Введение к работе
Актуальность проблемы. Быстрое развитие биологии в целой и генетики в частности за последние десятилетия явилось прежде всего результатом разработки новых, современных методов. Получонив культуры эмбриональных стволовых (ES) клеток, сохраняющих основные свойства ранних эмбриональных клеток предстазляет собой аовый ш.^трумент для решения различных вопросов генетики, биологии развития, медицині' и др.
ES клетки мыши способны дифференцироваться in vitro, при этом симулируя нормальное развитие постимплантационного эмбриона. Таким образом. ES клетки могут служить модельв in vitro для изучения процессов дифференцировки и морфогенеза эмбриона в раннем развитии (Doetschman et al..1985^
Введенные в полость нормальной бластоциста ES клетки включаются в развитие и могут участвовать в формировании любых органов и тканей химерного организма, включая линию зародышевых клеток. Последнее свойство ES клеток позволяет использовать их в качестве носителей для введения чужеродных генов и получения трансгенных мышей новым, непрямым способом (Gossler et al.,1986; Robertson et al..1986a).
Наибольший интерес для исследователей представляет возмоя-ность сайт-специфичного мутагенеза ES клеток посредством механизма гомологичней рекомбинации между вновь введенной ДНК и гомологичным регионом в геноме ES клеток (gene targeting). Модификация уяе идентифицированных генов у ES клеток путем гомологичной рекомбинации дает возможность изучить функции этих генов в процессе развития (DeChlara et al.,1990; DeChlara et al.,1991; Soriano et al.,1991).
Одним из основных вопросов медицинской генетики является изучение патогенеза наследственных аномалий человека, что является
- і -необходимым условием их успешной профилактики и лечения. Изучение механизмов развития наследственных аномалий у человека крайне затруднено в связи с необходимостью получения достаточного материала ранних стадий развития эмбриона и невозможностью в боль-тшнстве случаев проведения экспериментального анализа действия гена. Эффективные методы лечения и профилактики имеются только для относительно небольшого числа болезней, механизмы развития которых известны. В то асе время патогенез многих наследственных болезней неясен. Для изучения механизмов развития наследственных болезней могут быть использованы мутантные линии мышей, имеющие сходные с человеком аномалии (Конюхов, 1969). В последнее время придается большое значение поискам таких мутантних линий мышей. Последние могут выступать в роли биологических моделей соответствующих наследственных болезней человека
Использование механизма гомологичной рекомбинации и так называемой "ES клеточной технологии" позволяет направленно индуцировать мутации и получать мутантних мышей с целью моделирования наследственных заболеваний человека (Kuehn et al.-. 1987: Tybule-wlcz et al.,1992). Используя подобный подход можно также корректировать мутантные гены ES клеток, что позволяет исправлять наследственные аномалии животных (Koller et al.,1989). Возможность проведения экспериментов такого рода представляет собой идеальную модельную систему генотерапии. что имеет огромное значение для медицинской генетики.
Несмотря на широкое распространение линий ES клеток и интенсивное их использование в научных экспериментах, остается еще ряд проблем ES клеточной технологии. К ним можно отнести убывающую способность ES клеток формировать химер вшьть до полной утраты этой функции, находящейся в прямой зависимости от длительности пасси^ звания культуры.
Однако публикаций в литературе, посвященных изучению различных факторов, влияющих на способность ES клеток формировать химе-
.-5-ры. а в особенности germ-line химеры крайне мало.
Выход химер после инъекции ES клеток в эмбрионы также зг^исит в значительной степени от генотипа и стадии развития эмбриона-реципиента. Однако, исчерпывающий анализ сочетания донор-реципиент даже по наиболее распространенным линиям ES клеток и линиям мкшей еще не сделан.
' Цель и задачи исследований. В соответствии с вышеизложенным, целыэ работы являлся сравнительный анализ плюрипотентных свойств э: Эриональных стволовых клеточных линий мыши и изучение влияния генетических v средовых факторов на способность ES клеток формировать химеры после инъекции в эмбрионы.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
освоить технику культивирования ES клеток и методы получения инъекционных химер с использованием ES клеток и клеток ВКМ.
охарактеризовать в условиях in vitro и in vivo плюрипотент-ные свойства новой ES клеточной линии STR. полученной от мутант-ной линии мышей HCOS/Glw;
изучить влияние длительности пассирования и происходящих при этом кариотипических изменений на способность ES клеток линии D3 формировать химерное потомство:
изучить влияние генотипа эмбриона-реципиента на способность ES клеток продуцировать генеративные химеры;
разработать простой и наглядный метод предварительного тестирования штрипотентности ES клеток in vitro, основанный на специфической активности щелочной фосфатазы ES клеток;
Научная новизна. Впервые охарактеризованы в условиях In vitro и in vivo плюрипотентные свойства новой ES клеточной линии STR. Впервые показано влияние длительности пассирования и происходящего при этом увеличения доли анеуплоидных клеток на способность ES клеточной линии D3 формировать хіілерное потомство, .іредлокен простой метод предварительного тестирования плюрипотентности ES клеток in vitro по специфической активности эндогенной щелочной
- в -фосфатази.
. Практическая значимость. Полученные данные о влиянии различных факторов на потенции эмбриональных стволовых клеток In vivo позволяют более эффективно использовать ES клетки l научных экспериментах и получать с высокой частотой химеры и генеративные химеры.
Экспериментальные данные по изучению плврипотентных свойств ES клеток являются новыми для нашей страны и могут представлять практический интерес в методическом аспекте.
Результаты исследования представляют также медико-генетический интерес и могут послужить первым шагом в создании модельных животных, имеющих сходные с человеком наследственные аномалии.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены на отчетной конференции ГНТП "Приоритетные направления генетики" (Москва. 1993). на V научной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка. 1993). на 4-ой конференции "Геном человека" (Черноголовка. 1994). на научном семинаре лаборатории генетики развития МГНЦ РАМН в марте 1994 года, на научной конференции отдела биотехнологии ВНИИ животноводства РАСХН в апреле 1994 года и на научном семинаре института генетики человека МГНЦ РАМН, состоявшемся в мае 1994 года.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 экспериментальные научные статьи. 3 тезиса.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение. выводы, список литературы. Указатель литературы содержит 13 отечественных и 135 иностранных библиографических источника. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 12 таблицами. 4 рисунками и 10 фотографиями.