Введение к работе
Актуальность темы. Генноинженерные работы на дрожжах проводятся посредством конструирования векторных плазмид на corase дрожжевой 2 мкм ДНК плазмиды. Она служит и как модельная система для изучения таких фундаментальных биологических процессов как репликация и рекомбинация. 2мкм ДНК-подобные плазмиды были выделены не только из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, но и из осмофильных дрожжей Zygosaccharomyces, Kluyveromyces' и др. (Utatsu, Sakamato et al, 1987). Выяснилось, что различные по своей нуклеотидной последовательности плазмиды дрожжей можно изобразить в очень схожей пространственной модели с расположением гомологичных или аналогичных областей приблизительно в одних и тех же местах изучаемых плазмид (James, Murray et. al, 1987). После того, как была определена первичная структура 2мкм ДНК (Scp1) штамма S. cerevisiae А364А (James, Hartley et al, 1980) основным методологическим приемом изучения ее стало исследование поведения и взаимоотношения различных областей и генов в составе рекомбинантных векторов. Первичные структуры установлены полностью или частично десяти плазмид типа Sep и 2 мкм ДНК-подобных плазмид разных видов дрожжей (James, Murray et al, 1987). Но, несмотря на очевидные успехи генноинженерной методологии, применительно к дрожжам (созданию спектра функционально различных векторов, разработке простых методов трансформации) ее функция в клетке остается не ясной. Парадоксально и то, что при не выясненной ее функции с применением плазмид типа 2 мкм ДНК для конструирования векторов достигнуты не малые достижения в биотехнологии. Для оптимизации применения таких плазмид в биотехнологических и теоретических работах необходимо знать их функции в клетке. Структурные различия между 2 мкм ДНК-подобными плазмидами остаются актуальными также при изучении факторов, влияющих на стабильность рекомбинантных плазмид. В настоящее время выделено несколько плазмид типа Sep с частично различной первичной нуклеотидной последовательностью в некоторых ее участках (Xiao, Lawrence, 1991) что дает возможность изучить их как в функциональном, так и в эволюционном отношениях Для выявления функц^ка клетке всей плазмиды или отдельных ее частей требуются наличие более широкого спектра векторных молекул, включающих в себе различные по своей перэичной структуре плазмиды типа 2 мкм ДНК одного вида дрожжей. Изученные плазмиды типа Sep, выделение из дрожжей S.cerevisiae, различаются в основном делециями. Поэтому остается актуальным поиск новых вариантов плазмид дрожжей S.cerevisiae с разнообразной дивергенцией первичной нуклеотидной последовательности. Наиболее вероятно, что такие плазмиды могут быть найдены среди штаммов независимого происхождения.
Работа выполнена по теме Института ботаники "Создание и анализ модельных генетических систем на клеточном уровне для селективного изучения изменчивости и биологической продуктивности геиома с целью создания высокопрозодуктианых кормовых культур" (No Госрегистрации 022814) и является составной частью Всесоюзной научно-технической программы "Новейшие методы биоинженерии".
Целью работы явилось изучение .структуры и функции 2 мкм ДНК дрожжей S.cerevisiae штамма І5В-П4, происходящего из Петергофских генетических линий и проведение сравнительного анализа полученных данных с уже известными вариантами 2 мкм ДНК дрожжей типа Scpl.
Задачи исследовании. В задачи настоящей работы вхедиле
-
Клонирование 2 лкм ДНК штамма І53-П4 (Scp4).
-
Составление рестрикциочной карты плазмиды Scp4 v, сравнение с аналогичной картой плазмиды Scpl.
-
Определение типа дивергенции перэичной н\глсотиднс~! г.оследсезтельноои
плазмиды Scp4 по сравнению с плазмидой Scpl.
-
Определение функциональной значении районов дивергенции нуклеотидной последовательности плазмид Scp4 и Scpi.
-
Секвенирование фрагмента плазмиды Scp4, охватывающего районы "ОгГ и REP3.
-
Сравнение организации структур первичных нуклеотидных последовательностей районов "Ori и REP3 плазмид Scpl и Scp4.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучена новая 2 мкм ДНК (Scp4) штамма І5В-П4, происходящего из Петергофских генетических линий, отличающаяся от наиболее изученной плазмиды Scpl не только делециями, но и нуклеотидной последовательностью в районах REP3 и частично "Ori". Показано, что наиболее консервативная часть исследуемой плазмиды-малая Р петля и район инвентированных повторов. Впервые показано, что организация первичной структуры района REP3 отличается от района REP3 плазмиды Scpl. С пломощью вехторных плазмид проведены функционально-сравнительные анализы плазмид в штаммах различного происхождения. Показано, что плазмида Scp4 менее универсальна по сравнению с Scpl. Из всех плазмид типа Sep плазмида Scp4 наиболее отличается по первичней структуре и по организации района REP3. Таким образом было показано, что для плазмид типа Sep наиболее изменчивым является район REP3.
Нами изученная 2 мкм ДНК-плазмивз 5ср4-используется в Лаборатории генетики Института Ботаники Литеы для конструирования новых векторных плазмид, с цепью повышения их стабильности и дальнейшего изучения ее функции в клетке. На основе данных о нуклеотидной последовательности района REP3 была сконструирована секторная плазмида со стабильностью 100% (Dale, Bruschi, 1990). Данные о первичной структуре участка REP3 ппазмиды Scp4 повышает возможность выявления ее функции в клетке, что необходимо при конструировании новых векторов с повышенной стабильностью.
Основные положения, оыносимые на защиту.
-
Данные р:стрикциониого картирования и гетеродуплексного анализа 2 мкм ДНК штаммов І53-П4 и А364А различного происхождения.
-
Данные первичной структуры и кбгтьютерного анализа определенных фрагментов плазмид Scpl и Scp4.
-
Данные функциональной активности плазмид в зависимости от структурных различий.
Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на. Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК", Пущино, 1982, Международной конференции The International Symposium or Yeast Genetics and Molecular Biology, Canada, 1936, на Республиканских конференциях общества генетиков и селекционеров, Вильнюс, 1980, на семинарах Лаборатории генной инженерии НПО "Фермент", 1985,1986.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы четыре работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, сбзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуу^ния, выводов и списка цитируемой литературы