Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ половых хромосом конопли посевной (Сannabis sativa L.) и родственных видов рода Humulus Разумова Ольга Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Из истории вопроса 11

1.1.Определение пола у растений. Пол и половые хромосомы у растений. Эволюция половых хромосом. 11

1.1.1.Типы половых систем у растений. 12

1.2. Организация растительных геномов. Повторяющиеся элементы в геноме растений . 18

1.2.1. Повторяющиеся элементы в растительных геномах. 20

1.2.2. Повторяющаяся ДНК и половые хромосомы растений. 25

1.3. Общая характеристика, ботаническое описание и таксономическое положение Cannabis sativa. 29

1.3.1. Общая характеристика и ботаническое описание Cannabis sativa . 29

1.3.2. Таксономическое положение. 31

1.3.3. Хозяйственное значение. 32

1.4. Генетика конопли и ее сородичей. Определение пола у конопли 35

Глава 2 Материалы и методы 46

2.1. Растительный материал 46

2.2. Методы 48

2.2.1. Поиск и выделение тандемных повторов. 48

2.2.2. Клонирование и секвенирование. 50

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК. 50

2.2.4. Приготовление препаратов 50

2.2.5. Выделение ДНК и определение пола семян . 51

2.2.6. Геномная (GISH) и флуоресцентная (FISH) in situ гибридизация. 53

2.2.7. Кариотипирование 55

Глава 3 Результаты 56

3.1. Анализ генома на наличие высококопийных тандемных повторов 56

3.1.1. Локализация повтора Cs 1. 59

3.1.2. Локализация повтора Cs-237 66

3.1.3.Локализация 45S рДНК. 67

3.1.4. Локализация 5S рДНК. 68

3.1.5. Локализация теломерного повтора 72

3.1.6. Кариотипирование Cannabis sativa . 73

3.1.7. Локализация тандемных повторов на пахитенных хромосомах

3.2. Определение хромосомного состава однодомных форм 81

3.3. Выявление Y-хромосомы двудомных видов Cannabaceae с использованием геномной in situ гибридизации. 88

Глава 4. Обсуждение 93

Заключение. 101

Выводы: 102

Список литературы 104

• Организация растительных геномов. Повторяющиеся элементы в геноме растений
• Общая характеристика и ботаническое описание Cannabis sativa
• Выделение ДНК и определение пола семян
• Кариотипирование Cannabis sativa

Введение к работе

Актуальность. Подавляющее большинство видов покрытосеменных растений имеют обоеполые цветки, то есть являются гермафродитами. Однако около 6% покрытосеменных представлены двудомными формами, возникшими неоднократно в процессе эволюции (Dellaporta, 1993; Ming, et al., 2011; Vyskot and Hobza, 2015). При этом гетероморфные половые хромосомы обнаружены только у 20 видов из 6 неродственных родов (Ming et al., 2011; Renner, 2014). Возникновение двудомности само по себе представляет значительный интерес исследователей, поскольку не может быть объяснено только препятствием к аутбридингу, так как для предотвращения самоопыления большинству покрытосеменных растений достаточно различных механизмов самонесовместимости (Charlesworth and Charlesworth, 1978; Charlesworth, 1985). Многие двудомные виды обладают экономической значимостью (папайя, актинидия, облепиха, щавель, спаржа, шпинат, хмель и др.).

Виды семейства Cannabaceae обладают разными системами половых хромосом (XX/XY у хмеля обыкновенного и конопли посевной, XX/XY1Y2 у хмеля японского), поэтому представляют собой интересную и удобную модель для изучения эволюции половых хромосом цветковых растений.

Несмотря на богатую историю возделывания, с генетической точки зрения вид Cannabis sativa по-прежнему остается слабо изученным, и на данный момент нет четкого понимания особенностей определения пола. Возникновение моноцийных форм, образование спектра половых типов, отсутствие однозначного представления о вкладе Y-хромосомы в процессы половой детерминации делают исследования хромосом конопли весьма актуальными. Последний детальный кариотип создан японскими учеными в 1998 году (Sakamoto et al., 1998) с применением методов классической цитогенетики. Кариотипов, основанных на современных методах молекулярной цитогенетики, нет. При этом наличие чернового варианта сиквенса генома (Van Bakel et al., 2011) в совокупности с новейшими биоинформатическими подходами открывает широкие возможности для молекулярной цитогенетики. Половые хромосомы хмеля обыкновенного и хмеля японского изучены несколько лучше, есть достоверные кариотипы, созданные с использованием современных методов флуоресцентной in situ гибридизации, идентифицированы и охарактеризованы половые хромосомы (Divashuk et al., 2011; Alexandrov et al., 2012). Однако сравнительная характеристика половых хромосом видов данного семейства до настоящего времени не проводилась.

