной активности генов лейкоцитов и клеток сосудов при выраженном атеросклеротическом поражении артерий у человека.

Степень научной разработанности темы исследования.

Область генетики многофакторных заболеваний, в частности ССЗ, является активно развивающимся направлением исследований отечественных и зарубежных научных коллективов. В Российской Федерации преобладающее количество работ в данной области знаний связано с анализом ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма ядерного генома лейкоцитов периферической крови индивидов с факторами риска и клиническими фенотипами атеросклероза, а также патогенетически значимыми признаками заболевания в отдельных популяциях (Степанов В.А. и др., 1995; Фомичева Е.В. и др. 1998; Пузырев В.П., 2006; 26. Пчелина С.Н., Дубина М.В., 2009; Жейкова Т.В. и др., 2012; Полоников А.В. и др., 2013; Бабушкина Н.П. и др., 2014; Бергер У.В. и др., 2014; Ложкина Н.Г. и др., 2014; Шахтшнейдер Е.В. и др., 2014; Шестерня П.А. и др., 2014; Бушуева О.Ю., 2015; Москаленко М.И. и др., 2015; Мулерова Т.А. и др., 2015; Орлов П.С. и др., 2015; Барбараш О.Л. и др., 2016; Гончарова И.А. и др., 2016; Муслимова Э.Ф. и др., 2016; Орлова А.Ю.

и др., 2016; Полоников А.В. и др., 2016; Понасенко А.В. и др., 2016; Салахов Р.Р. и др., 2016). Проводятся исследования ассоциаций полиморфизма мито-хондриального генома с ССЗ, обусловленных атеросклеротическим поражением артерий, в результате которых выявлены некоторые полиморфизмы и отдельные гаплогруппы, связанные с клиническими осложнениями и изменчивостью патогенетически значимых признаков (Бабушкина Н.П. и др., 2014; Голубенко М.В. и др., 2015). Часть работ посвящена изучению ассоциации длины теломер лейкоцитов крови индивидов с возрастом, курением и целым рядом фенотипов, в том числе атеросклерозом (Драпкина О.М., Шепель Р.Н., 2016; Максимов В.Н., 2016).

Открытие моноклональности гладкомышечных клеток в коронарных, сонных артериях и аорте, послужило причиной рассмотрения формирования ате-росклеротических бляшек с позиций неопластического процесса, когда серия мутаций в клетках артерий обусловливает селективную и неконтролируемую пролиферацию клеток (Benditt E.P., Benditt J.M., 1973). Однако концепция соматического мутагенеза до сих пор не получила должного внимания для объяснения закономерностей развития атеросклероза и его клинических проявлений (De Flora S., Izzotti A., 2007; Weakley S.M. et al., 2010; Пузырев В.П. и др., 2014). К настоящему времени не имеется цельной картины генетических изменений, происходящих в клетках атеросклеротически измененных артерий, а также не выявлено специфичных генетических аномалий, чтобы предположить патогенетический механизм или потенциальный биомаркер заболевания. Отчасти это обусловлено тем, что структурная вариабельность генома клеток, составляющих атеросклеротическую бляшку артерий, оценивалась отдельно на различных уровнях организации генома (Hatzistamou J. et al., 1996; Spandidos D.A. et al., 1996; Kiaris H. et al., 1996; McCaffrey T.A. et al., 1997; Flouris G.A. et al., 2000; Miniati P. et al., 2001; Grati F.R. et al., 2001; Casalone R. et al., 1991; Arvanitis D.A. et al. 2005; Uryga A. et al., 2016).

Работы, в которых используются микрочиповые технологии высокоразрешающего картирования микроструктурных перестроек по всему геному и анализируется связь вариаций числа копий участков ДНК с риском развития атеросклероза и его осложнений, немногочисленны и их результаты противоречивы (Pol-lex R.L., Hegele R.A., 2007; Myocardial Infarction Genetics Consortium, Kathiresan S. et al., 2009; Gancheva K. et al., 2009; Wellcome Trust Case Control Consortium et al., 2010; Shia W.C. et al., 2011). Более того, в данных исследованиях проводилось тестирование только одной ткани – лейкоцитов периферической крови.

Исследование вариабельности метилирования ДНК, как наиболее известной эпигенетической модификации генома, при атеросклерозе у человека in vivo является относительно малоизученным вопросом. Согласно обзору Muka T. et al. (2016), большинство работ, связывающих уровень метилирования ДНК с клиническими проявлениями атеросклероза, проводятся с использо-6

ванием относительно легкодоступного для исследования материала – лейкоцитов периферической крови и основаны на кандидатном подходе. Наиболее воспроизводимые ассоциации, которые подтверждены хотя бы в двух работах, установлены в отношении уровня метилирования генов ABCG1 и риска развития ишемической болезни сердца, а также гена F2RL3 и риска смертности от стабильной ишемической болезни сердца (Breitling L.P. et al., 2012; Zhang Y. et al., 2014; Peng P. et al., 2014; Pfeiffer L. et al., 2015).

Микрочиповые технологии использовались для поиска локусов с измененным уровнем метилирования ДНК в лейкоцитах крови и клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных, в относительно небольшом количестве работ (Castillo-Diaz S.A. et al. 2010; Назаренко М.С. и др., 2011; Zaina S. et al., 2014; Yamada Y. et al., 2014; Wang Z. et al., 2014; Aavik E. et al., 2015; Sharma P. et al., 2014; Gomez-Uriz A.M. et al., 2015; Guay S.P. et al., 2015; Guar-rera S. et al., 2015; Rask-Andersen M. et al., 2016). Исследования проводились отдельно для лейкоцитов крови и клеток сосудов. Данные работы сильно различаются между собой в отношении изучаемых клинических форм патологии, регионов сосудистого русла, стадий патологического процесса, критериев формирования выборок и их популяционных особенностей, а также используемых методических подходов анализа уровня метилирования ДНК и алгоритмов биоинформационной обработки данных.

