Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Сравнительная цитогенетика 14
1.1.1. Дифференциальное окрашивание хромосом 14
1.1.2. Сравнительный хромосомный пэйнтинг 16
1.1.3. Сравнительное картирование 22
1.1.4. Сравнение последовательностей ДНК. 25
1.1.5. Кладистический анализ 26
1.2. Систематика, филогения и кариология подотряда myomorpha (rodentia, mammalia) 29
1.2.1. Систематика группы Myomorpha 29
1.2.1.1. Надсемейство Dipodoidea (тушканчиковые) 32
1.2.1.2. Надсемейство Muroidea (мышиные) 32
1.2.2. Особенности кариотипов мышевидных грызунов 34
1.2.2.1. Необычные системы половых хромосом 35
1.2.2.2. Вариации по количеству и распределению гетерохроматина 37
1.2.2.3. В-хромосомы - вариабельные элементы генома 38
1.2.3. Кариотипические и филогенетические взаимоотношения в подотряде
Myomorpha 39
1.2.3.1. Надсемейство Dipodoidea 39
1.2.3.2. Calomyscidae - отдельное семейство в составе Muroidea 39
1.2.3.3. Семейство Cricetidae: сложности таксономии 41
1.2.3.3.1. Подсемейство Arvicolinae 41
1.2.3.3.2. Подсемейство Cricetinae 44
1.2.3.4. Семейство Muridae - самое многочисленное семейство среди млекопитающих 46
1.2.3.5. Peromiscus - базальное ответвление от ствола Cricetidae/Muridae? 47
1.2.3.6. Проблема филогенетического положения цокоров 48
1.2.4. Хромосомный пэйнтинг подотряда Myomorpha 49
1.2.5. Темпы кариотипической эволюции в подотряде Myomorpha 56
1.2.6. Подотряд Myomorpha: сравнительное генетическое картирование...57
1.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Материалы 60
2.2. Методы 66
2.2.1. Получение культуры перечных фибробластов 66
2.2.2. Культивирование и хранение первичных фибробластов 67
2.2.3. Фиксация клеток 68
2.2.4. Хранение фиксированных клеток 70
2.2.5. Приготовление препаратов 70
2.2.6. Дифференциальные окраски хромосом 71
2.2.6.1. Рутинная окраска хромосом 71
2.2.6.2. GTG-бэндинг 71
2.2.6.3. С-бэндинг 71
2.2.7. Получение С J10 ДНК. 72
2.2.8. Получение хромосомоспецифичных ДНК-библиотек 73
2.2.8.1. ДНК-библиотеки сортированных хромосом 73
2.2.8.1.1. Сортированные хромосомы китайского хомячка 73
2.2.8.1.2. Сортированные хромосомы золотистого хомячка 75
2.2.8.1.3. Сортированные хромосомы копытного лемминга 75
2.2.8.1.4. Сортированные хромосомы домовой мыши 75
2.2.8.1.5. Сортированные хромосомы человека 75
2.2.8.2. ДНК-библиотеки микродиссекционных хромосом 75
2.2.8.2.1. Подготовительные процедуры 81
2.2.8.2.2. Микродиссекция 81
2.2.9. Флуоресцентная in situ гибридизация 82
2.2.9.1. Амплификация и мечение зонда 82
2.2.9.2. Гетерологичная гибридизация 83
2.2.9.2.1. Подготовка препаратов к гибридизации 83
2.2.9.2.2. Подготовка зондов к гибридизации 83
2.2.9.2.3. Гибридизация 84
2.2.9.2.4. Послегибридизационные отмывки и усиление сигнала 84
2.2.9.2.5. Варьирование условий гибридизации 84
2.2.9.3. Получение и обработка изображения 84
2.2.10. Филогенетический анализ 85
ГЛАВА 3. Результаты 86
3.1. Реципрокный хромосомный пэйнтинг 86
3.1.1. Китайский и золотистый хомячки 86
3.1.2. Золотистый хомячок, мышь 86
3.1.3. Золотистый хомячок, копытный лемминг 86
3.2. Однонаправленный хромосомный пэйнтинг 94
3.2.1. Подсемейство Calomyscinae 94
3.2.1.1. Род Calomyscus 94
3.2.2. Подсемейство Cricetinae 94
3.2.2.1. Роды Cricetus, Cricetulus, Allocricetulus 94
3.2.2.2. Род Tscherskia 99
3.2.2.3. Род Mesocricetus 101
3.2.2.4. PoflPhodopus 104
3.2.3. Подсемейство Gerbillinae і Об
3.2.3.1. PoflMeriones 106
3.2.4. Подсемейство Neotominae Юб
3.2.4.1. Род Peromyscus 106
3.2.5. Подсемейство Arvicolinae 108
3.2.5.1. РодАі-vicoIa 108
3.2.5.2. Род Clethrionomys 108
3.2.5.3. Род Dicrostonyx 108
3.2.5.4. РодЕПоЫш 113
3.2.5.5. РодМісі-otus 113
3.2.5.6. РОДМІІБ 113
3.2.6. Подсемейство Zapodinae 117
