Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Генетика подверженности туберкулезу 15
1.2 Синдром атипичных семейных микобактериозов
1.2.1 Роль IL-12 и его рецептора в патогенезе синдрома 27
1.2.2 Роль IFN- и его рецепторов 35
1.2.3 Роль гена STAT1 42
1.2.4 Роль гена NEMO 46
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1 Характеристика исследуемых групп 52
2.2 Характеристика методов исследования
2.2.1 Клинико-лабораторные методы 56
2.2.2 Молекулярно-генетические методы 56
2.3 Статистические методы анализа 63
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Скрининг мутаций генов противоинфекционного иммунитета IL-12/IFN- у русских и тувинцев .
3.2 Межпопуляционные различия в распространении частот аллелей и генотипов генов антимикобактериального иммунитета .
3.3 Анализ ассоциаций полиморфизмов генов атипичных семейных микобактеризов с туберкулезом в сибирских популяциях
3.4 Исследование блоков сцепления полиморфизмов генов атипичных семейных микобактериозов .
3.4.1 Структура неравновесия по сцеплению в гене IL12RB 110
3.4.2 Структура неравновесия по сцеплению в гене IFNGR1 113
3.5 Анализ межгенных взаимодействий у больных туберкулезом в различных популяциях
Заключение 121
Выводы 129
Список используемых сокращений з
Список использованных источников
Литературы
- Роль IFN- и его рецепторов
- Клинико-лабораторные методы
- Межпопуляционные различия в распространении частот аллелей и генотипов генов антимикобактериального иммунитета
- Анализ межгенных взаимодействий у больных туберкулезом в различных популяциях
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В 1991 году ВОЗ объявила туберкулез (ТБ) глобальной проблемой здравоохранения: ежегодно в мире регистрируется 8 – 10 миллионов случаев впервые заболевших ТБ, а смертность достигает двух миллионов случаев (WHO, 2016). В России особенно напряженной по заболеваемости остается ситуация на территории Сибирского федерального округа и Дальнего Востока (Шилова М.В., 2014). Причиной неослабевающего интереса к ТБ является вариабельность его клинического течения: примерно 30% мирового населения инфицировано M. tuberculosis, но только в 5-15% это приводит к развитию заболевания (Djouahra A.M. et al., 2016), у остальных зараженных ТБ не переходит в активную фазу до конца жизни (O’Garra A. et al., 2013).
Состояние латентного носительства определяется балансом иммунной системы организма-хозяина, которая контролирует распространение патогена, но не может полностью уничтожить бактерии (Boechat A.L., 2013; Gurjav U. et al., 2016). Генетические факторы восприимчивости человека к ТБ активно изучаются, в основе изучения лежит выявление патологических вариантов генов, значимых для развития заболевания. В данном контексте важное место отводят генам цитокинов, транскрипционных и регуляторных факторов, которые определяют эффективность иммунного ответа на внедрение патогена и способность к его элиминации из организма. Особый интерес представляют собой атипичные реакции в ответ на слабо-и непатогенные виды микобактерий, не вызывающие в норме патологических реакций (так называемым «микобактериям окружающей среды»). Такого рода иммунодефицит описан в 1951 году J. Mimouni и в 1996 году вошел в каталог МакКьюсика в качестве отдельной нозологии (OMIM 209950) как синдром атипичных семейных микобактериозов (Beaucoudrey L. et al., 2010; Boisson-Dupuis S. et al., 2015). Заболевание характеризуется локальными или генерализованными воспалительными реакциями после БЦЖ-вакцинации, часто заканчивающимися летально и проявляющими менделевский характер наследования (Cottle L.E., 2011). Описаны мутации ряда генов, лежащие в основе нарушения активации IL-12/IFN--системы клеточного иммунитета (IL12B, IL12RB1, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 и NEMO), критически важные для функционирования Th1-опосредованного иммунного ответа.
Также важной отличительной особенностью в распространении ТБ является этническая специфичность, которая не может быть объяснена только с позиции средовых факторов и социальным неблагополучием населения. Специфичность проявляется, прежде всего, в том, что частота заболевания в этнически различных популяциях отличается, даже если они проживают на одной территории (Фрейдин М.Б. и др., 2006; Azad A., 2012). Вероятнее всего, это обусловлено тем, что генофонд отдельно взятой популяции формируется в результате длительного эволюционного процесса, когда происходит отбор «наиболее выгодных» генетических вариантов с точки зрения эндемичных для региона заболеваний. С этой точки зрения интерес представляет коренное население Республики Тува, долгое время прибывавшее в
изоляции и столкнувшееся с данным заболеванием относительно недавно (Кучер А.Н. и др., 2009; Пузырев В.П. и др. 2011; Кучер А.Н. и др., 2013; Степанов В.А. и др., 2014).
Несмотря на очевидные успехи, достигнутые в исследовании роли генов, ассоциированных с ТБ, остается много нерешенных вопросов в области диагностики, профилактики и лечения этого инфекционного заболевания. Отсутствует понимание генетических механизмов реактивации латентной инфекции, которая создает огромный резервуар опасного распространения заболевания на многие годы, недостаточность информации о редких генетических дефектах в генах системы клеточно-опосредованного иммунитета, связанных с неэффективностью иммунного ответа и развитию ТБ, неизученный популяционно-генетический аспект. Таким образом, исследование генетических особенностей в развитии данной патологии в этнически дифференцированных популяциях является актуальным научным направлением.