Таким образом, исследование вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК в клетках крови и сосудов при атеросклерозе остается относительно малоизученным вопросом. Чаще всего в данных работах в качестве материала используются клетки крови больных, а не собственно клетки сосудов. Результаты исследований, проведенных в данном направлении, трудно сопоставить, поскольку в них применяются разные методические и статистические подходы анализа большого массива данных. Кроме того, большинство исследований направлено на поиск отдельных молекулярных мишеней заболеваний, а не оценку профиля вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК тканей в целом.

Изменение профиля вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК тесно связано с функциональной активностью генов. В настоящее время существуют отдельные работы по анализу уровня экспрессии генов в клетках артерий при их атеросклеротическом поражении по сравнению с интактными сосудами (Bijnens A.P. et al., 2006; Sulkava M. et al., 2017). Однако нет исследований, в которых дифференциально метилированные и экспрессируемые гены между клетками атеросклеротически измененных и интактных артерий анализируются одновременно. Отсуттвуют работы, в которых проводится сравнительный анализ микроструктурных перестроек хромосом между лейкоцитами и клетками артерий у одних и тех же больных атеросклерозом с помощью высокоразрешающих микрочиповых технологий, а также сопоставляются вариации

числа копий участков ДНК с изменением экспрессии генов в лейкоцитах, клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов.

Цель исследования:

Провести комплексный анализ структурно-функциональной вариабельности генома клеток сосудов и лейкоцитов при выраженном атеросклеротиче-ском поражении коронарных и сонных артерий у человека.

Задачи исследования:

1. Оценить профили вариабельности числа копий участков ДНК, метилирования ДНК и экспрессии генов между лейкоцитами, клетками артерий, пораженных атеросклерозом, и интактными сосудами с использованием микрочиповых технологий и биоинформационных алгоритмов обработки данных.

2. Выявить регионы генома с вариабельностью числа копий участков ДНК в лейкоцитах, клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов, а также охарактеризовать принадлежность белковых продуктов локализованных в них генов к биологическим процессам.

3. Идентифицировать дифференциально метилированные CpG-сайты, потенциально связанные с атеросклерозом, и представить функциональную аннотацию их генов.

4. Выделить дифференциально экспрессирующиеся гены между клетками артерий, пораженных атеросклерозом, и интактными сосудами; оценить связь их белковых продуктов с биологическими процессами.

5. Провести интегральный анализ вариабельности числа копий участков и метилирования ДНК с изменением экспрессии генов в лейкоцитах, клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов.

Научная новизна.

В результате исследования получены новые знания о вкладе структурной и эпигенетической вариабельности генома в формирование предрасположенности клинически выраженного атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий у человека. Впервые с использованием микрочиповых технологий и единых биоинформационных алгоритмов обработки данных охарактеризован спектр вариабельности числа копий участков ДНК и показана ткане-специфичность профиля метилирования ДНК между лейкоцитами, клетками артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов у человека in vivo.

Установлено, что меньшая доля идентифицированных вариаций числа копий участков ДНК, содержит гены, однонуклеотидный полиморфизм которых связан, главным образом, с факторами риска атеросклероза. Впервые у больных атеросклерозом в лейкоцитах и клетках артерий идентифицировано редкое увеличение числа копий участков ДНК в хромосомном субсегменте 10q24.31 (ERLIN1), не обозначенное в базе данных геномных вариаций чело-8

века (Database of Genomic Variants). Показано, что в лейкоцитах у некоторых больных атеросклерозом увеличение числа копий участков ДНК в хромосомных регионах 10q24.31 (ERLIN1) и 12q24.11 (UNG, ACACB) имеет постзиго-тическое происхождение.

С помощью анализа на микрочипах между клетками артерий, пораженных атеросклерозом, и интактными сосудами идентифицированы дифференциально метилированные регионы генома, потенциально связанные с атеросклерозом. В клетках сосудов впервые установлена связь изменения уровня метилирования ДНК в локусе 2q31.1 (HOXD4/HOXD3/MIR10B) с атеросклерозом, а в лейкоцитах больных с факторами риска и клиническими проявлениями атеросклеротического поражения сонных артерий.

Выполнена функциональная аннотация белковых продуктов генов, локализованных в области вариабельности числа копий участков ДНК, дифференциально метилированных CpG-сайтов, а также дифференциально экс-прессирующихся генов в клетках артерий, пораженных атеросклерозом и интактных сосудов. Показано, что существенная доля вариаций числа копий участков ДНК и отдельных CpG-сайтов с изменением уровня метилирования между клетками артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов, содержит гены иммуновоспалительного ответа.

Выявлено преобладание доли отдельных CpG-сайтов с увеличением уровня метилирования и генов со сниженной функциональной активностью в клетках атеросклеротически пораженных артерий на поздних стадиях патологического процесса по сравнению с интактными сосудами. Установлено, что изменение уровня метилирования ДНК и экспрессии генов в артериях при атеросклерозе затрагивает белковые продукты, которые участвуют в процессах развития, метаболизме липидов и программируемой клеточной гибели, обеспечивают взаимодействие цитокин-цитокин рецептор, вовлечены в метаболизм арахидоновой кислоты, связаны с формированием фагосом и регуляцией актинового цитоскелета, принадлежат к ABC транспортерам. Обнаружена отрицательная корреляция уровня метилирования и экспрессии генов LIPE, CIDEC, TMEM88, GATA2 и S100A4 между клетками пораженных атеросклерозом и интактных артерий у больных атеросклерозом.

