Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Филогеография как современное направление генетических и зоологических исследований 12
1.1.1. История становления и современные подходы филогеографии 12
1.1.2. Нерешенные проблемы филогеографии наземных беличьих (Marmotini) 14
1.2. Гибридизация как эволюционный фактор 16
1.2.1. Современные представления о гибридизации в природе 16
1.2.2. Генетические исследования гибридизации наземных беличьих (Marmotini) 23
1.3. Краткая характеристика исследованных видов наземных беличьих 27
1.3.1. Marmota baibacina Kastschenko, 1899. Серый или алтайский сурок 27
1.3.2. Marmota sibirica Radde (1862). Тарбаган или монгольский сурок 28
1.3.3. Urocitellus undulatus Pallas, 1778. Длиннохвостый суслик 30
1.3.4. Spermophilus pallidicauda Satunin, 1903. Бледнохвостый суслик 34
1.3.5. Spermophilus dauricus Brandt, 1843. Даурский суслик 37
1.3.6. Spermophilus alaschanicus Bchner, 1888. Алашаньский суслик 40
1.4. Эколого-географические особенности Монголии и Южной Сибири 41
Глава 2. Материал и методы исследования 44
2.1. Материал исследования 44
2.2. Методы сбора и обработки материала в полевых условиях 45
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 46
2.3.1. Выделение геномной ДНК 47
2.3.2. Фрагменты ДНК, использованные в качестве маркерных 48
2.3.4. Секвенирование 49
2.3.5. Рестриктный анализ 50
2.3.6. Анализ маркеров ядерного генома методом ПНР-диагностики 51
2.4. Анализ молекулярно-генетических данных 52
2.4.1. Статистическая обработка результатов и построение филогенетических древ 52
2.4.2. Анализ пространственного распределения филогрупп и сопряженности с эколого-географическими характеристиками мест обитания 53
Глава 3. Результаты 54
3.1. Молекулярно-генетическая изменчивость широкоареальных видов наземных беличьих Монголии и Южной Сибири 54
3.1.1. Изменчивость контрольного региона мтДНК тарбагана (М. sibirica) 54
3.1.2. Молекулярно-генетическая изменчивость длиннохвостого суслика (U. undulatus) 58
3.1.3. Изменчивость контрольного региона мтДНК бледнохвостого суслика (S. pallidicauda) 63
3.1.4. Изменчивость контрольного региона мтДНК номинативного подвида даурского суслика (S. d. dauricus) 67
3.2. Вторичные контакты двух пар видов наземных беличьих 70
3.2.1. Распределение молекулярно-генетических маркеров в зоне гибридизации сурков М. sibirica и М. baibacina 70
3.2.2. Генетическое типирование сусликов в зоне вторичного контакта S. pallidicauda и S. alaschanicus 75
3.3. Реконструкция филогенетических отношений в роде Spermophilus s. str. по данным изменчивости гена цитохрома Ъ 78
Глава 4. Обсуждение 82
4.1. Филогеография широкоареальных видов наземных беличьих Монголии и Южной Сибири 82
4.1.1. Филогеография тарбагана (M. sibirica) 82
4.1.2. Филогеография и подвидовая систематика длиннохвостого суслика (U. undulatus) 84
4.1.3. Филогеография бледнохвостого суслика (S. pallidicauda) 86
4.1.4. Генетическая структура номинативного подвида даурского суслика (S. d. dauricus) 87
4.1.5. Сравнительная филогеография наземных беличьих в связи с динамикой степных экосистем на территории Монголии 90
4.2. Гибридизация в зонах вторичных контактов сурков и сусликов Монголии 96
4.2.1. Генетические особенности и факторы поддержания видовой самостоятельности при гибридизации сурков М. baibacina и М. sibirica 96
4.2.2. Интенсивность гибридизации в зоне вторичного контакта сусликов S. pallidicauda и S. alaschanicus 100
4.2.3. Сравнительный анализ гибридизации в зонах вторичных контактов двух пар видов наземных беличьих Монголии 101
4.3. Филогенетические взаимоотношения S. pallidicauda и S. alaschanicus и положение сусликов Монголии на филогенетическом древе рода Spermophilus s. str 103
Выводы 107
Список литературы 109
Приложения 129
- Современные представления о гибридизации в природе
- Изменчивость контрольного региона мтДНК тарбагана (М. sibirica)
- Реконструкция филогенетических отношений в роде Spermophilus s. str. по данным изменчивости гена цитохрома Ъ
- Филогенетические взаимоотношения S. pallidicauda и S. alaschanicus и положение сусликов Монголии на филогенетическом древе рода Spermophilus s. str
Современные представления о гибридизации в природе
Одной из наиболее актуальных проблем в эволюционной биологии является анализ роли гибридизации в видообразовании. Под влиянием различных (климатических, антропогенных и др.) факторов происходят значительные изменения мест обитания видов, иногда приводящие к смыканию ареалов форм, ранее изолированных в пространстве и развивавшихся парапатрически. Области перекрывания ареалов форм, дивергировавших в условиях изоляции, получили название вторичных контактов. В результате вторичного контакта при недостаточном развитии или нарушении изолирующих барьеров между контактирующими формами происходит скрещивание их представителей с появлением жизнеспособного потомства смешанного происхождения, что может приводить к формированию зоны гибридизации (Barton, Hewitt, 1985; Abbott et ah, 2013). Эти зоны называют «естественными лабораториями для эволюционных исследований» (Hewitt, 1988; Barton, 2001) и «окнами эволюционного процесса» (Harrison, 1990) потому, что их исследование позволяет получить уникальные сведения об особенностях процессов дивергенции, видообразования (Harrison, 1993; Butlin, 1998) и механизмах поддержания видовой самостоятельности (Shurtliff, 2013).