Степень разработанности темы исследования:
К настоящему моменту опубликовано множество работ по исследованию генетических основ подверженности ТБ. В свете данной проблемы изучались сотни самых различных генов в популяциях мира (Amirzargar A. et al., 2006; Coimbra Jr. C.E. et al., 2007; Zembrzuski V.M. et al., 2010; Robertus L.M. et al., 2011; Newport M.J., Finan C., 2011; Apt A.S. et al., 2017). Параллельно исследуются мутации генов системы IL-12/IFN- противоинфекционного иммунного ответа, приводящие к формированию патологических реакций на непатогенные микобактерии (синдрому атипичных семейных микобактериозов). Неполная пенетрантность ряда мутаций дает основания предположить их более широкое распространение в популяции и влияние на подверженность ТБ. Аспект этнически дифференцированной подверженности многофакторным заболеваниям, в том числе ТБ, активно обсуждается в литературе, в частности коллективом НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, который на протяжении длительного времени занимается изучением генетических факторов в развитии ТБ среди различных этнических групп России, в том числе у населения Республики Тува. В ряде районов было показано своеобразие генетических характеристик населения Республики и наличие у него предрасположенности к различным многофакторным заболеваниям (Golubenko M.V. et al., 2001; Рудко А.А. и др., 2006; Ондар Э.А., 2006; Фрейдин М.Б. и др., 2006; Кучер А.Н. и др., 2009; Бабушкина Н.П. и др., 2010; Рудко А.А. и др., 2011; Пузырев В.П. и др., 2011; Степанов В.А. и др., 2014).
Цель работы: оценить распространенность мутаций и редких вариантов генов атипичных семейных микобактериозов в сибирских популяциях (русские и тувинцы) и их связь с клиническими проявлениями туберкулеза.
Задачи:
-
Провести скрининг известных ТБ-ассоциированных мутаций и редких вариантов генов IL12B, IL12RB1, IFNGR1, IFNGR2, STAT1, NEMO, связанных с синдромом атипичных семейных микобактериозов, у больных ТБ русских и тувинцев.
-
Провести секвенирование экзонов выбранных генов системы IL-12/IFN- у пациентов с наиболее агрессивным течением первичного ТБ.
-
Оценить популяционную распространенность выявленных при секвенировании вариантов генов у жителей Сибирского региона (русские, тувинцы).
-
Провести анализ ассоциаций выявленных вариантов генов с развитием ТБ в изученных популяциях.
-
Оценить сцепление исследуемых полиморфных вариантов в этнически дифференцированных группах.
Научная новизна:
В результате настоящего исследования впервые проведено изучение
популяционной распространенности полиморфных вариантов генов атипичных семейных микобактериозов (IL12B, IL12RB1, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 и NEMO) среди русских жителей г. Томска и коренного населения Республики Тува. Адекватное функционирование белковых продуктов перечисленных генов играет ключевую роль в иммунном ответе на внедрение микобактерии, а именно в этих регионах заболеваемость ТБ высока. Установлена этническая специфичность распространенности аллелей и генотипов при сравнении частот генотипов и аллелей изученных вариантов генов у русских и тувинцев с частотами в различных популяциях мира, представленными в базе данных проекта «1000 геномов».
Проведена оценка значимости изучаемых полиморфных вариантов в развитии восприимчивости ТБ. Впервые в мире получены данные об ассоциации rs2066797 гена STAT1 с ТБ у русских жителей г. Томска. При разделении группы больных ТБ русских на подгруппы больных первичной и вторичной формами заболевания, установлено рисковое значение аллеля А гена STAT1 относительно развития вторичного ТБ. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о рисковом влиянии аллеля rs17882555*С гена IL12RB1 на развитие инфильтративной формы ТБ у русских жителей г. Томска.
Популяции русских и тувинцев имеют выраженные гаплотипические отличия согласно оценке блоков сцепления исследуемых полиморфных вариантов. При оценке межгенного взаимодействия отмечается отсутствие суммарного эффекта изучаемых генов в отношении развития ТБ.
Теоретическая и практическая значимость работы:
Полученные в ходе выполнения настоящего исследования данные существенно расширяют представления о генетической предрасположенности к ТБ и вкладе изучаемых вариантов генов атипичных семейных микобактериозов в формирование подверженности ТБ и его различным клиническим проявлениям. Полученные данные могут стать основой дальнейшего изучения генетической предрасположенности к ТБ,
в частности при расширении спектра рассматриваемых в патогенезе генов.
Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы в диагностике синдромов
атипичных семейных микобактериозов, прогнозировании течения заболевания и
определении тактики лекарственной терапии. Кроме того, результаты
исследовательской работы могут быть включены в учебные программы сертификационных циклов профессиональной переподготовки и повышения квалификации врачей-генетиков.
Методология и методы исследования:
Феномен атипичных семейных микобактериозов мог бы с иных нетрадиционных
позиций осветить некоторые стороны патогенеза ТБ. В основе методологии данного
исследования лежит предположение о том, что генетические дефекты, приводящие к
формированию клинических проявлений синдрома, могут быть распространены в
популяции с более высокой частотой, чем мутации; соответственно редкие
полиморфные варианты с выраженным влиянием на развитие ТБ могут быть весомой
причиной подверженности заболеванию в популяции в целом. В связи с этим для
установления степени значимости моногенной компоненты в структуре
наследственной подверженности ТБ в результате исследования выполнен скрининг мутаций генов, лежащих в основе нарушения IL-12/IFN--опосредованной активации клеточного иммунитета и оценена патогенетическая значимость вариантов в отношении развития ТБ в двух популяциях (русские и тувинцы).