Цель работы. Цель данной работы изучить молекулярно-цитогенетические особенности организации генома Cannabis sativa L., выявить половые хромосомы и провести их сравнительный анализ с половыми хромосомами родственных видов рода Humulus

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие

задачи:

1. Провести биоинформационный анализ генома конопли посевной (Cannabis sativa L.), выявить высоко копийные тандемноорганизованные последовательности ДНК и провести их клонирование.

2. Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) локализовать выявленные тандемные повторы, 45S и 5S рДНК и теломерный повтор на митотических и мейотических хромосомах растений Cannabis sativa. Выявить молекулярно-цитогенетические маркеры для эффективной идентификации половых хромосом (XY).

3. Провести кариотипирование однодомных и двудомных сортов конопли посевной и изучить полиморфизм их кариотипов.

4. Провести молекулярный и молекулярно-цитогенетический анализ однодомных сортов конопли посевной и установить состав половых хромосом.

5. Создать кариотип однодомных и двудомных (мужских и женских) растений Cannabis sativa L.

6. Провести геномную гибридизацию in situ с собственной меченой ДНК (self-GISH) на митотических хромосомах трех видов семейства Cannabaceae (C. sativa, H. lupulus, H. japonicus).

7. Провести кросс-GISH эксперименты по гибридизации ДНК родственных видов на митотических хромосомах изучаемых видов. На основе полученных цитогенетических данных установить расположение псевдоаутосомного региона на Y хромосоме C. sativa, а также оценить его размеры у трех изучаемых видов.

8. Сделать вывод о возможных путях эволюции половых хромосом в семействе
Cannabaceae.

Научная новизна. Впервые цитогенетически идентифицирована Y-хромосома у мужских растений Cannabis sativa L. Показано отсутствие Y-хромосомы у однодомных форм. Впервые проведена геномная гибридизация in situ на трех видах семейства Cannabaceae, выявлена преимущественная локализация сигнала на Y-хромосомах. Идентифицирован псевдоаутосомный регион. Составлены идиограммы и кариотипы мужских, женских и однодомных растений конопли. Впервые показана локализация 5S рДНК, 45S рДНК и теломерного повтора арабидопсис-типа на хромосомах Cannabis sativa L. Выявлен, клонирован и секвенирован хромосом-специфичный прицентромерный повтор Cs-237. Идентифицированы 5 из 10 хромосом гаплоидного набора Cannabis sativa.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в данной работе, имеют важное теоретическое значение для фундаментальных исследований по изучению эволюции и возникновения пола в семействе Cannabaceae и у покрытосеменных растений в целом. Важное значение имеют

данные о структурной организации генома конопли посевной, полученные с использованием методов молекулярной цитогенетики. С практической точки зрения, результаты исследований могут быть использованы в селекции и семеноводстве конопли посевной. Даны рекомендации по использованию молекулярного маркера пола MADC2 в семеноводстве при оценке засорения двудомными формами партий семян однодомной конопли. Молекулярно-цитогенетические маркеры позволяют идентифицировать отдельные хромосомы, что важно при молекулярно-генетическом и физическом картировании генома и создании маркеров для использования в селекционной работе.

Методология и методы диссертационного исследовании. Диссертация выполнена с использованием современных, хорошо зарекомендовавших себя методов молекулярной цитогенетики и биоинформатики, на современном оборудовании. Полностью методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту:

8. Кариотип мужских и женских растений C. sativa, составленный с использованием современных методов молекулярной цитогенетики.

9. Выявленный тандемный повтор Cs-1 (Cs-375) является надежным молекулярно-цитогенетическим маркером Y-хромосомы мужских растений и четвертой пары аутосом C. sativa.

10. Y-хромосома – самая большая по относительному размеру в кариотипе C. sativa, гетерохроматиновая.

11. Псевдоаутосомный регион расположен на коротком плече Y-хромосомы C. sativa.

12. Выявленный тандемный повтор Cs-237 является видоспецифичным, прицентромерным цитогенетическим маркером на хромосому 9 (несущую 45S рДНК) и хромосому 3 Cannabis sativa.

13. В кариотипе Cannabis sativa по 1 сайту гибридизации 45S рДНК (хромосома 9) и 5S рДНК (хромосома 8).

14. Теломерный повтор Cannabis sativa – Arabidopsis-типа и локализуется на всех хромосомах.

