Введение к работе
Актуальность проблемы. Хрусталик глаза позвоночных животных содержит набор структурных белков, носящих название кристалликов. На основании различий в их структуре и свойствах их разделяют на три основные класса: <*-, fi- и -кристаллины. Специфической укладкой этих белков в надмолекулярные структуры обеспечивается прозрачность хрусталика, его высокий показатель преломления, способность к аккомодации. Нарушения в ансамбле кристаллиновых белков могут приводить к помутнению хрусталика, что вызывает образование катаракт и потерю зрения. Неудивительно, что кристаллины являются-объектом интенсивных исследований на протяжении почти ста лет.
Новый этап в исследовании кристалликов возник в связи с возможностью клонировать кодирующие их гены. Клонирование генов открывает перспективы изучения первичной структуры ДНК, а тем самым и аминокислотной последовательности самих, кристаллинов. Появляются возможности изучать регуляцию активности генов, кодирующих кристаллины в ходе диффереицировки хрусталика, открываются возможности эволюционных исследований, которые прольют свет на взаимоотношения между различными классами кристаллинов и позволят ответить на вопрос, какие белки являются их предшественниками в эволюции. Кроме того, на основании структурных данных возможно построение моделей трехмерной укладки кристаллинов и их взаимодействия между собой в хрусталике.
Все это делает выделение кристаллиновых генов и изучение их структуры весьма актуальной задачей генетики и биологии развития.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выделению и характеристике клонированных кДНК-генов, кодирующих полипептиды _Д- кристаллинов хрусталика глаза травяной лягушки Рала temporaria. Конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:
из клонотеки кДНК, содержащих последовательности мРНК хрусталика лягушки, выделить рекомбинантные клоны, кодирующие j5-кристаллины;
определить первичную структуру рекомбинантных клонов pRt( 1) 1053 и pRt(l) 1003, кодирующих jSAl-кристаллин;
установить первичную структуру клона pRt(l) 1473, кодирующего ^В2-кристаллин и содержащего вставку кДНК наибольшей длины;
построить модель трехмерной структуры ^АІ-кристаллина методами компьютерной графики на основании данных о его аминокис-
лотной последовательности;
- оценить темпы молекулярной эволюции J,-кристалликов.
Научная новизна и практическая значимость работа Впервые в мировой литературе в данной работе описано выделение и идентификация рекомбинантньи клонов кДНК, кодирующих jS-кристаллиньі низшего позвоночного (травяная лягушка Rana temporaria).
Установлена первичная структура клонированных кДНК, кодирующих jsAl- и ^5В2-кристаллины лягушки. Получены доказательства дупликаций в ходе формирования индивидуальных генов jS-кристаллинов. Впервые проведена оценка темпа молекулярной эволюции полипептидов jfl-кристалликов.
Построена модель трехмерной структуры^АІ-кристалліша. Показано, что трехмерная структура этого белка сходна с трехмерной структурой соответствующих полипептидов млекопитающих и птиц. Установлен факт высокой консервативности аминокислотных остатков поверхности молекулыjeAl-кристаллина Высказано предположение, что jeAl-кристаллины участвуют в образовании агрегатов нативных jft-кри-сталлинов.
Полученные нами результаты используются в ряде лабораторий Института белка РАН, Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, Института общей генетики РАН.
Публикации и апробация результатов. Основные научные результаты представляемой работы опубликованы в 15 печатных работах, материалы диссертации докладывались на VI симпозиуме СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот"(Цхалтубо, 1982), Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК'* (Пущино, 1982), V Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983), VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984), XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 78 стр. машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов исследования и изложение полученных результатов с их обсуждением, выводов. Список цитированной литературы включает 86 работ отечественных и иностранных авторов.