Развитие молекулярно-генетических методов в последнее время превратило процесс изучения генетических особенностей гибридной зоны в рутинную процедуру, а число обнаруженных случаев естественной гибридизации и публикаций посвященных этому вопросу возрастает экспоненциально (Schwenk et al, 2008; Shurtliff, 2013). Механизмы поддержания видовой самостоятельности, особенности реализации прекопуляционной и посткопуляционной изоляции в условиях гибридизации, направление и интенсивность потоков генов между контактирующими формами, их природа и следствия разнообразны, до конца не ясны и поэтому вызывают наибольший интерес (Harrison, Larson, 2014).
В биологической концепции вида репродуктивная изоляция родственных форм рассматривается в качестве одного из основных критериев видовой самостоятельности. Соответственно, гибридизация признается исключительным случаем (Майр, 1974).
По мере обнаружения и исследования новых гибридных зон и накопления знаний о частных случаях гибридизации изменились представления о роли гибридизации в эволюционных преобразованиях и видообразовании. Гибридизационные процессы сейчас рассматриваются в качестве одного из факторов увеличения генетического разнообразия и материала для эволюции (Harrison, 1989; Avise, 1994;Даревский, 1974; Мина, 1980; Крюков и др., 2001). К настоящему времени накопилось много фактов, свидетельствующих о значительной роли ретикулярных процессов в эволюции многих видов (Arnold, 2004).
Последствия гибридизации могут проявляться различным образом - от поглощения одним из гибридизирующих видов другого, до появления нового гибридогенного вида или увеличения генетического разнообразия и экологической пластичности исходных видов. Повышение генетической и фенотипической изменчивости в гибридной популяции вследствие вторичного контакта способствует быстрой экспансии в неиспользуемые экологические ниши до их заполнения, сопровождающейся быстрым установлением барьеров между дивергирующими группами (Shurtliff, 2013).
До появления генетических методов особенно много внимания исследователями уделялось разработке универсальной классификации гибридных зон, с использованием различных характеристик в качестве определяющих признаков. Пространственные особенности зон вторичных контактов и доля особей смешанного происхождения в районе гибридизации легли в основу классификации гибридных зон, разработанной А. П. Крюковым (1990), которая кажется нам наиболее приемлемой (рис. 1). Анализ различных способов классификации и их особенностей проведен Боркиным и Литвинчуком (2013), которые в итоге рассматривают три больших класса вторичных контактов: случайную гибридизацию, гибридные зоны и зоны клинальной изменчивости.
Существуют общие закономерности гибридизации во всех группах животных. При этом, обнаружено влияние особенностей онтогенеза на характер взаимодействий и гибридизации в различных классах. Длительное время считалось, что у млекопитающих межвидовая гибридизация - редкое явление, поскольку живорождение, геномный импринтинг и другие механизмы, обеспечивающие естественные барьеры между видами, снижают возможность появления жизнеспособных гибридов (Mallet, 2005). Однако в связи с широким применением молекулярно-генетических методов за последние 30 лет у млекопитающих выявлены многочисленные случаи гибридизации и их число продолжает расти (Shurtliff, 2013). Некоторые авторы предполагают, что явление гибридизации распространено относительно равномерно в животном мире (Schwenk et al, 2008).