15. Растения изученных восьми однодомных сортов конопли отечественной селекции не содержат в кариотипе Y-хромосому.

16. Молекулярный маркер MADC2 (Mandolino et al., 1999) может применяться в селекции и семеноводстве однодомных сортов для их оценки на засорение мужскими генотипами.

17. Геномная гибридизация in situ с использованием в качестве пробы собственной ДНК изучаемых видов (self-GISH) выявляет Y-хромосомы у Humulus lupulus, Humulus japonicus, Cannabis sativa.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты

представлены в 16 печатных работах. Из них 4 статьи, опубликованных в журналах

из списка, рекомендуемого ВАК. Основные положения были представлены на различных международных и российских конференциях и симпозиумах, в том числе: на научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». – Ростов-на Дону, 25-29 марта 2013, XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». – Москва, 10 апреля 2013 г., 7-ом совещании «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» и симпозиуме, посвященном 135-летию со дня рождения Г.А.Левитского. – 28-30 октября 2013 г., г. Санкт-Петербург, I Международной научно-практической конференции Лекарственные растения: биоразнообразие, технологии, применение. – Гродно: ГГАУ,2014, Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era. - 23-24 September 2014 University of Silesia in Katowice, Poland, VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы г. Ростов-на-Дону, 15–20 июня 2014 г, 3-ей Всероссийской научно-практической конференции по геномному секвенированию (NGS-2015, Москва, 2015); а также на ежегодных конференциях аспирантов, молодых ученых и преподавателей РГАУ-МСХА.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах работы. Поиск, клонирование и локализация субтеломерного повтора – совместно с Александровым О.С. под руководством Дивашука М.Г., выделение и анализ хромосом-специфичного повтора Cs-237 – совместно с Александровым О.С., остальные разделы диссертации – полностью самостоятельно. Автор лично проводил обработку, анализ и интерпретацию всех полученных результатов, а также подготовку публикаций и рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста и включают 42 рисунка, 6 таблиц. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Глава 1. Из истории вопроса», «Глава 2. Материалы и методы», «Глава 3. Результаты», «Глава 4. Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 224 источника, из них 197 иностранных.

Организация растительных геномов. Повторяющиеся элементы в геноме растений

Во все времена людей интересовал вопрос пола и полового размножения. Однако, в отличие от животных, само наличие пола у растений долгое время ставилось под вопрос, несмотря на то, что еще Геродот, за 400 лет до нашей эры, сообщал о различии, делающемся в Вавилоне в отношении мужских и женских экземпляров финиковых пальм. «Отец ботаники» Теофраст указал на различия между мужскими и женскими растениями фисташки, а Плиний писал о пыльце как об оплодотворяющем начале (Баранов, 1955). Однако Аристотель отрицал наличие пола у растений, и, по-видимому, именно с этим связан тот факт, что следующее упоминание пола у растений мы можем встретить только в конце XVII века.

Датой начала возрождения учения о поле у растений можно назвать 1694 год, когда Рудольф Камерер (Камерариус, Rud. Jac. Camerer) пишет профессору Валентину (Mich. Valentin) письмо «De Sexu Plantarum Epistola» («Письмо о поле у растений»), в котором излагает результаты своих опытов и наблюдений, начиная с 1690 г. В своих экспериментах Камерер изолировал женские растения кукурузы, конопли и пролески и наблюдал отсутствие завязи. Эти работы можно считать началом экспериментальных наблюдений за полом растений (Р.Я Камерариус, 1940).

Карл Линней построил свою систему растений на основе различий в строении цветка, за что был подвергнут критике со стороны Сигизбека (Siegesbeck), объявившего саму мысль существования пола у растений безнравственной.

Последователь Камерера – Кельрейтер проводил многочисленные опыты по гибридизации растений, результатом которых стала его работа «Предварительное сообщение о некоторых опытах и наблюдениях, относящихся к полу у растений», изданная в 1761 году. Однако можно считать, что окончательно учение о поле установилось только через 80 лет, после опубликования Конрадом Гертнером в 1844 своих трудов под названием «Опыты и наблюдения о половых органах высших растений и о естественном и искусственном оплодотворении собственной пыльцой», и продолжения – «Опыты и наблюдения за образованием бастардов в растительном царстве», вышедшим в свет в 1849 году. В этих работах автор приводит результаты более чем 9000 опытов по гибридизации растений. Одновременно с выходом работ Гертнера в биологическом мире активно развиваются идеи эволюционного учения Дарвина, который в своих работах активно поддерживал и развивал идеи Кельрейтера, что также способствовало утверждению учения о существовании пола у растений (Й.Кельрейтер, 1940).