Это исследование потребовало применения современных молекулярно-
генетических методов исследования ТБ: ПЦР-ПДРФ-анализ, секвенирование
первичной последовательности генов по методу Сэнгера. Для статистической
обработки полученных результатов использовался классический подход. Проверка
соответствия наблюдаемых частот генотипов ожидаемым при равновесии Харди-
Вайнберга проводилась с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот
аллеей и генотипов между исследуемыми группами использовали критерий 2 с
поправкой Йетса на непрерывность. В случаях, когда при анализе таблиц
сопряженности наблюдаемое значение хотя бы в одной ее ячейке не превышало 5,
использовался двусторонний точный тест Фишера. Об ассоциации генотипов с
развитием заболевания судили исходя из величины отношения шансов (OR). Оценка
сцепления в блоки для исследуемых полиморфных вариантов проводилась в
программе Haploview 4.2, с применением алгоритма «непрерывного гребня
неравновесия по сцеплению» (solid spine of LD). Анализ межгенных взаимодействий
проведен методом снижения многофакторной размерности в среде открытой
программы MDR v.1.1.0 (). Для обнаруженных
полиморфных вариантов, локализующихся в 3'- и 5'-UTR регионах была проведена оценка регуляторного потенциала in silico с использованием базы данных RegulomeDB, доступной он-лайн (). В базе учитываются экспериментальные данные проекта ENCODE, Chip-seq данные о распределении сайтов связывания для транскрипционных факторов в геноме, а также данные об экспрессии локусов количественных признаков.
Экспериментальные исследования выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием и экспериментальным биологическим материалом "Медицинская геномика" (НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (г. Томск)).
Положения, выносимые на защиту:
-
Среди больных (русские и тувинцы) с наиболее агрессивным клиническим течением ТБ отсутствуют мутации генов системы IL-12/IFN- (Gln32Ter; Gln376Ter; Arg213Trp; Ile87Thr; 1-bp и 4-bp Del, NT818; 2-bp Del, 278AG; Thr168Asn; 663Del27; Leu706Ser; Gln463His; Glu320Gln), которые по данным литературы связаны с синдромом атипичных семейных микобактериозов.
-
У детей с тяжелым первичным ТБ (русские) в возрасте до 18 лет не установлено носительство новых мутаций генов системы IL-12/IFN-, но идентифицировано 12 полиморфных вариантов исследуемых генов.
3. Представители популяций Сибирского региона (русские жители г. Томска и
коренные жители Республики Тува) характеризуются специфичностью
распространенности генотипов, аллелей и гаплотипов генов атипичных семейных
микобактериозов.
4. У русских жителей г. Томска полиморфный вариант rs2066797 гена STAT1
ассоциирован с развитием вторичной формы ТБ, а вариант rs17882555 гена IL12RB1
определяет особенности клинического течения заболевания. Исследуемые варианты
не оказывают влияния на предрасположенность ТБ у коренных жителей Республики
Тува.
Степень достоверности и апробация результатов:
Высокая степень достоверности данных, полученных в ходе выполнения настоящего исследования, обеспечивается, во-первых, достаточным объемом исследуемых популяционных групп в количестве 610 русских жителей г. Томска (из них 331 больной ТБ и 279 здоровых доноров) и 503 коренных жителя Республики Тува (238 больных ТБ и 265 здоровых доноров). Во-вторых, использованием современных молекулярно-генетических методов исследования и статистической обработки полученных результатов.
Апробация материалов диссертации:
Основные результаты диссертационного исследования были представлены и
обсуждены на VII Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием (Москва, 2010); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Курск, 2011); «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2012); The eighth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology (Новосибирск, 2012); XXIII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2013); VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону, 2014); European respiratory society congress (Мюнхен,
2014); International symposium human genetics (Новосибирск, 2014); International symposium systems biology and biomedicine (Новосибирск, 2016).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ «Вклад редких
вариантов генов противоинфекционного иммунитета в развитие туберкулеза у
человека» (соглашение №09-04-00558, 2009-2011); ФЦП «Генетическая
подверженность туберкулезу и его отдельным клиническим формам в Сибирских популяциях» (государственный контракт от 31.07.2009 №П443, 2009-2011); Гранта Президента РФ «Структура генетической подверженности туберкулезу в сибирских популяциях» (соглашение № МК-2115.2009.7, 2009-2010).
Публикации:
По теме опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 статьи – в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук и 1 – в зарубежном журнале. Также опубликовано 13 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных научных конференций.
Личный вклад автора:
Основные результаты настоящего исследования получены автором
самостоятельно (создание базы данных, подготовка образцов для молекулярно-
генетического анализа, проведение генотипирования в исследуемых группах,
секвенирование ДНК). Изучение литературы по теме диссертации,
экспериментальная работа, анализ, обобщение и статистическая обработка собственных результатов, написание диссертации выполнено лично автором. Диссертант участвовал на всех этапах в обсуждении полученных результатов и их опубликовании.
Структура и объем диссертации:
Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав (аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка условных сокращений, и указателя литературы, включающего 261 источник, из них 28 отечественных и 235 иностранных. Работа содержит 14 таблиц (и 2 таблицы в приложении) и 14 рисунков.