Влияние гибридизации на вступающие в контакт формы неоднозначно и зависит от комплекса факторов, которые весьма разнообразны, и взаимодействие которых делает каждый отдельный случай гибридизации во многом уникальным.
В пределах политипического вида вторичные контакты между разными ранее изолированными формами приводят к различным результатам. Только применение цитогенетических, и молекулярно-генетических методов позволило разобраться в родственных взаимоотношениях многочисленных форм надвидового комплекса домовой мыши {Mus musculus). Центром возникновения группы признается Северная Индия, откуда различными путями происходило расселение дивергирующих форм в виде нескольких волн колонизации (Boursot et al, 1996; Din et al, 1996). Интенсивно изучаемая область вторичного контакта между М. musculus и М. domesticus в Западной Европе представляет собой зону напряжения (tension zone, Key, 1968), обусловленную частичным сохранением изолирующих барьеров и отбором против гибридов (Boursot et al, 1993; Teeter et al, 2010). В Закавказье, тем не менее, несколько форм (М. musculus s.str., М. domesticus и М. castaneus) образуют широкую зону гибридизации, где показано значительное взаимопроникновение геномов контактирующих форм (Милишников и др., 2004). Комплексным исследованием особенностей обонятельных сигналов (прекопуляционные механизмы) и экспериментами по скрещиванию в лабораторных условиях (посткопуляционные механизмы) выявлено ассиметричное развитие изолирующих барьеров у подвидов М. musculus (Мальцев и др., 2015). Действие полового отбора может способствовать ассиметричному взаимопроникновению геномов гибридизирующих форм, способствует видообразованию (Coyne, Orr, 1998).
С помощью молекулярно-генетических методов показана гибридогенная природа мышей М. musculus molossinus с о. Хоккайдо. Эта форма имеет смешанный геном, сформировавшийся в результате вторичного контакта и гибридизации М. т. musculus и М. т. castaneus (Yonekawa et ah, 1988). В этом случае эволюционное преимущество гибридогенного генома, привело к возникновению новой формы.
В случае отбора в пользу гибридных особей зачастую происходит повышение их адаптивной пластичности и радиации. В Северной Америке тундровый карибу (Rangifer tarandus groenlandicus) совершает масштабные сезонные миграции. В отличие от него лесной карибу (R. t. caribou), обитающий в бореальных лесах, не перемещается на дальние расстояния. После окончания последнего ледникового максимума, когда эти две формы были разделены ледовым щитом, между ними образовалась зона вторичного контакта в канадских Скалистых горах (McDevitt et al, 2009). Обнаружено, что популяции R. t. caribou в этой области несут гаплотипы мтДНК обоих подвидов, а исследование микросателлитов выявило гибридную природу их ядерного генома. Кроме того, была показана связь между гаплотипом мтДНК и поведением оленей. Особи карибу из Скалистых гор, несущие гаплотип мтДНК тундрового подвида, как правило, совершают сезонные миграции между альпийской тундрой и бореальными лесами, что является поведенческой адаптацией, позволяющей избегать областей с высоким снежным покровом зимой.
Изменчивость контрольного региона мтДНК тарбагана (М. sibirica)
В выборку для исследования внутривидовой генетической изменчивости М. sibirica включены образцы от 41 особи тарбагана из 21 точки отлова (рис. 2) и 37 сурков из совместного поселения тарбагана и серого сурка, несущие мтДНК М. sibirica (Приложение 1). Была определена первичная нуклеотидная последовательность полноразмерного (998 - 999 п.н.) контрольного региона мтДНК у всех 78 исследованных особей. В выборке обнаружено 34 гаплотипа данного маркера. Все исследованные популяционные выборки обладают уникальным набором гаплотипов. Содержание нуклеотидов в среднем составило: А - 30,0%, Т - 31,9%, С - 25,2%, G - 12.9%. Количество вариабельных сайтов составило 43 (4,3%), из которых 28 (2,8%) являются парсимониально информативными. При построении филогенетических реконструкций в качестве внешней группы были использованы последовательности CR S. dauricus и М. camtschatica. Топологии филогенетических деревьев, полученных методами ML, NJ и BI оказались сходны.
Все гаплотипы М. sibirica образуют единый кластер на филогенетическом древе, распадающийся на две крупные клады (рис. 7, часть А), средняя дистанция между которыми составляет Adp = 0,016 ± 0,003. Одна из этих клад (Е) объединяет гаплотипы зверьков из восточной части ареала (Читинская обл. РФ и аймаки Дорнод, Сухэ-Батор, Хэнтий, Дундговь, Тов Монголии), где населяют восточномонгольские и даурские степи и горную систему Хэнтэя. Другая клада (W) объединяет гаплотипы тарбаганов из западной части ареала, расположенной на территории аймаков Булган, Увэрхангай, Баянхонгор, Архангай, Завхан, Ховсгел, Уве, Баян-Улгий Монголии. Места обитания представителей западной группы приурочены к горным системам Хангая и Монгольского и Гобийского Алтаев и межгорным понижениям с всхолмленным рельефом.