Начало двадцатого века ознаменовалось появлением и стремительным развитием новой науки – генетики, и вопрос о поле и формировании пола перешел на другой уровень. Половые хромосомы были обнаружены в 1891 г. Г. Хеннингом, и позднее, в 1906г К. Мак-Кланг и Э. Уилсоном у насекомых Lydaeus turucus.

Попытки изучения половых хромосом у растений предпринимались плеядой ученых того времени (Winge, 1923; Kihara & Ono, 1923; Hirata, 1924; Winge, 1929; Flory, 1931). Одновременно с этим появились и первые теории эволюции половых хромосом (Lewis, 1942) однако до настоящего времени этот вопрос остается одним из самых неясных в биологии (Kumar et al, 2014; Vyskot & Hobza, 2015; Filatov D. A, 2015; Charlesworth D, 2015).

У большинства растений, имеющих половые хромосомы, определение пола схоже с млекопитающими, и гетерогаметным полом (ХХ/XY) является мужской, тогда как женские экземпляры гомогаметны и имеют хромосомный набор ХХ (Cannabis sativa, Humulus lupulus, Silene latifolia, Spinata oleracia, Coccinia indica, Asparagus officinalis и др.). Однако вклад Y-хромосомы в формирование пола разный, и если у таких растений как Silene latifolia, Spinata oleracia и некоторых других имеется активная, т.е. несущая транскрибируемые гены, влияющие на образование мужских цветков, Y-хромосома, то у целого ряда других пол зависит от соотношения количества Х хромосом к общему числу аутосом (Cannabis sativa, Humulus lupulus). К последним, по-видимому, принадлежат также растения с несколькими половыми хромосомами (XY1Y2 у H. japonicus и Rumex acetosa, X1X2Y1Y2 у H. lupulus var. cordifolius). Гетерогаметный женский пол (ZW/ZZ) у растений встречается значительно реже и, вероятно, отмечен только у ряда видов земляники (Fragaria elatior, Fragaria virginiana) и тополя (Populus sp.), при этом половые хромосомы у данных видов находятся на самой ранней эволюционной стадии (так называемые прото-W, прото-Z) и, по сути, представляют собой аутосомы, несущие гены детерминации пола (Ming et al, 2011).

Недавно, на основании молекулярных данных, показано определение пола по типу ZZ/ZW у фисташки (Pistacia vera L.), при этом, по-видимому, хромосомы находятся на относительно поздней эволюционной стадии, поскольку генотип WW не жизнеспособен (Kafkas et al., 2015), однако достоверных цитогенетических данных по кариотипу на данный момент нет.

В настоящее время общепризнанна теория происхождения половых хромосом как растений, так и животных, от аутосом, через возникновение нерекомбинирующего участка, ответственного за определение пола, с последующей дифференциацией на X и Y и увеличения нерекомбинирующей области Y-хромосомы за счет накопления участков хлоропластной ДНК, мобильных генетических элементов и других повторяющихся последовательностей. На последней стадии эволюции начинается обратный процесс: нерекомбинирующие, гетерохроматиновые области Y-хромосомы элиминируются, вплоть до полной дегенерации хромосомы и возникновения системы ХХ/ХО (Ming et. al, 2011, Westergaard M. 1958).

Общая характеристика и ботаническое описание Cannabis sativa

Таким образом, несмотря на высокую хозяйственную ценность и долгую историю изучения вида Cannabis sativa, с цитологической точки зрения он до конца не охарактеризован, нет надежных цитогенетических маркеров половых хромосом, нет однозначного мнения относительно кариотипа однодомных форм, не различимы аутосомы.

Два ближайших к конопле вида – Humulus lupulus L. и Humulus japonicus Siebold & Zucc цитогенетечиески довольно изучены. Хмель обыкновенный, как и конопля, имеет 20 хромосом в диплоидном наборе, при этом мужские растения гетерогаметны (2n=18+XX/XY). У хмеля японского в кариотипе женских растений насчитывается 16 хромосом (2n=14+ХХ), а у мужских, помимо 14 аутосом, присутствует 3 половых хромосомы, 1 женская (Х) и 2 мужских (ХY1Y2) (2n=14+Х Y1Y2). Мужская половая хромосома хмеля обыкновенного была определена еще в начале прошлого века, поскольку является самой маленькой в кариотипе по абсолютному размеру (из Kihara & Ono T 1925 по Winge, 1923; Winge 1929; Karlov et al., 2003). Половые хромосомы хмеля японского, напротив, самые большие в кариотипе (Alexandrov et al., 2012; Grabowska-Joachimiak et al., 2011). На все половые хромосомы обоих видов созданы молекулярно-цитогенетические маркеры, созданы современные кариотипы, определены сайты локализации 5S и 45S рДНК (Divashuk at el., 2011, Alexandrov et al., 2012; Grabowska-Joachimiak et al., 2012).