В целом, впервые на основании комплексного анализа вариаций числа копий участков ДНК, уровней метилирования ДНК, а также экспрессии генов в клетках артерий, пораженных атеросклерозом, и интактных сосудов расширены имеющиеся представления относительно структурно-функциональной организации генома соматических клеток при атеросклерозе и их потенциальной связи со сложно наследуемым фенотипом. Дополнены существующие знания о функциональной значимости известных генов-кандидатов атеросклероза, а также идентифицированы новые молекулярные мишени для профилактики, диагностики и лечения данной патологии.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты дополняют имеющиеся представления относительно молекулярно-генетических механизмов формирования сердечно-сосудистых заболеваний с позиций изменчивости генома соматических клеток. У больных с клинически выраженным атеросклерозом в лейкоцитах и клетках сосудов картированы регионы генома с вариациями числа копий участков ДНК, в том числе установлено постзиготическое происхождение некоторых из них в лейкоцитах. В результате профилирования клеток сосудов и лейкоцитов крови по уровню метилирования ДНК показана его тканеспе-цифичность и идентифицированы регионы генома, потенциально связанные с атеросклерозом. Выявлена связь изменения уровня метилирования ДНК в локусе 2q31.1 (HOXD4/HOXD3/MIR10B) в клетках артерий с атеросклерозом, а в лейкоцитах – с курением и ишемическим инсультом.

Возможность постзиготического происхождения вариаций числа копий участков ДНК, а также ткане-, регионарную и межиндивидуальную специфичность вариабельности метилирования ДНК необходимо учитывать при выборе биологического материала для исследования молекулярно-генетиче-ских механизмов атеросклероза. Показана значимость анализа уровня метилирования ДНК для прогноза риска развития и течения атеросклеротического поражения артерий у человека. Выявлена необходимость разработки новых интегральных методических подходов для анализа вариаций числа копий участков ДНК, вариабельности метилирования ДНК и экспрессии генов в образцах тканей с высокой клеточной гетерогенностью. Данные по вариабельности числа копий участков ДНК, метилирования ДНК и экспрессии генов в лейкоцитах и клетках сосудов при атеросклерозе представляют интерес для сравнительного и интегрального анализа таковых при других МФЗ. Предложенный комплексный подход к анализу вариаций числа копий участков ДНК, уровня метилирования ДНК и экспрессии генов в клетках сосудов и лейкоцитах у больных с атеросклерозом формирует основу для разработки панели биомаркеров в отношении профилактики, диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Созданный банк тканей сосудов различной локализации и степени поражения атеросклерозом, а также лейкоцитов периферической крови больных атеросклерозом может быть использован для дальнейших работ в области генетики МФЗ.

Результаты диссертационного исследования внедрены в педагогический процесс при обучении врачей-интернов, врачей-ординаторов, студентов факультетов биологического и медицинского профиля различных вузов, в том числе на кафедре медицинской генетики ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, а также слушателей курсов повышения квалификации.

Методология и методы исследования.

Методологической и теоретической основой исследования послужили труды отечественных и зарубежных ученых в области генетики и эпигене-тики атеросклероза. Замысел исследования заключается в предположении о том, что для понимания проблемы «недостающей наследуемости» заболеваний важное значение имеет знание о структурной и эпигенетической вариабельности генома, которая вносит вклад в регуляцию функциональной активности генов и реализацию патологического фенотипа в клетках органов-мишеней атеросклероза. В то же самое время, данные варианты представляют собой потенциальные мишени для диагностики и лечения данной патологии.

В работе использован комплекс современных методов клинического и параклинического обследования больных атеросклерозом, а также молекуляр-но-генетического, иммуногистохимического, биоинформационного и статистического анализа.

Обследование больных с атеросклеротическим поражением коронарных и сонных артерий проводилось с помощью широкого спектра методов по общепризнанной схеме. Банк тканей сосудов (коронарные и сонные артерии с ате-росклеротическими бляшками, непораженные внутренние грудные артерии и большие подкожные вены нижних конечностей), а также лейкоцитов периферической крови включал более 800 образцов. Иммуногистохимический анализ образцов сосудов проводился с антителами к альфа-актину гладкомы-шечных клеток и с антителами к рецептору CD68.

Молекулярное профилирование клеток сосудов и лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью крупномасштабных и высокоразрешающих микрочиповых технологий, позволяющих идентифицировать вариации числа копий участков ДНК, оценивать уровни метилирования ДНК и экспрессии генов. В частности, вариации числа копий участков ДНК идентифицированы с использованием матричной сравнительной геномной гибридизации на платформе SurePrint G3 Human CGH+SNP Microarray 2400K (Agilent Technologies). Анализ уровня метилирования отдельных CpG-сайтов проведен с использованием микрочипов на базе платформы Infnium Human Methylation27 BeadChip (Illumina). Оценка уровня экспрессии генов осуществлена с помощью микрочипа на базе платформы HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina). Биоинформационная обработка полученных данных осуществлена с помощью современных методов статистического анализа, которые включают различные базы данных и пакеты специализированных программ, реализованных в среде R.

Для подтверждающего анализа вариаций числа копий участков ДНК использована количественная ПЦР в режиме реального времени, а изменение уровня метилирования отдельных генов-кандидатов верифицировано с помощью бисульфитного пиросеквенирования.

Положения, выносимые на защиту:

6. Вариации числа копий участков ДНК в лейкоцитах и клетках артерий у больных с клинически выраженным атеросклерозом коронарных артерий связаны, главным образом, с факторами риска заболевания. Белковые продукты локализованных в области вариаций числа копий участков ДНК генов участвуют в иммуновоспалительном ответе, обеспечивают функционирование обонятельных рецепторов, а также ферментов метаболизма различных субстратов. Увеличение копийности в хромосомных регионах 10q24.31 (ERLIN1) и 12q24.11 (UNG, ACACB) в лейкоцитах является результатом не только унаследованных, но и постзиготических мутационных событий.

