Введение к работе
Актуальность темы исследования. Изучение цитогенетики эмбрионального
развития человека на преимплантационном этапе представляется актуальным с точки
зрения фундаментальной биологии, а также имеет большое клиническое значение.
Репродуктивные потери у человека являются крайне частым событием. Одной из
причин, вносящих значительный вклад в этиологию ранней эмбриональной гибели,
являются хромосомные аномалии [Баранов В.С., Кузнецова Т.В, 2007; Lebedev I.N.,
2011]. Существуют данные, что частота летальных хромосомных мутаций
значительно выше, а спектр шире на преимплантационном этапе эмбрионального
развития по сравнению с дальнейшими стадиями внутриутробного периода
онтогенеза [Fragouli E. et al., 2013]. Показано, что значительная часть
регистрируемых числовых нарушений хромосом находится в мозаичном состоянии с
нормальными клетками [Baart E.B. et al., 2006; Gleicher N. et al., 2016; Orvieto R. et al.,
2016]. Именно поэтому, данные, полученные на основании биопсии клеток
трофэктодермы, следует с осторожностью экстраполировать на клетки эмбриобласта
[Evsikov S., Verlinsky Y., 1998; Johnson D.S. et al., 2010]. Хромосомный мозаицизм
увеличивает вероятность диагностической ошибки и снижает шансы на успех
процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [Esfandiari N. et al., 2016].
Одной из проблем ЭКО является невозможность оценить наличие мозаичных клонов
у эмбрионов на стадии дробления или на стадии бластоцисты. Кроме того,
однозначно не установлено влияние мозаицизма в эмбриобласте (ЭБ) и
трофэктодерме (ТЭ) на вероятность имплантации бластоцисты и рождения ребенка.
Вопрос относительно наличия механизмов самокоррекции эмбрионального
кариотипа в ходе онтогенеза широко обсуждается в настоящее время [Bazrgar M.
et al., 2013]. Помимо этого, остается неясным соотношение различных
цитогенетических механизмов, приводящих к формированию мозаичного кариотипа.
В 2013 году появилась идея о проведении преимплантационного генетического
скрининга (ПГС) с использованием внеклеточной ДНК (внДНК) из внутриполостной
жидкости бластоцисты [Palini S. et al., 2013]. Использование внДНК, теоретически,
может решить проблему детекции хромосомного мозаицизма. Сопоставление
результатов молекулярного кариотипирования ДНК из тканей бластоцисты и ДНК из
внутриполостной жидкости может позволить проследить источник происхождения
хромосомных мутаций, а также определить цитогенетические и онтогенетические
механизмы их возникновения. Однако результаты первых, пока еще
немногочисленных исследований, посвященных молекулярному кариотипированию внеклеточной ДНК, противоречивы [Gianaroli L. et al., 2014; Werner M.D. et al., 2014; Tobler K.J. et al., 2015; Magli M.C. et al., 2016].
Степень научной разработанности темы исследования. В последние годы опубликована серия работ, посвященных молекулярно-цитогенетическому анализу внДНК из внутриполостной жидкости бластоцист человека [Poli M. et al., 2014; Gianaroli L. et al., 2014; Werner M.D. et al., 2014; Tobler K.J. et al., 2015; Magli M.C.
et al., 2016; Kuznyetsov V. et al., 2018], в которых были представлены результаты сопоставления молекулярных кариотипов бластомеров, клеток трофэктодермы, целых бластоцист и внеклеточной ДНК. Однако ни в одном из них не было проведено сравнение молекулярных кариотипов, реконструированных по анализу внеклеточной ДНК внутриполостной жидкости бластоцисты и двух ее компартментов – трофэктодермы и эмбриобласта. Кроме того, результаты проведенных до настоящего времени исследований крайне противоречивы.
Цель исследования:
Установить и сопоставить разнообразие числовых хромосомных мутаций в различных компартментах бластоцисты на преимплантационных этапах развития человека (в трофэктодерме, эмбриобласте и внеклеточной ДНК из бластоцеля) в условиях культивирования in vitro.
Задачи исследования:
-
Определить спектр и частоту числовых хромосомных аномалий в клетках трофэктодермы, эмбриобласта, и во внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцист человека.
-
Исследовать зависимость частоты числовых хромосомных аномалий в различных компартментах бластоцисты от возраста женщины, стадии развития и морфологических характеристик бластоцист.
-
Оценить соответствие хромосомных наборов клеток трофэктодермы, эмбриобласта и молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК.
-
Установить частоту внутри- и межтканевого хромосомного мозаицизма на стадии бластоцисты.
-
Оценить частоту постзиготических ошибок сегрегации хромосом на основе идентификации реципрокных анеуплоидий.
-
Сравнить чувствительность и специфичность методов микроматричной сравнительной геномной гибридизации и массового параллельного секвенирования при анализе ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты, эмбриобласта и трофэктодермы.
Научная новизна. В ходе настоящего исследования впервые проведено
сравнение молекулярных кариотипов клеток трофэктодермы, эмбриобласта и
молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК,
содержащейся во внутриполостной жидкости бластоцисты. Полученные результаты
свидетельствуют о низкой степени соответствия молекулярных кариотипов
исследованных компартментов бластоцист. Сравнительный анализ
продемонстрировал недооценку частоты внутри- и межтканевого хромосомного мозаицизма на стадии бластоцисты. С помощью молекулярного кариотипирования внДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты впервые оценен спектр хромосомных аберраций, клетки с которыми наиболее вероятно элиминируются в ходе преимплантационного развития. Таким образом, было продемонстрировано наличие механизмов самокоррекции аномального эмбрионального кариотипа.