С генетической точки зрения конопля изучена лучше, чем с цитологической. В 2011 году канадские ученые сообщили о черновом варианте секвенировании генома женского растения Cannabis sativa L. (Bakel et al., 2011). По их данным, размер генома составил 534 Mb. Для сравнения, размер генома ближайших родственников конопли – хмеля японского и хмеля обыкновенного составляет 1,6 pg (1564 Mb) и 2,7 pg (2640 Mb) соответственно (Grabowska-Joachimiak, 2006, Zonneveld, 2005). Транскриптом конопли насчитывает порядка 30000 генов. В конце 2014 года был выложен черновой вариант сиквенса генома хмеля обыкновенного (Natsume et al., 2014), а задолго до этого был известен его транскриптом, что открывает широкие возможности для сравнительной генетики и филогении семейства Cannabaceae.

Было предпринято несколько успешных попыток молекулярного маркирования конопли. Одними из самых первых, недорогих и достаточно эффективных маркеров стали маркеры случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), они активно используются для генетического картирования, изучения фенотипической изменчивости и в эволюционных исследованиях. Также они оказались полезными и в определении половой дифференциации двудомных растений. С 1995 года различными учеными были созданы RAPD-маркеры на определение пола у конопли (Sakamoto et al., 1995, Mandolino et al., 1999, Flachowsky et al., 2001, Trjk et al., 2002, Peil et al., 2003, Rode et al., 2005). Мандолино с соавторами (Mandolino et al., 1999) с использованием RAPD анализа идентифицировали участок ДНК, связанный с определением пола у конопли. Бенд, размером 400 пн амплифицировался строго на мужских растениях, и никогда не появлялся на женских. На его основе был разработан SCAR маркер (Sequence-Characterized Amplified Region), являющийся более удобным и современным, чем RAPD. Полученные им результаты могут быть использованы в маркер-ассоциированной селекции, для улучшения генетики конопли. (Mandolino and Carboni, 2004).

Морфологические и молекулярные исследования половой дифференциации конопли итальянского двудомного сорта Fibranova показали, что половая дифференциация растений начинается только на стадии появления четвертого листа. Было произведено сравнение уровня экспрессии апикальных генов мужских и женских растений, в результате чего авторами был разработан кДНК-AFLP экспресс метод для ранней диагностики признака пола (Moliterni et al., 2004).

Геномная ДНК, выделенная из мужских и женских растений, была подвергнута RAPD-анализу, после чего последовательности клонировали, делали блотт анализ и гибридизацию. В результате была установлена последовательность ДНК, связанная с мужским полом у конопли, названная MADC1 (Sakamoto et al,. 1995). Позднее, эти же исследователи (Sakamoto et al., 2000) провели флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH), с меченой последовательностью MADC1, в результате обнаружился четкий двойной сигнал на конце длинного плеча хромосомы, которую авторы считали Y. Таким образом, накопление полоспецифичных мужских последовательностей на длинном плече Y хромосомы может являться одной из причин гетероморфизма половых хромосом. (Tru et all, 2007)

Flachowsky и соавт., 2001 описали несколько AFLP маркеров, показывающих специфичные ДНК фрагменты у мужских растений. Peil и др. 2003, изучая AFLP маркеры на X и Y хромосомы у мужских и женских растений – потомков одного скрещивания, обнаружили пять маркеров, расположенных на обеих хромосомах и показали, что полиморфизм по половым хромосомам не ограничивается только различием между X и Y, но был также найден между хромосомами X. Эти наблюдения подтверждают более ранние данные о существовании такого полиморфизма, опубликованные Mandolino и соавт., 1999 и Trjk и соавт., 2002.

На проявление пола и развитие цветка оказывает влияние множество факторов внешней среды. Потенциальная возможность влиять на пол растения открывает широкие перспективы для повышения урожайности многих культур. У конопли определенную сложность в агротехнике создает разное качество волокна мужских и женских растений, и их разновременное созревание. Поэтому актуальным представляется создание и возделывание генетически однодомных сортов. Однако генетика определения однодомности до настоящего времени мало изучена. По косвенным признакам, однодомные растения имеют кариотип ХХ, что подтверждается работой Менцель (Menzel, 1964) и недавней статьей, продемонстрировавшей равное содержание ДНК у женских и однодомных растений, и большее – у мужских (Faux, 2013, 2014). Молекулярные маркеры пола, проверявшиеся на некоторых однодомных сортах, также демонстрировали амплификацию по женскому типу (Anne-Michelle Faux, 2014; Mandolino et al., 1999). Однако, прямых данных о хромосомной конституции однодомных сортов конопли до настоящего времени нет.