7. Клетки коронарных и сонных артерий, пораженных атеросклерозом, характеризуются умеренным увеличением уровня метилирования отдельных генов, сферой компетенции которых является функционирование мышечной системы и регуляция концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток. Гены, гипометилированные в клетках пораженных атеросклерозом артерий, функционально аннотируются с широким спектром биологических процессов: развитие, иммуновоспалительный ответ, нарушение метаболизма липидов, программируемая клеточная гибель. Изменение уровня метилирования ДНК в локусе 2q31.1 (HOXD4/HOXD3/MIR10B) в клетках коронарных и сонных артерий ассоциировано с их атеросклеротическим поражением, а в лейкоцитах – с факторами риска заболевания и острыми сосудистыми событиями.

8. Клетки сонных артерий, пораженных атеросклерозом, имеют существенное снижение экспрессии генов, белковые продукты которых участвуют в ответе клетки на действие ионов металлов, а также в программируемой клеточной гибели, развитии сосудов, регуляции иммуновоспалительного ответа, в ответе клетки на действие липидов и внешних стимулов, а также в формировании липидных капель в цитоплазме клеток. В то же время, на уровне экспрессии активируются процессы, преимущественно направленные на поддержание структурой целостности атеросклеротических бляшек через организацию внеклеточного матрикса.

9. В клетках артерий при атеросклерозе с реализацией биологических процессов, а также функционированием сигнальных и метаболических путей связаны белковые продукты преимущественно разных генов на разных уровнях структурно-функциональной организации наследственной информации. Общей сферой компетенции генов, локализованных в области вариаций числа копий участков ДНК, регионов с изменением уровня метилирования ДНК и транскрипции, является иммуновоспалительный ответ. В клетках атеросклеротически пораженных артерий по сравнению с ин-тактными сосудами изменение числа копий участков ДНК и экспрессии затрагивает ген ACACB, а уровень метилирования ДНК в генах LIPE, CIDEC, TMEM88, GATA2 и S100A4 отрицательно коррелирует с их экспрессией.

Степень достоверности результатов проведенных исследований.

Достоверность полученных данных обеспечивается репрезентативным объемом выборок (суммарно около 800 образцов биологического материала), использованием высокоразрешающих молекулярно-генетических методов исследования, а также биоинформационных алгоритмов анализа данных и современных пакетов статистических программ.

Апробация материалов диссертации.

Основные результаты исследования по теме диссертационной работы представлены и обсуждены на внутри- и межлабораторных семинарах, научно-экспертном совете НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, а также на российских и международных конференциях: Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2011); научной конференции «Мутагенез и его роль в различных проблемах генетики человека», посвященной памяти академика РАМН Николая Павловича Бочкова (Москва, 2013); Международной конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2013); VI съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Ростов-на-Дону, 2014); Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2015); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2014, 2017); X научной конференции «Генетика человека и патология. Проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014); VII съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015); VIII Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2017); Международной конференции по биоинформатике, регуляции генома и структурной/системной биологии (Новосибирск, 2014, 2016); Конгрессе Европейского Общества по проблемам атеросклероза (Милан, Италия, 2012; Глазго, Великобритания, 2015; Инсбрук, Австрия, 2016; Прага, Чехия, 2017); Ежегодных Европейских конференциях по генетике человека (Амстердам, Голландия, 2011; Милан, Италия, 2014; Копенгаген, Дания, 2017); 13-м Международном конгрессе по генетике человека (Киото, Япония, 2016).

Публикации.

Всего по теме диссертации опубликовано 50 научных работ, в том числе 13 статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Личное участие автора.

В диссертационной работе использованы экспериментальные и аналитические материалы, полученные автором лично или под его непосредственным руководством. Диссертант координировал составление клинической базы и сбор биологического материала, осуществление пробоподготовки образцов для молекулярно-генетического анализа с помощью микрочипов, количественной ПЦР в режиме реального времени, бисульфитного пиросек-венирования, а также руководил процессом биоинформатической обработки и статистического анализа данных. Автор лично разрабатывал дизайн исследования и определял методологию исследования, самостоятельно выбирал вариации числа копий участков ДНК и регионы генома для оценки уровня метилирования ДНК при их подтверждающем исследовании, проводил анализ баз данных и литературы по структурной и эпигенетической вариабельности генома при МФЗ, представлял результаты исследований в виде статей и тезисов докладов, выступал с докладами на научных конференциях. Написание всех глав диссертации выполнено лично диссертантом.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 313 страницах машинописного текста и включает введение, основные главы (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с обсуждением), заключение, выводы, список литературы, а также приложение. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами. Библиография включает 427 литературных источников, из них 32 источника отечественной и 395 источника зарубежной литературы.

Структурная вариабельность генома при атеросклеротическом поражении артерий

Исследования GWAS, как правило, выявляют SNP, встречающиеся в популяции с большой частотой (более 5%). В связи с этим, редкие генетические варианты остаются невыявленными, представляя собой «недостающую наследуемость». В настоящее время появляется все больше доказательств того, что структура подверженности МФЗ включает редкие генетические варианты [Keinan, Clark et al., 2012; Purcell et al., 2014]. Идентификация редких генетических вариантов требует анализа больших по объему выборок или мета-анализа данных нескольких работ. Кроме того, это может быть обследование индивидов с «экстремальными» признаками или фенотипами, популяций африканского происхождения, а также изолятов и этнических групп с эффектом «родоначальника». Однако особенно информативным для поиска редких генетических вариантов является использование такого подхода как ресеквенирование отдельных участков ДНК, секвенирование экзома или генома в целом у неродственных индивидов или членов отдельных семей. Не исключено, что данные генетические варианты, скрываются в массиве данных, ежедневно получаемом в процессе массового параллельного секвенирования индивидуальных геномов. Их идентификация трудоемка и требует усилий больших исследовательских коллективов и использования биоинформационных подходов обработки данных.