Благодаря регистрации феномена реципрокных анеуплоидий (наличие в бластоцисте клеточных клонов с трисомией и с моносомией по одной и той же паре гомологичных хромосом) впервые получена минимальная оценка частоты митотических ошибок, ведущих к возникновению de novo числовых хромосомных аномалий в мозаичной форме. Впервые установлено, что не менее чем 32 % мозаичных форм числовых хромосомных аномалий возникает вследствие de novo митотических ошибок сегрегации хромосом на преимплантационных этапах развития.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о спектре и частоте летальных хромосомных мутаций, а также об уровне хромосомного мозаицизма в трофэктодерме и эмбриобласте бластоцист человека. Результаты работы указывают на возможность дифференциации механизма происхождения числовых хромосомных аберраций за счет регистрации феномена реципрокных анеуплоидий. Впервые показано, что внеклеточная ДНК из полости бластоцисты может быть использована как важный, дополнительный к стандартной биопсии трофэктодермы, источник информации о кариотипе эмбриона при проведении ПГС. Вместе с тем, использование внДНК в качестве единственного биологического материала для преимплантационного генетического скрининга анеуплоидий не представляется возможным.
Методология и методы исследования. Научная идея исследования
заключается в том, что дифференциальный анализ клеток эмбриобласта и
трофэктодермы, а также молекулярное кариотипирование внДНК из полости
бластоцисты позволяет получить новые уникальные данные о хромосомной
конституции эмбрионов на стадии бластоцисты, ранее не представленные в
литературе. Все бластоцисты были получены в ОГАУЗ «Областной перинатальный
центр» (г. Томск) и ООО «Красноярский центр репродуктивной медицины» в случаях
отказа пациентов от хранения бластоцист после завершения цикла ЭКО и подписания
пациентами информированного согласия. Работа проводилась с соблюдением
принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с
Федеральным законом «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 № 323-ФЗ. Перед началом работы было получено разрешение комитета по биоэтике Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Для выявления анеуплоидий в бластоцистах был использован метод метафазной сравнительной геномной гибридизации (CGH), с помощью которого были установлены молекулярные кариотипы 14 бластоцист, и метод микроматричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH), с помощью которого было проанализировано 15 бластоцист. Данные экспериментальные исследования были выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием и экспериментальным биологическим материалом «Медицинская геномика» с использованием ресурсов биологической коллекции «Биобанк населения Северной Евразии» (НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, г. Томск). Оценка уровня хромосомного мозаицизма была проведена с помощью метода массового
параллельного секвенирования (MPS) на базе ЦКП «Медицинская геномика» НИИ Медицинской генетики Томского НИМЦ и на базе Университета г. Тарту (Эстония).
Положения, выносимые на защиту:
-
Молекулярный кариотип, реконструированный по анализу внеклеточной ДНК, демонстрирует низкую степень соответствия хромосомным наборам клеток трофэктодермы и эмбриобласта, составляющую 8 % и 9 %, соответственно. В то же время, соответствие хромосомных наборов клеток эмбриобласта и трофэктодермы достигает 41 %.
-
Формирование 32 % числовых хромосомных аберраций связано с de novo постзиготическими ошибками сегрегации хромосом в преимплантационном периоде развития человека, что подтверждается регистрацией феномена реципрокных анеуплоидий.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности данных, полученных в ходе выполнения настоящей работы, обеспечивается использованием современных молекулярно-цитогенетических и эмбриологических методов исследования, а также статистической обработкой полученных результатов.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на VII Съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015); XXV Юбилейной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Сочи, 2015); Всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2015); Международной конференции «Хромосома 2015» (Новосибирск, 2015); региональной школе для врачей акушеров-гинекологов, педиатров «Профилактика и оптимизация пренатальной диагностики врожденных пороков развития» (Томск, 2015); Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы» (Москва, 2016); Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы медицинской генетики» (Томск, 2016); VII Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем» (Звенигород, 2016); Международной конференции «Хромосомы и митоз» (Новосибирск, 2016); Второй международной научно-практической конференции «NGS в медицинской генетике» (Суздаль, 2017); II Всероссийской конференции с международным участием «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2017); конференции молодых ученых «День открытых дверей Томского НИМЦ: встреча у кардиологов» (Томск, 2017); XI научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2017); научном семинаре в Институте молекулярной и клеточной биологии Университета г. Тарту, Эстония (Тарту, 2017); 34 Ежегодной конференции Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (Барселона, 2018); Конгрессе молодых ученых «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины» (Томск, 2018).
Публикации. По теме исследования опубликовано 22 работы, в том числе 8 статей в журналах Перечня ВАК РФ, из них 3 статьи в журналах, реферируемых в базе данных Web of Science, 1 статья в издании, входящем в базу данных Scopus, 4 статьи в журналах, индексируемых в базе данных РИНЦ. 16 публикаций – статьи в сборниках и тезисы конференций.
Личный вклад автора. Основные результаты настоящего исследования получены автором самостоятельно, либо в ходе совместной работы с коллегами из лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ и Университета Тарту (г. Тарту, Эстония). Изучение литературы по теме диссертации, экспериментальная работа, анализ, обобщение и статистическая обработка результатов, написание диссертации выполнены лично автором. Диссертант участвовал на всех этапах обсуждения полученных результатов и их опубликования.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и включает введение, основные главы (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты и обсуждение), выводы, список литературы и 3 приложения. Работа иллюстрирована 32 рисунками, 19 таблицами. Библиография включает 165 литературных источников, из них 10 источников отечественной и 155 источников зарубежной литературы.