3.2.6.1. PoflSicista 117
3.3. АНАЛИЗ ПЕРЕСТРОЕК ХРОМОСОМ 117
3.3.1. Надсемейство Dipodoidae in
3.3.2. Надсемейство Muroidea 123
ГЛАВА 4. Обсуждение 128
4.1. Сравнительные исследования с помощью пэинтинга у грызунов 128
4.2. Филогенетическое положение подотряда myomorpha на общем древе грызунов 128
4.3. Вероятный предковый кариотип отряда грызунов 129
4.4. ХРОМОСОМНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ В НАДСЕМЕЙСТВЕ MUROIDEA 130
4.4.1. Мышевидные хомячки (Calomyscinae) 131
4.4.2. Песчанковые (Gerbillinae) 133
4.4.3. Мышиные (Murinae) 134
4.4.4. Хомячки Нового света (Neotomynae) 135
4.4.5. Палеарктические хомячки (Cricetinae) 135
4.4.6. Полевковые (Arvicolinae) 138
4.5. Неравномерность скоростей кариотипическои эволюции в подотряде myomorpha 140
Заключение 144
Выводы 146
Список литературы
- Сравнительный хромосомный пэйнтинг
- Получение культуры перечных фибробластов
- Китайский и золотистый хомячки
- Филогенетическое положение подотряда myomorpha на общем древе грызунов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Сравнительные цитогенетические исследования являются неотъемлемой частью изучения видов животных, давая значительный вклад в решение спорных вопросов систематики, в установление филогенетических связей между таксонами различного ранга. В отличие от морфологических подходов, сравнительный анализ кариотипов отражает не только филогенетическое родство исследуемых видов, но и дает информацию об изменениях в их геномной организации.
В распоряжении современной цитогенетики имеются несколько мощных инструментов для установления районов гомологии хромосом. Наибольшие успехи в быстром и эффективном анализе геномов млекопитающих достигнуты при сочетании методов дифференциального окрашивания хромосом и метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. К настоящему времени с помощью хромосомного пэйнтинга изучено около 150 видов млекопитающих, большинство из которых относят к отрядам хищных и приматов (Графодатский, 2007). Результатом сравнительных цитогенетических исследований стало определение двух основных направлений кариотипической эволюции млекопитающих:
Медленное преобразование генома: небольшое число перестроек, незначительно изменяющих вид предкового кариотипа (кошачьи, куницеобразные, ластоногие).
Быстрая реорганизация генома, характеризующаяся высокой частотой перестроек и приводящая к массовой перетасовке предковых синтенных групп (мышевидные грызуны, собачьи, гиббоновые).
Было показано, что хромосомные перестройки могут служить хорошими филогенетическими маркерами радиации млекопитающих (O'Brien et al, 1999). В то же время цитогенетические данные редко использовались для кладистического анализа, так как вопрос о принципах их кодирования оставался спорным. В настоящее время разработан подход, позволяющий использовать хромосомные ассоциации как геномные характеристики, и, таким образом, применять кл а диетический анализ для обсчета цитогенетических данных - в первую очередь, данных сравнительного хромосомного пэйнтинга (Dobigny et al, 2004).
Одной из важнейших задач современной цитогенетики является реконструкция предкового кариотипа. Известно, что в геномах различных видов имеются консервативные районы хромосом, сохраняющие высокий уровень гомологии на протяжении тысяч и миллионов лет эволюции. С использованием данных сравнительного хромосомного пэинтинга для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающих предложены предковые кариотипы, состоящие из наиболее вероятных комбинаций консервативных сегментов хромосом, реконструированы события перетасовки этих сегментов, происходившие при формировании кариотипов ныне живущих видов.