По своей природе генетические варианты предрасположенности МФЗ могут быть представлены не только SNP, но и более крупными по размеру структурными вариантами генома, такими как вариации числа копий участков ДНК (англ. Сopy Number Variation – CNV). Данные генетические варианты занимают существенную часть генома человека, составляя 12-18% [Carter, 2007; Lupski, 2015]. Частота изменения копийности участков ДНК на 3-4 порядка выше по сравнению с однонуклеотидными заменами при делении клеток [Forsberg et al., 2013]. Данные варианты изменяют структуру нуклеотидной последовательности в регуляторных или кодирующих регионах генома, влияя на дозу или функциональную активность генов, в результате развивается целый ряд фенотипических проявлений. Особую роль для рассмотрения CNV в качестве вариантов предрасположенности МФЗ имеет тот факт, что данные варианты часто локализуются в области генов, которые кодируют белки, отвечающие за взаимодействие с факторами среды [Ionita-Laza et al., 2009]. В настоящее время показано, что CNV вносят вклад в формирование злокачественных новообразований, сердечно-сосудистых заболеваний (несиндромальные врожденные пороки сердца, атеросклероз), метаболических нарушений (ожирение), аутоиммунных заболеваний (псориаз, болезнь Крона, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет 1 типа), аллергических и нейропсихических заболеваний (шизофрения, аутизм, несиндромальная умственная отсталость) и др. [Girirajan et al., 2011]. Некоторые CNV могут быть общими для нескольких заболеваний. Например, CNV в хромосомном субсегменте 16p11.2 связана со спектром аутистических расстройств, шизофренией, синдромом дефицита внимания и гиперактивности [Weiss et al., 2008; Lionel et al., 2011]. Вариации числа копий участков ДНК, ассоциированные с МФЗ, включают редкие, малокопийные и крупные по своему размеру варианты с большим эффектом, а также многокопийные варианты меньшего размера, обладающие умеренным влиянием и регистрируемые у существенной доли индивидов в популяции [Manolio et al., 2009]. Исследование ассоциаций CNV с МФЗ требует анализа больших по размеру выборок и обязательной оценки функциональной значимости выявленных ассоциаций. Идентификация CNV осуществляется с помощью таких методических подходов, как микрочиповые технологии (матричная сравнительная геномная гибридизация, микрочипы к однонуклеотидным вариантам или их комбинация) и массовое параллельное секвенирование. Основными сложностями применения данных методов является их относительно высокая стоимость и довольно сложный анализ полученных данных. Кроме того, до сих пор существуют методические ограничения при исследовании сложных и многокопийных регионов генома, а также относительно небольших CNV [Usher et al., 2015; Girirajan et al., 2011]. Предполагается, что между CNV и SNP существует неравновесие по сцеплению, поэтому накопленная информация по SNP может помочь при анализе ассоциации CNV с МФЗ. Таким образом, CNV могут составлять «недостающую наследуемость» МФЗ, кроме тех генетических вариантов, которые возникли в соматических клетках у индивида de novo.

Известно, что эпистатические взаимодействия между генетическими вариантами лежат в основе их протективного или, наоборот, вредного влияния на фенотип. Причем ген-ген взаимодействия зависят от влияния факторов внешней среды [Sadee et al., 2014]. Исследования GWAS обладают низкой способностью в оценке таках взаимодействий, что, по-видимому, является еще одной из причин выявленной к настоящему времени малой доли наследуемости МФЗ [Zuk et al., 2012]. В этом случае, используя большие массивы данных и объемы выборок, необходимо более активно применять статистические и вычислительные методы системной биологии. В частности, недавнее крупное исследование семи МФЗ выявило существенное количество SNP-SNP взаимодействий [Lippert et al. 2013]. Однако размер вклада взаимодействий ген-ген, также как взаимодействий ген-внешняя среда в «недостающую наследуемость» МФЗ еще необходимо определить.

Эпигенетические модификации генома при атеросклеротическом поражении артерий

Китайские исследователи оценивали уровень метилирования 1505 CpG сайтов в post mortem образцах левых передних нисходящих коронарных артерий из области выраженных атеросклеротических бляшек (n=35) и интактных регионов (n=35), используя микрочип GoldenGate Methylation Cancer Panel I (Illumina, США). Выборку больных и контроля формировали разные индивиды, однако данные группы были сопоставимы по полу и возрасту. В результате выявлено дифференциальное метилирование 116 GpG-сайтов (97 генов), из них большая часть была гипометилирована в атеросклеротических бляшках по сравнению с контролем. Около 52,6% дифференциально метилированных CpG сайтов локализовались в области от -200 п.н. до +200 п.н. от сайта старта транскрипции (TSS). Авторы выявили преобладание мотива нуклеотидной последовательности, характерного для связывания определенных транскрипционных факторов (NFKB1, P53, Myc, HIF1A), которые регулируют воспаление, функцию эндотелиальных клеток и ГМК. В целом авторы обнаружили снижение уровней метилирования ДНК, а также экспрессии мРНК и микроРНК в пораженных атеросклерозом коронарных артериях по сравнению с таковыми непораженными. Так же как и Castillo-Diaz et al. (2010), авторы отметили, что в большинстве случаев уровень метилирования ДНК обратно коррелирует с экспрессией генов, хотя есть и исключения из этого правила. Кроме того, китайские исследователи выявили не только гены, клеточные процессы и сигнальные пути, участие которых в атеросклерозе рассматривалось ранее, но и некоторые новые гены, микроРНК и сигнальные пути (например, SNTB2 и miR-519d). Следует отметить, что в патологическом процессе преобладали и были активированы воспаление, лейкоцитарная инфильтрация и миграция макрофагов, но ингибирована – пролиферация и миграция эндотелиальных клеток, ГМК. В данной работе также установлена особая роль убиквитин-зависимой системы деградации белков, с активацией протеасом на ранних стадиях атерогенеза и, наоборот, их инактивацией на поздних стадиях [Wang et al., 2014].