В восточной группе не проявляется четкой филогеографической структуры. Большинство гаплотипов кластеризуются вне зависимости от географического расположения точек отлова с низкими значениями бутстрэп-поддержек ветвей. Это согласуется с построением сети гаплотипов, где в пределах восточной группы гаплотипов образуется сетчатая структура со сложной топологией и циклическими связями между гаплотипами (рис. 8). Единственная ветвь в переделах этой группы, со статистическими поддержками близкими к максимальным, объединяет гаплотип (14gal), принадлежащий одному из двух зверьков, добытых в Гобийском Алтае и гаплотип (15han) тарбагана, добытого на восточном макросклоне Хангайской горной системы.
Тарбаганы из популяций с западной части ареала объединяются со значимыми статистическими поддержками (85%-89%). Филогеографическая структура этой филогруппы выражена более четко, чем восточной (рис. 8). Большинство гаплотипов сурков из северной и центральной частей Хангайской горной системы ("Хангай", рис. 9) объединяются в отдельную ветвь с поддержками более 50% ML и максимальным значением обратных вероятностей BI. Второй кластер ("Монгольский Алтай") объединяет тарбаганов из популяций Монгольского Алтая. Генетические дистанции между этими кластерами составляют dp = 0.005±0.002. Гаплотипы 7h и 8h сурков с южных предгорий Хангая (кроме гаплотипа 15h, который входит в кластер Е) образуют отдельную ветвь. В эту группу также вошел гаплотип 9gal одного из двух сурков, отловленных в Гобийском Алтае. Последний образует отдельную ветвь с высокими статистическими поддержками с одним из гаплотипов (8h) с южного макросклона Хангая.
Несмотря на различную структуру выявленных групп их внутригрупповые генетические дистанции различаются незначительно: для восточной группы dp = 0.005±0.001, а для западной dp = 0.004±0.001.
Популяционно-генетические характеристики исследованных выборок представлены в таблице 2. В восточных популяциях гаплотипическое разнообразие на 27% выше, чем в западных при равном уровне нуклеотидного разнообразия и среднего количества нуклеотидных замен. Высокое отрицательное значение Fs указывает на возможное относительно недавнее увеличение численности популяции и расширение восточной части ареала.
Реконструкция филогенетических отношений в роде Spermophilus s. str. по данным изменчивости гена цитохрома Ъ
Была определена последовательность гена cytb (1140 п.н.) у восьми особей алашаньского суслика (S. alaschanicus). Нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных NCBI (GenBank, КР279920- КР279927). Содержание нуклеотидов, в среднем, составляет: Т - 33.5%; С - 25.2%; А - 28.9%; G - 12.5%. В выборке особей алашаньского суслика имеется четыре гаплотипа, вариабельными оказались 657-ая, 721-ая и 1041-ая позиции. Средняя внутривидовая генетическая изменчивость S. alaschanicus составляет 0.11%.
Анализ изменчивости последовательностей гена cytb алашаньского и других видов сусликов показал, что S. alaschanicus значительно отличается на молекулярно-генетическом уровне от других видов (межвидовые генетические дистанции составляют 0.0954-0.1145 (табл. 9). В том числе этот вид хорошо обособлен от S. pallidicauda (dp = 0.1025). Средняя межвидовая генетическая дистанция в группе исследованных таксонов сусликов составляет dp = 0.08422.
Филогенетические деревья, полученные разными методами, различаются незначительно. Состав и положение видовых кластеров совпадают и имеют высокие статистические поддержки на обоих деревьях. Выявляется 13 форм сусликов, образующих отдельные ветви с высокими статистическими поддержками и имеющих молекулярно-генетические дистанции, соответствующие видовому уровню (рис. 21). Все образцы, за исключением экземпляров, относящихся к S. relictus, кластеризуются в соответствии со своей видовой принадлежностью по морфологии. Представители S. relictus, относящиеся к подвидам S. г. relictus и S. г. ralli, образуют отдельные независимые ветви и значительно удалены друг от друга (d = 0.0398).