Роль IFN- и его рецепторов
Синдром атипичных семейных микобактериозов – редкое наследственное фенотипически гетерогенное расстройство иммунитета, в результате которого у здоровых в отношении других заболеваний индивидов формируются атипичные реакции на нетуберкулезные микобактерии (слабовирулентные в норме) [Frucht D.M., Holland S.M., 1996]. Пораженные индивиды чувствительны и к более вирулентному микроорганизму – M. tuberculosis. При этом чаще всего, к большинству других инфекционных агентов они устойчивы, за исключением Salmonellae, которые также являются внутриклеточными патогенами со схожими механизмами воздействия на зараженный организм [Alcais L. et al., 2005]. Подсчитано, что для 50% пораженных индивидов характерны тифоидные, но чаще нетифоидные генерализованные сальмонеллезы [Caragol I. et al., 2003]. Кроме того, встречаются случаи сочетанного инфицирования и другими внутриклеточными бактериями, такими как Nocardia и Listeria, грибками Histoplasma, Candida и Paracocidomyces, внутриклеточными паразитами Leishmania, Toxoplasma и некоторыми вирусами (цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса 3 типа (VZV) и др. [Al-Muhsen S., Casanova J.L., 2008; Edeer Karaca N. et al., 2012; Prando C. et al., 2013; Bustamante J. et al., 2014]. Описаны также случаи злокачественных новообразований у пациентов с данным синдромом: В-клеточной лимфомы, карциномой пищевода, плоскоклеточной карциномы кожи, саркомы Капоши, рака печени и шишковидной герминомы [Bustamante J. et al., 2014].
Считается, что существует корреляция между видами микобактерий, к которым чувствителен пациент, с определенным генетическим дефектом. Так, M. tuberculosis чаще встречаются у индивидов с недостаточностью IFNGR1, IL12R1, IL-12 [Jouanguy E. et al., 1997; Altare F. et al., 2001; Picard C. et al., 2002]. Быстро растущие штаммы (M. fortuitum, M. smegmatis, M. chelonae, M. abscessus, M. peregrinum) чаще региструют у детей с полным дефицитом IFNR1 и IFNR2. Сальмонеллезная инфекция чаще ассоциирована с дефицитом IL-12 и IL12R1 [Caragol I., Casanova J.L., 2003; Farnia P. et al., 2016]. Однако это наблюдение не является универсальным.
Причиной выделения данной нозологии можно считать повсеместное введение вакцинопрофилактики для детей. Вакцина представляет собой живой ослабленный штамм M. bovis (бацилла Кальметта-Герена), высоко гомологичный M. tuberculosis. Первый опыт ее применения у новорожденных зарегистрирован в 1921 году [Перельман М.И. и др., 2004]. Сначала она использовалась для вакцинации детей из очагов повышенного риска заражения: в семьях больных ТБ, неблагополучных районах городов. Однако по истечению нескольких лет безопасность и эффективность ее использования была доказана, и с 1974 года она включена в перечень прививок для новорожденных во всем мире.
После БЦЖ-вакцинации у некоторых детей проявлялись побочные эффекты в виде локальных (БЦЖ-итов) и генерализованных (БЦЖ-инфекций), которые обычно заканчивались летально [Cottle L.E., 2011]. Эти случаи были столь редки, что им не уделялось внимания врачей. Но в 1951 году J. Mimouni впервые описан синдром атипичных семейных микобактериозов [Casanova J.L., Abel L., 2002; Beaucoudrey L. et al., 2010; Cottle L.E., 2011]. Чаще всего клинические проявления начинались с лимфаденита шейных лимфатических узлов («золотуха»), поражений мягких тканей и костей [Newport M., 2003]. Это были идиопатические случаи диссеминированных БЦЖ-инфекций. Однако позднее исследователи начали сообщать о случаях, унаследованных от родителей (чаще всего являющихся родственниками) расстройств иммунитета и семейных случаях с более чем одним больным членом семьи. В 1964 году H. Engbaek впервые описал семейный случай фатального генерализованного инфицирования M. avium трех членов семьи в Дании, что привлекло внимание врачей [Engbaek H.C., 1964]. В 1976 году K. Heyne написал о сибсах в немецкой семье, у обоих наличествовала поствакцинальная генерализованная БЦЖ-инфекция. Им же впервые был освещен тот факт, что повышенная восприимчивость к M. tuberculosis также повышает риск развития сальмонеллезной инфекции: позднее у мальчика развился сальмонеллезный энтерит и остеомиелит [цит. по Newport M., 2003]. Интересен и случай, описанный в Праге: у трехлетнего мальчика, вакцинированного на третий день после рождения, развилась диссеминированная БЦЖ-инфекция с присоединением сальмонеллеза, ставшая фатальной по истечении следующих трех лет [Caragol I., Casanova J.L., 2003]. В 1981 году N. Ushiyama сообщил о двух сибсах с инфекцией M. avium [Ushiyama N. et al., 1981]. Позднее S. M. Holland и др. описали случай, когда три члена семьи мужского пола (в возрасте сорока восьми, тридцати одного и семи лет) имели диссеминированные инфекции, вызванные непатогенными микобактериями окружающей среды [Holland S.M. et al., 1994; Frucht D.M., Holland S.M., 1996; Frucht D.M. et al., 1999]. Подобные статьи стали активно публиковаться, описывая случаи со сходными клиническими проявлениями и дополняя описание клинической картины. Такие сообщения появляются все чаще и в последнее время, что наводит на мысль о необходимости корректирования применения противотуберкулезной вакцинации [Jouanguy E. et al., 1996; Caragol I. et al., 2003; zbek N. et al., 2005; Bustamante J. et al., 2007; Pereira S. et al., 2007; Pedraza-Sanchez S. et al., 2010; van de Vosse E. et al., 2010; Boisson-Dupuis S. et al., 2011].