Коллектив исследователей из Мексики и Испании, продолжая работу, инициированную Castillo-Diaz et al. (2010), сравнили уровень метилирования отдельных CpG-сайтов в клетках атеросклеротических бляшек аорты (n=15) и сонных артерий (n=19) с непораженными тканями аорты (n=15) с использованием микрочипа Illumina HumanMethylation450 BeadChip (США). Причем образцы аорты были взяты у одних и тех же индивидов post mortem, а сонные артерии получены в результате каротидной эндатерэктомии и представляли собой стабильные бляшки III-VI морфогистологических типов. Выборки включали мужчин и женщин, возраст больных варьировал от 36 до 88 лет. В результате между пораженной атеросклерозом аортой и сонными артериями по сравнению с интактной областью аорты обнаружено 1858 дифференциально метилированных CpG-сайтов, уровень метилирования которых варьировал от 15% до 49%. Авторы работы назвали данный список «дифференциально метилированные CpG-сайты, связанные с атеросклерозом». Большинство данных CpG-сайтов (91,3%) было гиперметилировано (в области собственно генов и в CpG-«бедных» регионах, расположенных на расстоянии кб от CpG-островков) в клетках артерий, пораженных атеросклерозом. Белковые продукты генов, локализованных в области или рядом с дифференциально метилированными CpG-сайтами, участвуют в функционировании эндотелиальных клеток и ГМК. Пятнадцать CpG-сайтов с измененным уровнем метилирования расположены в пределах 100 кб от однонуклеотидных полиморфизмов, ранее ассоциированных с атеросклерозом и его осложнениями. Результаты подтверждающего исследования уровня метилирования отдельных CpG-сайтов генов HOXA2, HOXA6, HOXA9, HOXA9, HOXA11AS, HOXC4, HOXC11, PDGFA, PLAT, PRRX1, PXDN, MIR23b с помощью пиросиквенирования в клетках сосудов согласовались с данными микрочипа. Кроме того, уровень метилирования генов HOXA6, HOXA9, MIR23b, PDGFA, PLAT, PRRX1, PXDN корелировал с их экспрессией. Кроме того, с помощью технологии полногеномного бисульфитного секвенирования установлено, что в атеросклеротической бляшке аорты VII гистологического типа происходит гиперметилирование по многим локусам генома в промоторах, внутригенных областях, Alu элементах, генах некодирующей и рибосомальной РНК по сравнению с интактной аортой. Только в области ретротранспозона LINE-1 выявлено снижение уровня метилирования ДНК [Zaina et al., 2014]. В следующей работе данного исследовательского коллектива с помощью микрочипа Infinium HumanMethylation450 BeadChip (США) оценивался уровень метилирования более 450000 CpG-сайтов в образцах post mortem аорты, разделенных на III-VII морфогистологические типы (n=15), и непораженных регионов аорты (n=15). В результате была показана корреляция между морфогистологическим типом атеросклеротических бляшек и степенью дифференциального метилирования 1985 CpG-сайтов («дифференциально метилированные CpG-сайты, связанные со степенью атеросклероза»). Большая часть данных CpG-сайтов подвергалась гиперметилированию по мере прогрессии атеросклеротического поражения аорты. Дифференциально метилированные CpG-сайты концентрировались в области собственно генов и в меньшем проценте случаев в промоторах. Белковые продукты генов, локализованных в районе дифференциально метилированных CpG-сайтов, участвововали в иммуновоспалительных процессах. Восемнадцать CpG-сайтов расположены в области 9 генов (C1QL4, CTNNA3, DCC, ESR1, HSPA1A, IMMT, LRP5, PDGFA, SLC16A3), уровень метилирования которых был изменен и связан с атеросклеротическим поражением артерий в работах, проведенных ранее с помощью кандидатного и широкогеномного подходов. Кроме того, 24 CpG-сайта локализованы в пределах 250кб от однонуклеотидного полиморфизма, ассоциированного ранее с атеросклерозом и его осложениями. Интересный результат связан с тем, что выявлена сильная обратная связь между уровнем метилирования CpG-сайтов в области промоторов генов у человека и экспрессией генов у мыши в аорте при развитии атеросклероза. Следует отметить, что в большинстве случаев дифференциально метилированные CpG сайты, идентифицированные в данном исследовании и в предыдущем Zaina S. et al. (2014), принадлежали к разным генам. В раннем исследовании белковые продукты генов с измененным уровнем метилирования преимущественно участвовали в функционировании эндотелиальных клеток и ГМК, а в данной работе – в иммуно-воспалительных процессах макрофагов. Кроме того, как и в предыдущей работе гиперметилированные CpG-сайты концентрировались в области собственно генов [Valencia-Morales et al., 2015].