Выделение ДНК и определение пола семян

Еще одним классическим цитогенетическим маркером является последовательность 5S рибосомальной ДНК. У растений гены 5S рРНК как правило, представляют собой большие тандемные массивы, организованные в кластеры, расположенные на одной (томат, кокциния, картофель) или нескольких (ячмень) парах хромосом (Sousa et al, 2012; Xiang-Hui et al., 2013; Brown et al., 1999). Ближайшие родственные виды конопли – хмеля японский и хмель обыкновенный также отличаются по числу сайтов гибридизации 5S рДНК (Kim et al., 2008, Grabowska-Joachimiak et al., 2011; Karlov et al., 2003). Изучение расположения и количества кластеров рДНК может пролить свет на эволюцию и филогению отдельной таксономической группы или всех покрытосеменных. Так, у одного из древнейших растений - гинкго (Ginkgo biloba) - кластеры 5S расположены внутри 45S рДНК (Galian et al., 2012). Локализация рДНК послужила основанием для построения филогении хлопка (Gan, 2013).

Рисунок 20. FISH на женских и мужских метафазных хромосомах конопли посевной сорта «Зеница» с использованием меченных сигналов 5S рДНК (зеленый). Линейка - 5 мкм.

Мы провели гибридизацию повтора 5S ДНК на хромосомы конопли посевной, сигнал визуализировался на 1 паре хромосом, как в женских, так и в мужских растениях. (Рисунок 20). Кроме того, мы провели совместную флуоресцентную гибридизацию in situ повтора Cs 237 и 5S rDNA, а также 5S rDNA и субтеломерного повтора (Рисунки 21, 22). Это позволило нам убедиться, что Cs 237 и 5S rDNA локализуются на разных хромосомах, а значит, могут служить независимыми цитогенетическими маркерами. Аналогично, пара хромосом, несущих субтеломерный сигнал Cs-1 только на одном плече не является хромосомой Cs 237 и 5S rDNA.

Колокализация сигналов субтеломерного повтора (красный) и 5S ДНК (зеленый) на митотических хромосомах мужского растения конопли посевной сорта Зеница последовательностей на хромосомах конопли посевной позволяют идентифицировать 5 из 10 хромосом гаплоидного набора мужского растения, а именно – пару хромосом с 5S рДНК, сателлитные хромосомы (45S рДНК), пару хромосом, несущих повтор Cs 237 в прицентромерном районе, хромосомы, имеющие сигнал субтеломерного повтора только на 1 плече и Y-хромосому. 3.1.5. Локализация теломерного повтора.

Рисунок 23. Флуоресцентная гибридизация теломерного повтора арабидопсис-типа на митотические хромосомы Cannabis sativa

Теломерные повторы известны у большинства видов эукариот. Теломеры растений как правило представлены повторами Arabidopsis-типа (TTTAGGG), реже встречаются виды с повтором TTAGGG. Однако существует ряд видов, в том числе среди покрытосеменных растений, у которых теломерный повтор не известен, а его функцию предположительно берет на себя субтеломерный повтор или ретротранспозоны. Дуплицирование теломерного повтора в интерстициальные области хромосом также встречается, и может свидетельствовать о хромосомных перестройках, произошедших в эволюционном прошлом. Мы впервые физически картировали на хромосомах Cannabis sativa теломерный повтор Arabidopsis-типа (Рисунок 23).

Кариотипы мужских (а) и женских (б) растений конопли посевной с флуоресцентными сигналами субтеломерного повтора Cs-1(красный) и 5S рДНК (зеленый) Гаплоидный набор хромосом конопли посевной состоит из 9 аутосом (в том числе 1 хромосома с ядрышкоорганизующим регионом) и 1 пары половых хромосом – XX у женских растений и XY – у мужских. Все хромосомы мелкие, метацентрические (спутничная – субметацентрическая), по центромерному индексу трудноотличимы друг от друга (Таблица 5). Y-хромосома самая большая в кариотипе (относительная длина 6.5±0.18), отличается не только отсутствием сигнала субтеломерного повтора на длинном плече, но и ярким, гетерохроматиновым дапи-положительным окрашиванием. За Х-хромосомы принимали самые большие, по относительной длине, хромосомы, несущие сигнал повтора Cs-1 на обоих плечах, однако, уверенно отличить их от следующей по размеру пары аутосом мы не можем, поскольку разница в размерах статистически не значительна. Первые три пары аутосом практически не различаются друг от друга, они все метацентрические, с центромерным индексом близким к 50 и Таблица 5. Результаты измерения митотических хромосом конопли посевной и вычисление центромерных индексов.