В 1994 году был применен подход кандидатного картирования генов у детей с БЦЖ-итами с целью выяснения генетических основ данного состояния. Были описаны четверо детей из небольшой деревни на Мальте с клиническими проявлениями диссеминированных микобактериозов: двое сибсов, третий ребенок состоял с ними в отдаленном родстве, а с четвертым не было выявлено родственной связи. Первые трое пациентов родились в близкородственных браках, более того, обе семьи состояли в родстве друг с другом. Каждый из детей был инфицирован разными видами микобактерий (M. chelonae, M. fortuitum, и двумя различными штаммами M. avium), что свидетельствовало о наличии врожденного дефекта иммунной системы [Levin M. et al., 1995]. У пациентов было обнаружено нарушение регуляции функционирования моноцитов в ответ на действие эндотоксинов и IFN-, а также нарушена презентация антигенов. Высокая распространенность близкородственных браков на Мальте позволила предположить наличие редкой рецессивной мутации, унаследованной пациентами от общего предка. И уже через 2 года был описан первый генетический дефект, приводящий к формированию патологического фенотипа – мутация в гене IFNGR1 [Jouanguy E. et al., 1996; Newport M. et al., 1996].
Клинико-лабораторные методы
NEMO является регуляторной субъединицей ядерного фактора-B (NFB) – ингибитора киназного комплекса (IKK), который активирует ядерный фактор-B, участвующий в реализации воспалительных и иммунных реакций, клеточной выживаемости и других значимых метаболических путях [Li Q., Verma I.M., 2002]. Лиганд для CD40 экспрессируется на поверхности Т-клеток и повышает продукцию IL-12 моноцитами и дендритными клетками посредством с взаимодействия с CD40 на поверхности антиген-представляющих клеток, что приводит к активации NF-B/c-Rel-опосредованного метаболического пути и усилению продукции IL-12 [Filipe-Santos O. et al., 2006]. NFB – гетеродимер, связанный с IB в цитоплазме покоящихся клеток. Этот транскрипционный фактор активируется путем опосредованного взаимодействия c различными молекулами (например, липополисахаридами мембраны бактерий), или с рецепторами семейств TIR и TNFR, расположенными на клеточной поверхности многих типов клеток [Moynagh P.N., 2005; Ghamari E. et al., 2016]. После взаимодействия молекул с соответствующими рецепторами IKK фосфорилирует IB. Активированный фактор перемещается в ядро, обеспечивая продукцию различных цитокинов, среди которых и IL-12, вырабатываемый моноцитами после их стимуляции IFN-, продуцируемым Т-клетками [Catici D.A.M. et al., 2015]. Взаимодействие интерферона с рецепторами на поверхности моноцитов ведет к транслокации интерферон-активирующего фактора (GAF) в ядро и активации транскрипции [Haverkamp M.H. et al., 2014]. Более подробно этот процесс рассмотрен в разделе, описывающем интерферон и его рецепторы. Более того, данный транскрипционный фактор индуцирует транскрипцию провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, индуцибельных ферментов (например, ЦОГ-2), индуцибельной NO-синтазы, что критически важно для реализации врожденного иммунного ответа. Этот же фактор GAF инициирует продуцирование белков, регулирующих специфический иммунный ответ – главный комплекс гистосовместимости (MHC); костимуляторы, индуцирующие специфические иммунные реакции; а также цитокины, контролирующие пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов (IL-2, IL-12, IFN-) [Moynagh P.N., 2005].
Ген IKBKG, кодирующий NEMO (OMIM 300248), картирован на Х-хромосоме – Хq28, состоит из 10 экзонов и описано три возможных его варианта, первый экзон некодирующий. Далее располагаются последовательности, кодирующие два биспиральных домена (СС1 (93 Лейцин – 194 Глутамин) и СС2 (258 Метионин – 292 Лизин)), лейциновую «застежку» (LZ) (308 Тирозин – 344 Лизин) и структуру типа «цинковый палец» (ZF) (397 Цистеин – 417 Цистеин) [Puel A. et al., 2006].
В данном гене описано два типа мутаций: с частичной потерей функции гена (гипоморфные) и с полной потерей функции гена (аморфные). Аморфные мутации наследуются по доминантному типу и лежат в основе патогенеза синдром Блоха-Сульцбергера (семейная форма недержания пигмента) у женщин (OMIM 308300), в то же время они летальны для мужчин (что является причиной спонтанных абортов плодов мужского пола – носителей данных мутаций) [Conte M.I. et al., 2014]. Хотя эти мутации и не сопровождаются развитием иммунодефицита.
Гипоморфные мутации чаще всего являются причиной развития эктодермальной дисплазии – нарушения развития волос, зубов и экзокринных потовых желез, сопровождающийся иммунодефицитом у мальчиков [Dffinger R. et al., 2001], иногда с развитием остеопетроза и лимфатических отеков [Ramrez-Alejo N. et al., 2015]. Эти же мутации крайне редко встречаются у женщин. Гетерозиготные носители гипоморфных мутаций в целом не имеют более тяжелых клинических проявлений, чем недержание пигмента и редкие, конической формы зубы. Гипоморфные мутации дают вариативный клинический фенотип: эктодермальную дисплазию с/без иммунодефицита (OMIM 300291 и OMIM 300584, соответственно). У пациентов с иммунодефицитной формой описаны различные бактериальные (86% случаев), микобактериальные (44% случаев), вирусные и грибковые инфекции. Это обусловлено центральной ролью NEMO в метаболическом пути NF-B [Hanson E.P. et al., 2008]. Мутации в данном гене препятствуют передаче сигнала активации от рецепторов в ядро клеток. Так как сигналы рецепторов Т- и B-клеток также передаются через NF-B, данные пациенты характеризуются ослаблением и врожденного, и адаптивного иммунитета [Bohuslav J. et al., 1998; Liang Y. et al., 2004]. Иногда это проявляется гипогаммаглобулинемией и дефектами специфических антител к полисахаридным антигенам [Hanson E.P. et al., 2008; Vallabhapurapu S., Karin M., 2009]. Описанные в гене IKBKG мутации (гипо- или аморфные) в 40% случаев являются миссенс-мутациями [Filipe-Santos O. et al., 2006].