Анализ микроструктурных перестроек хромосом на микрочипах и биоинформационная обработка данных

Сравнительный полногеномный анализ уровня транскрипции между клетками пораженных атеросклерозом сонных артерий (САБ, n=3) и интактными внутренними грудными артериями (ВГА, n=2) проведен с помощью микрочипов HumanHT-12_V4 BeadChip (Illumina), который содержит 47231 проб. РНК выделена из тех же образцов САБ и ВГА, которые также использовались для анализа уровня метилирования ДНК. Образцы сосудов гомогенизировали с помощью TissueLyser (Qiagen) в Trizol (Thermo Fisher Scientific). Качество образцов оценивали с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) и спектрофотометрического измерения.

Далее выполнялся синтез и очистка кДНК, получение биотинилированной кРНК, ее очистка и гибридизация. Все этапы были выполнены согласно стандартному протоколу производителя (Illumina). После гибридизации выполнено сканирование изображения с использованием Illumina BeadArray Reader System (Illumina). Первичные данные обработаны в пакете программ GenomeStudio Gene Expression Module (Illumina). Статистический анализ данных был осуществлен с помощью пакетов lumi, limma в программной среде R (Bioconductor). Возникновение ложноположительных результатов (FDR) при множественном сравнении данных было скорректировано по методу Benjamini-Hochberg (pFDR). Дифференциально экспрессируемыми считались гены с кратностью различий уровня экспрессии между группами образцов FC 2 и pFDR 0,05. Функциональная аннотация дифференциально экспрессируемых генов и принадлежность их белковых продуктов к сигнальным и метаболическим путям была выполнена с помощью программы Web-based GEne SeT AnaLysis Toolkit [Wang, 2013]. Категории описываемых генов в терминах биологических процессов (BP), молекулярных функций (MF) и клеточных компонентов (CC) соответствуют классификатору базы данных Gene Ontology (GO) [http://www.geneontology.org/].

Подтверждающее исследование идентифицированных вариаций числа копий участков ДНК проведено с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) на приборе AriaMx Realtime PCR System (Agilent Technologies) с реагентами TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies). В качестве материала использовалась ДНК, выделенная из КАБ (n=35), ВГА (n=35), а также ЛПК (n=315), взятых от мужчин с выраженным атеросклеротическим поражением коронарных артерий, а также лейкоцитов периферической крови (n=325), полученных от относительно здоровых мужчин, не имеющих клинических проявлений со стороны сердечно-сосудистой системы.

Для проведения qRT-PCR использовались следующие TaqMan зонды (Life Technologies): Hs03451854_cn – 3p21.1 (SFMBT1); Hs00986678_cn – 10q24.31 (ERLIN1) и Hs06959694_cn – 12q24.11 (ACACB). В качестве «внутреннего контроля» использован TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P, а калибратора – «ДНК мужчины европейского происхождения» (Agilent Euro Male, #5190, Agilent Technologies). Количественная оценка изучаемых CNV при проведении qRT-PCR выполнялась со средними значениями трипликатов, т.е. с целью минимизации технических погрешностей проведения qRT-PCR-реакции каждая реакция была реплицирована минимум три раза, по которым рассчитывалось среднее значение. Определение уровня вариаций числа копий участков ДНК проводилось методом относительной количественной оценки M. W. Pfaffl с учетом эффективности амплификации (E) для каждой пары праймеров [Pfaffl, 2001]. Значения в диапазоне 0,8-1,2 указывали на две копии участка ДНК, менее 0,6 - на уменьшение копийности, а более 1,4 рассматривались как увеличение числа копий. Статистический анализ полученных данных был выполнен в программной среде R (Bioconductor). Сравнение групп проводили с использованием таблиц сопряженности 2 2 по точному критерию Фишера. Различия принимались как статистически значимые при р 0,05.

Для подтверждающего анализа уровня метилирования в области генов HOXD4/HOXD3/MIR10B был использован метод пиросеквенирования модифицированной бисульфитом ДНК на приборе «PyroMark Q24» (Qiagen, США). Спектр анализируемых тканей включал САБ (n = 130), КАБ (n = 35), ВГА (n = 35), БПВ (n = 35) и ЛПК (n = 130), взятых у больных с выраженным атеросклеротическим поражением коронарных и сонных артерий, а также лейкоцитов периферической крови (n=110), полученных от относительно здоровых мужчин, не имеющих клинических проявлений со стороны сердечнососудистой системы.

Пробоподготовка образцов заключалась в проведении ПЦР с ДНК, модифицированной бисульфитом. Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл включала 20-50 нг модифицированной бисульфитом ДНК; 0,4 пмоль пары праймеров (табл. 5); 200 мкмоль каждого dNTP; 2,5 мкл SE-буфера (67 mM Tris-HCl (pH 8,8 при 25C); 16,6 mM (NH4)2SO4; 0,01% Tween-20); 3 ммоль MgCl2 и 0,5-1,0 единиц активности Hot Start Taq ДНК-полимеразы (Сибэнзим).

Амплификация проводилась на термоциклере (Biometra). Программа состояла из предварительной денатурации при 95C в течение 5 мин., с последующими 42 циклами денатурации при 95C (30 сек.), отжига (45 сек.) при температуре, специфичной праймеров (табл. 5), и элонгации цепи ДНК при 72C (30 сек.). Финальная элонгация проходила в течение 5 минут при 72оС. Проверка ПЦР (4 мкл продукта) проводилась с помощью электрофореза в 3% агарозном геле при напряжении 130 B в течение 30 минут с последующей окраской бромистым этидием. Визуализацию результатов выполняли в ультрафиолетовом свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе GelDoc 2000 (BioRad).