Сигнал Cs-1 только на коротком плече, DAPI-позитивноедлинное плечо с сигналами субтеломерного повтора на обоих плечах. Четвертая пара хромосом также метацентрическая, однако, от первых трех ее легко отличить по наличию сигнала субтеломерного повтора только на коротком плече, а также по характерной морфологии длинного плеча. Группа хромосом с пятой по восьмую также практически неотличима друг от друга только на основании измерений и вычисления центромерного индекса. Это мелкие, метацентрические хромосомы, относительный размер которых плавно уменьшается от 4,8 до 4,1. При этом последняя, самая маленькая по своему размеру хромосома в кариотипе, несет на коротком плече сигнал 5S рДНК. Пара спутничных хромосом хорошо идентифицируется на митотических пластинках растений обоих полов, это субметацентрические хромосомы. Таким образом, общая формула кариотипа Cannabis sativa выглядит 8m+1sm(sat)+XY(мужские)/XX(женские), где m – метацентрические хромосомы, sm – субметацентрические, sat – хромосома, несущая спутник (сателлит). На основании данного кариотипа и знаний о расположении найденных повторов была составлена идиограмма мужских растении (Рисунок 25).

Кариотипирование Cannabis sativa

Как видно из рисунка 37, Y-хромосома конопли крупная, с ярким гетерохроматиновым DAPI /GISH-позитивным блоком, включающим в себя полностью длинное плечо и прицентромерную часть короткого. По расположению субтеломерного сигнала мужская половая хромосома конопли схожа с Y-хромосомой хмеля обыкновенного, у которой сигнал субтеломерного повтора Kpn1 также располагается только в дистальной части длинного плеча, в области псевдоаутосомного региона. Однако, в отличие от хмеля обыкновенного, субтеломерный повтор имеется на обоих плечах Х-хромосомы конопли в дистальной части, тогда как у хмеля обыкновенного на коротком плече субтеломерный бенд детектируется ближе к центромере (Divashuk et al., 2011; Divashuk at al., 2014). У хмеля японского Х-хромосома имеет только 1 субтеломерный сигнал в дистальной части длинного плеча, но Y1 имеет сигналы на обоих плечах, в то время как на Y2 они полностью отсутствуют (Alexsandrov et al., 2012). Разнообразие расположения сигналов субтеломерных повторов на половых хромосомах у всех трех видов семейства, а также полиморфизм по данному признаку, свойственный сортам однодомной конопли и 5 хромосоме хмеля японского (Александров, 2010) подтверждает эволюционную пластичность данной области, неоднократно показанную на других объектах, однако подобный хромосомный полиморфизм, как правило, не оказывает влияния на проявления пола и не имеет своих морфологических проявлений (Badaeva et al. 1994; Grabowska-Joachimiak et al. 2015). Тем не менее, подобный полиморфизм может служить проявлением динамичности кариотипа, что, в свою очередь, возможно объясняет высокую пластичность вида Cannabis sativa, отмечаемую многими авторами (Faeti et al. 1996; Forapani et al. 2001).

Кроме того, данные по ориентации псевдоаутосомных регионов показывают значимость субтеломерных повторов в генезисе половых хромосом. Сравнение локализации блоков рибосомальной 45S и 5S рДНК в кариотипе обоих видов хмелей и конопли показали различия как в количестве сайтов, так и в их расположении на хромосомах. У хмеля обыкновенного 2 хромосомы несут 5S рДНК и одна - 45S рДНК, у хмеля японского, напротив, две хромосомы несут сайты 45S рДНК, а 5S рДНК локализован только на одной паре хромосом (Karlov et al., 2003; Grabowska-Joachimiak et al., 2011; Kim et al., 2008). У Cannabis sativa мы выявили по одному сайту 45S и 5S рДНК. Количество сайтов рибосомальной ДНК и их расположение позволяют предположить наличие транслокаций в процессе эволюции данных видов.