С высокой статистической поддержкой выделяются кластеры пустынно-степных сусликов (S. brevicauda, S. erythrogenys, S. fulvus, S. pallidicauda и S. relictus, группа А), малых сусликов (S. pygmaeus и S. musicus, группа В) и восточных азиатских сусликов (S. alaschanicus и S. dauricus, группа С). Топология хорошо поддержанных кластеров на разных деревьях сходна. Топология длинных ветвей, образуемых малоазийским (S. xantoprymnus), европейским (S. citellus), крапчатым (S. suslicus) сусликами, и группой малых сусликов (S. pygmaeus и S. musicus) - при достоверном уровне обратных вероятностей не поддерживается значениями бутстрэпа.
Филогенетические взаимоотношения S. pallidicauda и S. alaschanicus и положение сусликов Монголии на филогенетическом древе рода Spermophilus s. str
Наши данные не подтверждают объединение S. alaschanicus и S. pallidicauda на первом филогенетическом древе Sciuridae, построенном на основании молекулярно-генетических данных (cytb) (Harrison et al, 2003). Проведенный нами критический анализ материала, использованного в упомянутой работе, показал, что образцов алашаньских сусликов в нем не было, а экземпляр, считавшийся таковым, по кариотипу оказался бледнохвостым сусликом (Кораблев и др., 2006). По результатам секвенирования контрольного региона мтДНК (CR) митотип именно этого экземпляра также кластеризуется вместе с другими бледнохвостыми сусликами (см. п.п. 3.1.3). Это исключает, в данном случае, интрогрессию мтДНК S. alaschanicus в результате межвидовой гибридизации, обнаруженной ранее у этих видов (Кораблев и др., 2006).
Согласно результатам нашего исследования, наиболее близким родственником алашаньского оказался суслик даурский (рис. 21, группа С). Эти виды образуют отдельную филогрупппу с максимальными статистическими поддержками. Несмотря на очевидную филогенетическую связь, дивергенция S. alaschanicus и S. dauricus произошла сравнительно давно, о чем свидетельствует высокое значение генетической дистанции между этими видами, которая составляет dp = 0.954, что на порядок выше средней межвидовой генетической дистанции в группе исследованных сусликов.
На филогенетическом ML-дереве эта пара видов занимает базальное положение. По палеонтологическим данным, предполагаемым предком даурского суслика считают раннеплейстоценовый вид S. tologoicus (Ербаева, Покатилов, 1966). При этом авторы отмечают черты строения черепа, сближающие его с представителями трансберингийского рода Urocitellus. Учитывая, высказанное ранее мнение о близости алашаньского к длиннохвостым сусликам (Воронцов, Ляпунова, 1969), можно предположить более раннюю дивергенцию ветви S. alaschanicus и S. dauricus, включая, возможно, и S. tologoicus, от общего предка короткохвостых евразийских сусликов, мигрировавшего через Берингийскую сушу в плиоцене.
Сопоставление филогенетических построений, основанных на кариотипических и молекулярно-генетических данных, позволяет предположить, что S. alaschanicus и S. dauricus представляют собой отдельную ветвь эволюции сусликов, сформировавшуюся в условиях изоляции на востоке Евразии.
Связующим звеном между восточно-азиатскими видами (алашаньским и даурским сусликами) и западными видами мог бы быть S. xantoprymnus, располагающийся на ближайшем к ним узле ветвления филогенетического дерева, но положение его неустойчиво, меняется в зависимости от алгоритмов построения и не поддерживается статистически, ни в одном варианте. Близость S. xantoprymnus к предковой форме на основании кариотипических данных предполагалась и ранее (Ляпунова, 2007).
По-видимому, происхождение других видов евразийских короткохвостых сусликов от S. xantoprymnus сопровождалось несколькими этапами видообразования, связанными как с геномными перестройками, так и с дивергенцией парапатрично распространенных изолированных форм (Фрисман и др., 2014). Для проверки данной гипотезы необходимо исследовать материал с территории Китая, где алашаньский и даурский суслики имеют значительные по площади ареалы, состояние которых в настоящее время недостаточно изучено.
Полученные нами результаты подтверждают принадлежность S. pallidicauda к ветви пустынно-степных сусликов и поддерживают выделение этой группы видов в качестве подрода Colobotis в рамках рода Spermophilus (рис. 21, группа А). Эта группа характеризуется достаточно низким уровнем межвидовых генетических дистанций (табл. 9), среднее значение которых составляет dp = 0.0373. В то же время нет достаточных доказательств выделения подрода Spermophilus на генетическом уровне. Эти выводы согласуются с результатами, полученными при баркодинговых исследованиях, основанных на анализе фрагмента COI (Ermakov et al., 2015).