Данный ген был описан последним из группы генов, рассмотренных в настоящем исследовании, влияющих на формирование синдрома атипичных семейных микобактериозов – в 2006 году [Filipe-Santos O. et al., 2006]. Однако еще в 1991 году была описана семья с предположительным Х-сцепленным рецессивным типом наследования синдрома атипичных семейных микобактериозов, но молекулярных причин этого состояния в то время не было установлено [Holland S.M. et al., 1994]. Были сообщения о четверых пациентах, связанных родством по материнской линии, страдавших от тяжелых инфекций непатогенными микобактериями M. avium: двое взрослых братьев, страдающих от рецидивов микобактериоза (один из них болел ТБ легких); их сестра – без клинических признаков заболевания, но ее сын страдал от хронических рецидивов M. avium. Их общая мать перенесла ТБ легких без рецидивов. Эти данные указывали на наиболее вероятный Х-сцепленный тип наследования. Кроме того в том же исследовании были описаны четверо пациентов, не связанных родством: мужчина с инфекцией M. avium; две женщины с M. avium (одна из которых страдала от диссеминированного ТБ) и женщина с инфекцией M. kansasii. Позже было показано, что их моноциты не продуцируют адекватный уровень IL-12 при стимуляции фитогемаглютинином in vitro [Frucht D.M. et al., 1996; Frucht D.M. et al., 1999]. Также в 1991 году был описан непонятный тогда семейный случай кожного поражения M. avium у двух братьев. Тогда считалось, что это обычная ситуация у больных СПИДом, однако ни у одного из братьев не был выявлен ВИЧ. С помощью проб удалось выявить возбудителя и после назначения антибиотиков удалось достичь улучшения [Nedorost S.T. et al., 1991].
Были идентифицированы две мутации в регионе, кодирующем лейциновую «застежку» гена NEMO, обе они снижают Т-зависимую, CD40-инициированную, NF-B/c-Rel-опосредованную индукцию выработки IL-12. В результате недостаточной продукции данного цитокина после стимуляции Т-клеток снижается выработка IFN-, что предрасполагает индивидов к развитию микобактериальных инфекций. В большинстве случаев у пациентов определяется M. avium. Прогноз заболевания вариабелен, и назначение IFN- может способствовать его улучшению [Filipe-Santos O. et al., 2006].
В 2006 году были опубликованы результаты семейного исследования ТБ. В нем были рассмотрены три семейных родословных: семьи из США, Франции и Германии. В американской семье описан мальчик, сын в неродственном браке, с рецидивами M. avium и отсутствием ответа на терапию антибиотиками. У него была картирована мутация g.944A C, приводящая к аминокислотной замене p.Glu315Ala (E315A). В том же исследовании в двух других семьях, описана замена g.956G A, приводящая к p.Arg319Gln (R319Q). Пробанд из французской семьи – 8-летний мальчик с эпизодом ТБ легких, благополучно пролеченный препаратами. Пробанд из немецкой семьи – мальчик, не подвергавшийся БЦЖ-вакцинации, но с симптомами синдрома атипичных семейных микобактериозов [Filipe-Santos O. et al., 2006].
Межпопуляционные различия в распространении частот аллелей и генотипов генов антимикобактериального иммунитета
Сходные результаты были полученные в Японии: генотип TT повышал транскрипционную активность гена IFNGR1. Кроме того, он же был ассоциирован с повышенным риском развития катаракты у больных атопическим дерматитом (OR=2,57; p=0,0004) [Matsuda A. et al., 2007]. Однако в другом исследовании, при рассмотрении уровня транскрипции этой же субъединицы в клеточной линии гепатобластомы HepG2 у больных хроническим вирусным гепатитом В были получены прямо противоположные данные. Уровень экспрессии IFNGR1 С в клеточной линии HepG2 был выше, чем в клетках с мутантным генотипом (p=0,001). Более того, мутантный аллель T был ассоциирован с персистированием вируса гепатита в популяции Китая [Zhou J. et al., 2009]. Наконец, данный вариант исследовался в свете развития герпетических осложнений при атопическом дерматите, и была показана ассоциация аллеля T со сниженной продукцией IFN- (p=0,026) [Leung D.Y.M. et al., 2011]. Также замена rs2234711 в промоторе гена рассматривалась при изучении болезни Хашимото в Португалии и не показала значимых различий при сравнении групп больных и здоровых доноров [Dures C. et al., 2014].