Результаты, полученные при геномной in situ гибридизации с использованием в качестве зонда собственной ДНК (self-GISH) позволили четко визуализировать Y-хромосомы Cannabis sativa, H.lupulus и H.japonicus. что демонстрирует накопление повторяющихся последовательностей в нерекомбинирующих областях Y-хромосом у всех изученных видов. Данная модификация GISH основана на предпочтительной гибридизации диспергированной высокоповторяющейся ДНК, предположительно ретротранспозонов, которые при локализации дают картину, аналогичную GISH (Li et al., 2004). При этом мы можем сделать вывод, что данные группы повторяющихся элементов не являются специфическими для Y-хромосомы, а достаточно широко представлены в геномах обоих полов и должны присутствовать на Х-хромосомах и аутосомах, но с меньшим числом копий. В подтверждение этому служит тот факт, что сильный диспергированный сигнал на Y –хромосомах наблюдался вне зависимости от того, мужская или женская ДНК использовалась в качестве меченой пробы (рис. 32), а также то, что с увеличением концентрации блока степень дифференцированности между Y-хромосомой и Х/аутосомами падала (Рис. 31). Последнее мы объясняем тем, что с блокирующей ДНК проходила преимущественная гибридизация, и мы наблюдали равномерный сигнал по всем хромосомам. Аналогичные результаты, полученные тем же методом, были показаны только на половых хромосомах кокцинии (Coccinia grandis) (Sousa et al., 2013). Попытка self-GISH на дреме (Silene latifolia) не удалась, также не было выявлено дифференциации при использовании в качестве флуоресцентной пробы для FISH ДНК с конкретных хромосом, полученных микродиссекцией (Scutt at al. 1997). Детекции Y-хромосомы удалось добиться только применив модифицированный метод Fast-FISH с хромосом-специфичным зондом, полученным микродиссекцией (Hobza et al. 2004). В нашей лаборатории этот метод был также успешно применен на хмеле японском, однако степень дифференциации сигнала при гибридизации оказалась низкой (Yakovin et al. 2014).

Y-хромосомы изученных видов Cannabaceae гетерохроматиновые, но лишь у хмеля японского они визуализировались self-GISH не только на метафазных пластинках, но и в интерфазном ядре. Кроме H. japonicus только Y-хромосомы R. acetosa остаются конденсированными в ядре (Clark at al., 1993; Ruiz Rejon et al., 1994 Mosioek et al, 2011).

Эксперименты по перекрестной гибридизации показали высокую степень различия между повторяющейся ДНК в геномах изучаемых видов, поскольку гибридизация наблюдалась только в высококонсервативной области рибосомальной 45S ДНК.

Выявление ХХ хромосомной конституции у однодомных растений позволяет предположить гормональную природу однодомности, что также подтверждается многочисленными экспериментами по изменению пола растений конопли, проводимыми ранее различными авторами (Heslop Harrison 1956; Chailakhyan and Khryanin 1978). Шабельный (2010) провел исследование по опылению женских двудомных растений пыльцой однодомных форм. Все поколение F1 оказалось женскими двудомными растениями, а при возвратном скрещивании в F1BC1 наблюдалось расщепление на женские и однодомные растения. Из этой работы можно сделать вывод о рецессивной природе однодомности. Возможно также, она вызвана мутациями в одном или нескольких генах у генетически женских растений (ХХ), которые влияют на гормональный фон и продуктивность жизнеспособной пыльцы. Случаи реверсии пола от двудомности к однодомным растениям встречаются в природе и хорошо изучены, например, у винограда (Vitis sp.). Все дикие формы рода Vitis двудомные растения, но культурный виноград Vitis vinifera имеет однодомные цветки. Происхождение однодомных растений от функционально мужского путем случайных мутаций было показано еще в начале-середине прошлого века (из S.S. Negi and H.P.Olmo, 1971 по Baranov and Rajkova, 1929; Negi and Olmo, 1970). В настоящее время известно, что за формирование пола у винограда отвечает небольшая область размером 143 kb в одном локусе, занимающем менее 1% от половой хромосомы (Fechter et al., 2012), что соответствует одной из ранних стадий эволюции половых хромосом по Мингу (Ming et al., 2011). Между тем, по оценкам молекулярных филогенетиков, возникновение двудомности в роде Vitis – явление старое, и насчитывает порядка 18 млн.лет. Это делает виноград удобным объектом для выяснения ответа на вопрос, почему половые хромосомы некоторых двудомных видов эволюционируют быстро, в то время как в других группах этого не происходит (Vyskot & Hobza, 2015).

Основываясь на наших данных и ранних работах других авторов, половые хромосомы изученных на данный момент видов Cannabaceae в модели Минга можно расположить на четвертой (Cannabis sativa), пятой (Humulus lupulus) и шестой (Humulus japonicus) стадии эволюции (Рис 42).