Анализ дифференциально метилированных генов, потенциально связанных с атеросклерозом

Категории биологических процессов по Gene Ontology различаются по уровню значимости для белковых продуктов генов, содержащих гипометилированные CpG-сайты, в клетках КАБ и САБ по сравнению с ВГА. В сравнении КАБ-ВГА первое место по уровню значимости занимает процесс развития, далее идут категории регуляции активации клеток (лейкоцитов), воспалительного ответа, процессы иммунной системы и ответа на молекулы липидов. В то же время, при сравнении САБ-ВГА также первое место по уровню значимости занимает процесс развития, а далее следуют категории: хранение липидов, программируемая клеточная гибель, позитивная регуляция ответа на стимулы, регуляция каскада I-каппаB киназы/NF-каппаB, позитивная регуляция продукции интерлейкина-1. По-видимому, образцы коронарных артерий, которые были исследованы в настоящей работе, имеют большую выраженность воспаления, а для сонных артерий особенно важны процессы, связанные с хранением липидов, а также программируемой клеточной гибелью и воспалением. Поскольку программируемая клеточная гибель является одним из механизмов дестабилизации атеросклеротических бляшек на поздних стадиях патологического процесса, не исключено, что сонные артерии предрасположены к нестабильности.

Из 185 генов, в состав которых входили CpG-сайты дифференциально метилированные между КАБ и ВГА, 22 (12%) гена являлись кандидатами атеросклеротического поражения артерий у человека на основании анализа генетических ассоциаций, согласно базе данных HuGE Navigator. В сравнении КАБ и БПВ выявлено, что из 176 дифференциально метилированных генов кандидатами для атеросклероза являются 15 (8,5%) генов. Для сравнений САБ и ВГА, а также САБ и БПВ – это 23 (16%) гена из 145 и 33 (9,3%) гена из 354, соответственно. В среднем, только 10,8% генов, дифференциально метилированных между артериями, пораженных атеросклерозом и интактными сосудами, были обозначены в качестве кандидатов для атеросклероза, на основании базы данных HuGE Navigator. Таким образом, в настоящем исследовании у больных атеросклерозом проведена оценка сходства и различий уровня и рисунка метилирования отдельных 27578 CpG-сайтов в лейкоцитах периферической крови и клетках сосудов, пораженных атеросклерозом и интактных, с помощью микрочипового исследования (Infinium Human Methylation27 BeadChip, «Illumina», США). Лейкоциты периферической крови и клетки сосудов, пораженных атеросклерозом и интактных, дифференцируются друг от друга по коэффициенту корреляции средних индексов метилирования всех анализируемых CpG-сайтов, а также по расположению отдельных образцов в зависимости от индекса метилирования всех CpG-сайтов в пространстве двух главных координат. Этот результат настоящего исследования совпадает с имеющимися в литературе данными относительно тканеспецифичности уровня метилирования ДНК [Varley et al., 2013; Jiang et al., 2015; Yang et al., 2016].

У больных атеросклерозом идентифицированы и охарактеризованы дифференциально метилированные CpG-сайты между клетками артерий, пораженных атеросклерозом и интактных сосудов. Количество дифференциально метилированных CpG-сайтов варьирует в зависимости от взятого порога уровня метилирования и сравниваемых сосудов. В среднем между артериями, пораженных атеросклерозом и интактными сосудами, выявлено 4073 (14,9%) дифференциально метилированных CpG-сайтов, а тех CpG-сайтов, которые различались по своему уровню метилирования на более чем 20%, было 293 (1,1%).

В настоящем исследовании установлено, что дифференциально метилированные CpG-сайты между клетками артерий, пораженных атеросклерозом и интактных сосудов, преимущественно локализованы вне CpG «островков». Это согласуется с хорошо известным фактом, что дифференциально метилированные CpG-сайты в большинстве случаев располагаются в CpG-«бедных» регионах генома [Slieker et al., 2013; Jiang et al., 2015].

В данное время существуют работы, в которых проводился широкомасштабный скрининг метилирования ДНК тканях сосудов у человека при атеросклерозе с помощью микрочипов и полногеномного бисульфитного секвенирования [Castillo-Diaz et al., 2010; Yamada et al., 2014; Wang et al., 2014; Zaina et al., 2014; Aavik et al., 2014; Valencia-Morales et al., 2015; Zaina et al., 2015]. Однако результаты, полученные в настоящем исследовании, трудно сопоставить с другими работами, поскольку в них использовались разные дизайны, сравнивались разные регионы сосудов у разных индивидов, применялись разные подходы, критерии и инструменты обработки данных с помощью биоинформационного анализа.

Из крупномасштабных исследований наиболее близкой по своему дизайну и использованному микрочипу является работа исследователей из Мексики и Испании Zaina et al. (2014), которые сравнили уровень метилирования более 450000 CpG-сайтов в клетках атеросклеротических бляшек аорты и сонных артерий с непораженными тканями аорты с использованием микрочипа Illumina HumanMethylation450 BeadChip (США). В настоящем исследовании, также как в исследовании Zaina et al., 2014, в клетках атеросклеротически измененных артерий относительно интактных сосудов, преобладали гиперметилированные CpG-сайты. Однако впервые в настоящем исследовании показано, что в клетках атеросклеротически измененных коронарных артерий большая часть относительно гиперметилированных CpG-сайтов располагалась в CpG 126 островках. В то же время, в клетках пораженных атеросклерозом сонных артерий по сравнению с интактными сосудами в CpG-«островках» преимущественно локализуются относительно гипометилированные CpG сайты. Это может быть обусловлено существующими межиндивидуальными различиями метилирования ДНК, поскольку образцы коронарных артерий, внутренних грудных артерий и больших подкожных вен были получены от одних и тех же больных атеросклерозом, а сонные артерии от других. С другой стороны, регион-специфичное гиперметилирование ДНК в области атеросклеротически измененных коронарных и сонных артерий на поздних стадиях патологического процесса, может являться характерной чертой данного заболевания.