Полиморфный вариант rs7749390 (c.85+10T C) находится в сайте сплайсинга, что позволяет предположить влияние замены на прохождение сплайсинга белкового продукта. Он был изучен в исследовании индийского висцерального лейшманиоза в Судане, но не было показано значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов данного полиморфного варианта между группами больных и здоровых [Salih M.A. et al., 2007]. Более позднее исследование осложнений лечения того же заболевания также не установило влияния данного полиморфного варианта на развитие осложнений у пациентов после излечения [Salih M.A. et al., 2014]. Установлена ассоциация варианта rs7749390 с развитием атопического дерматита с сопутствующими герпетическими поражениями. Полиморфизм rs7749390 был ассоциирован с повышением выработки IFN- (p=0,030) и снижением риска развития герпетических поражений при наличии атопического дерматита (p=0,033). Гаплотип, образованный двумя полиморфными вариантами rs10457655 и rs7749390 оказывает протективное действие относительно развития герпетических поражений при атопическом дерматите (rs10457655 A rs7749390 G). Частота гаплотипа составила 13,2% и 25,5% в группах с сопутствующими поражениями и без них, соответственно (p=0,00057) [Leung D.Y.M. et al., 2011].
Данные о роли полиморфных вариантов rs2234711 и rs7749390 в развитии ТБ противоречивы: одни исследователи описывают отсутствие их ассоциации с развитием данного заболевания в Гамбии [Awomoyi A.A. et al., 2004] и Японии [Kusuhara K. et al., 2007]. Другие – пишут об ассоциации rs2234711 с развитием данной патологии в Западноафриканской популяции; более того, генотип СС был признан протективным относительно прогрессирования инфекции – OR=0,75; 0,95% CI: 0,59-0,97; p=0,02 [Cooke G.S. et al., 2006]. К такому же заключению пришли исследователи в Уганде: тот же генотип СС показал значимую ассоциацию с развитием активного ТБ легких [Stein C.M. et al., 2007]. Однако этот же вариант не показал ассоциации с развитием патологии у вьетнамцев Ханоя [Hijikata M. et al., 2012]. Для полиморфизма rs7749390 была получена ассоциация с развитием ТБ легких у китайцев провинции Хан: носительство генотипа АА являлось рисковым для развития заболевания (OR=1,86; 0,95% CI: 1,04-3,31). Причем вариант rs2234711 в том же исследовании не показал значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов в группах больных ТБ и здоровых доноров [He J. et al., 2010]. Позже еще одно исследование в Китае, в провинции Янцзы, показало ассоциацию варианта rs7749390 с риском развития ТБ. Установлена доминантная модель снижения риска развития легочного ТБ на 20% среди носителей генотипов AG/AA (OR=0,80; 0,95% CI: 0,68-0,94; p=0,006) [L J. et al., 2014].
Кроме того, полученные в ряде исследований данные, свидетельствуют о сцеплении вариантов rs2234711 и rs7749390 в популяциях Западной Африки (D 0,75) [Cooke G.S. et al., 2006] и Китае (D =0,83) [He J. et al., 2010]. По разным литературным сообщениям, в этот же блок, помимо рассматриваемых двух замен, входит еще одна-две замены: rs3799488 (D=0,98; r2=0,94) [L J. et al., 2014] или rs1327474 и rs41401746 [He J. et al., 2010]. Описание влияния гаплотипов этих блоков сцепления на риск развития ТБ противоречиво. Так, J. L с коллегами, исследуя группу китайцев, установил сцепление с вариантом rs3799488 (однако в блок не входил вариант rs7749390), по его данным минорный гаплотип rs2234711T–rs3799488C ассоциирован с риском развития ТБ легких (OR=1,24; 0,95% CI: 1,09-1,41; p=0,001) [L J. et al., 2014]. Гаплотип rs2234711C– rs1327474A–rs7749390A–rs41401746TT является рисковым относительно развития легочного поражения у китайцев (OR=3,96; 0,95% CI: 1,90-8,21) [He J. et al., 2010].
В настоящем исследовании была обнаружена замена в гене STAT1: rs2066797 (g.29554A G; c. 364-23A G). Она локализована в девятом интроне гена, что делает возможным ее регуляторное влияние на транскрипцию гена. Однако согласно базе данных RegulomeDB балл=6, что говорит о минимальной вероятности влияния данного варианта на экспрессию и функциональную активность белкового продукта. Частота минорного аллеля G полиморфизма варьирует от 5% в популяциях Европы до 17% в популяциях африканцев и коренных американцев. Этот генетический вариант плохо изучен относительно развития заболеваний и согласно базе данных 1000 Genomes Project не было исследований, показавших сцепление данной замены с какими-либо другими вариантами.
Анализ межгенных взаимодействий у больных туберкулезом в различных популяциях
Кроме того, примечательно, что в рассматриваемых этнических группах, наилучшими выбраны модели, содержащие разные генетические варианты. Что косвенно также может свидетельствовать о различной генетической основе подверженности в различных этносах.
Проводимые ранее исследования с использованием MDR анализа свидетельствовали о возможной высокой значимости межгенных взаимодействий в развития многофакторных заболеваний вообще и ТБ в частности [Daya M. et al., 2015]. Так при изучении китайцев был получены данные о высоком кумулятивном эффекте rs2430561 гена IFNG, rs3212227 гена IL12B и rs2243115 гена IL12А в отношении развития ТБ легких: значение точности было на уровне 70,15%, а коэффициент перекрестной проверки – 98% [Wang J. et al., 2010]. Этот же подход применялся в ходе крупного исследования 25 полиморфизмов у больных представителей разных рас с различными внелегочными очагами ТБ в 2010 году (поражения лимфатической системы, плевры, костей, перикарда, туберкулезный менингит, поражения ЖКТ, урогенитальной системы и гортани). Полученные данные показали, что микросателлит гена TLR2 (GT) с точностью 61% связан с заболеваемостью любыми типами ТБ и с точностью 63% - с заболеваемостью у афроамериканцев; причем результаты не изменились при включении в модель уровня CD4+ лимфоцитов и индекса массы тела [Motsinger Reif A.A. et al., 2010]. Позже были получены двухлокусные модели для пациентов из Индии: установлен высокий кумулятивный эффект полиморфных вариантов генов TGF- – IL-4 и TNF- – IL-2 в отношении развития ТБ [Sivangala R. et al., 2014]. Также получены двухлокусные модели низкого и высокого риска развития ТБ на основании данных для полиморфизмов по сайтам узнавания ферментами рестрикции BsmI и FokI гена рецептора витамина D (VDR), генотип BB и bb в сочетании с любым генотипом FokI (FF, Ff и ff) повышали риск развития ТБ [Joshi L. et al., 2014]. В ходе исследования, проведенного в Шанхае, удалось установить, что наилучшими в отношении латентной ТБ инфекции являются однолокусная модель (rs5743836) со сбалансированной точностью 56% и CV=9/10; двухлокусная модель (rs3804100, rs1898830) со сбалансированной точностью 69% и CV=10/10; и трехлокусная (rs3804100, rs1898830, rs10759931) со сбалансированной точностью 80% и CV=10/10. Для развития легочного ТБ наилучшими были: однокомпонентная модель (БЦЖ-вакцинация) с предсказательной точностью 61%, двухлокусная модель (rs10759932, rs7873784) со сбалансированной точностью 76% и CV=10/10 и трехлокусная модель (rs10759932, rs7873784, rs10759931) со сбалансированной точностью 84% и CV=10/10 [Wu L. et al., 2015].
Генетические исследования инфекционных заболеваний очень важны, так как позволяют выявлять новые гены-кандидаты подверженности этим заболеваниям, а это, в свою очередь, способствует пониманию молекулярных механизмов, определяющих защитный иммунный ответ против возбудителя, помогая установить относительный вклад врожденных и приобретенных иммунных реакций в борьбе с заболеванием. Врожденный иммунитет формирует защитный барьер против микобактерии. Эта защита реализуется посредством Th-1 клеточного пути с участием интерферона, активации макрофагальных клеток и построению гранулем. Баланс субпопуляций Т-клеток на уровне гранулем регулирует иммунную реакцию, инфекционные патогенетические пути и противоинфекционный ответ [Hamzaoui A. et al., 2014]. Важным результатом генетических исследований ТБ за последние несколько десятков лет является обнаружение генов, ассоциированных с подверженностью заболеванию и особенностями его клинического течения. Среди этих генов, прежде всего гены цитокинов, хемокинов и их рецепторов, гены апоптоза, мембранных транспортеров и др. Для некоторых генов выявлен эффект «главного гена» в подверженности ТБ. Несмотря на очевидный прогресс в исследовании генетической подверженности ТБ и описании множества генов, имеющих отношение к повышенной восприимчивости к M. tuberculosis, целостное понимание данной проблемы остается все еще нерешенной задачей. В настоящее время в отношении генетики подверженности ТБ исследования развиваются в нескольких направлениях, среди которых и рассмотрение восприимчивости к данной патологии в свете концепции МФЗ, и изучение генома возбудителя заболевания, и изучение индивидов с повышенной чувствительностью к непатогенным в норме микобактериям. Используя современные методы генетических исследований, удалось достичь значительных успехов в данном направлении. В настоящее время ведется активное исследование редких мутаций генов системы противоинфекционного клеточного иммунитета. Согласно предварительной оценке, доля детей с менделевской подверженностью ТБ среди детей с диссеминированной формой заболевания может составлять от 3 до 45% [Alcas A. et al., 2005]. Многие согласны с этим, считая что, несмотря на значительное продвижение в понимании генетической этиологии данного синдрома, по некоторым данным, еще у 50% пациентов с клиническими проявлениями атипичных микобактериозов не идентифицирована причинная мутация [Al-Muhsen S., Casanova J.L., 2008; Salem S., Gros P., 2013]. На сегодняшний день описаны более 140 мутаций в различных генах с полной или частичной пенетрантностью, лежащие в основе нарушения активации клеточного иммунитета, что в свою очередь приводит к нетипичным формам микобактериальных инфекций у человека, проявляющих моногенный характер наследования. А это, в свою очередь, повышает риск развития у ТБ данных индивидов.
Другим важным направлением генетических исследований является вопрос реактивации инфекции. Несмотря на все доказательства взаимосвязи иммунитета человека и развития вторичного ТБ, генетический его контроль может существенно отличаться от первичной инфекции [Alcas A. et al., 2005; Alcas A. et al., 2010; Cobat A. et al., 2010]. Как предполагается, вклад мутаций исследуемых генов в развитие активного процесса может быть гораздо шире – в том числе и в развитие ТБ у взрослых.
Таким образом, идентификация генетических факторов, определяющих подверженность человека туберкулезной инфекции и особенности развития заболевания, является актуальным направлением генетики многофакторных заболеваний. Обнаружение специфических генетических маркеров, ассоциированных с особенностями туберкулезного процесса, существенно расширит представления о патогенезе инфекционного заболевания, влиянии наследственных факторов в развитии различных клинических проявлений. Результаты таких исследований существенны для разработки методов профилактики, а также персонализированных методов коррекции нарушений реакции иммунной системы.