Сейчас, когда с помощью пэинтинга исследованы представители почти всех отрядов млекопитающих, актуальным является детальное изучение кариотипических взаимоотношений между представителями родов и семейств. В основном из каждого отряда исследовано несколько видов. Для создания полной картины эволюции кариотипов требуется детальное исследование таксонов всех рангов. Настоящая работа посвящена изучению кариотипических взаимоотношений внутри подотряда Myomorpha (мышевидные грызуны) отряда Rodentia (грызуны) с помощью метода сравнительного хромосомного пэинтинга.
Цели и задачи работы
Подотряд мышевидных грызунов характеризуется одной из самых высоких скоростей кариотипической эволюции среди млекопитающих. Значительная перестроенность кариотипов мышевидных грызунов не позволяет проводить исследования с помощью традиционно используемых пэйнтинг-проб человека. Целые семейства до сих пор остаются недостаточно изученными методами сравнительного хромосомного пэинтинга, что делает невозможным создание целостной картины кариотипической эволюции отряда грызунов. Решению этой проблемы может способствовать как увеличение числа исследуемых видов, так и вовлечение в сравнительные исследования дополнительных наборов пэйнтинг-проб.
Целью настоящей работы является исследование кариотипических взаимоотношений млекопитающих из подотряда Myomorpha отряда Rodentia.
Для составления картины кариотипических эволюционных изменений в подотряде были поставлены следующие задачи:
Описать кариотипические отношения в подотряде Myomorpha с помощью пэйнтинг-проб хромосом китайского и золотистого хомячков, копытного лемминга и домовой мыши.
Проанализировать данные сравнительного хромосомного пэйнтинга, реконструировать предковый кариотип таксонов и возможный ход перестроек, приведших к формированию наборов хромосом современных мышевидных грызунов.
Локализовать пэйнтинг-пробы хромосом человека на хромосомах одного из базальных представителей подотряда Myomorpha.
С использованием кладистического анализа выявленных хромосомных характеристик установить филогенетическую позицию подотряда Myomorpha внутри отряда Rodentia.
Новизна и практическая ценность работы
В работе используются наборы сортированных хромосом кариотипически контрастных видов: малохромосомный кариотип китайского хомячка, многохромосомные кариотипы золотистого хомячка, копытного лемминга и человека, сильноперестроенный многохромосомный кариотип домовой мыши. Характеристика наборов сортированных хромосом золотистого хомячка и копытного лемминга приведена впервые. На большом числе видов продемонстрирована эффективность использования этих наборов пэйнтинг-проб для исследования кариотипической эволюции в надсемействе Muroidea подотряда Myomorpha.
Впервые выполнена локализация полного набора пэйнтинг-проб человека на хромосомах представителя подотряда мышевидных грызунов. В настоящее время человек и мышь имеют наиболее полные генные карты среди млекопитающих, поэтому установление районов гомологии хромосом этих видов с кариотипами менее изученных видов представляет особую практическую ценность.
С применением современных молекулярно-цитогенетических методов идентифицированы и описаны число и границы консервативных районов хромосом у значительного числа видов мышевидных грызунов. Для 28 видов мышевидных грызунов из 15 родов и 7 подсемейств построены сравнительные хромосомные карты. Для хомяковых такая работа проведена впервые. При построении карт
12 использованы хромосомные наборы двух видов с детально картированными геномами (домовая мышь, китайский хомячок). В дальнейшем хромосомные карты могут быть использованы в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов.
С применением кладистического анализа выявленных хромосомных характеристик установлены филогенетические связи между представителями подотряда Myomorpha, определено положение таксона на филогенетическом древе грызунов. На основании данных сравнительного хромосомного пэйнтинга реконструирован предковый кариотип подотряда Myomorpha и предковый кариотип общий для подотрядов Anomaluromorpha, Castorimorpha, Myomorpha и Sciuromorpha. Этот этап необходим для воссоздания полной картины кариотипической эволюции, приведшей к формированию хромосомных наборов ныне живущих видов. В работе построены предковые кариотипы для каждого исследованного подсемейства и рода. Предложенная схема кариотипических взаимоотношений позволяет представить кариотипические изменения, сопровождавшие хромосомную эволюцию в подотряде Myomorpha отряда Rodentia.
Апробация работы
Результаты исследования были доложены на следующих конференциях:
а) III конференция молодых ученых, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 1-3 декабря 2003 г.; б) XLII международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс". Новосибирск, 13-15 апреля 2004 г.; в) Международное рабочее совещание "Происхождение и эволюция биосферы". Новосибирск, 26-29 июня 2005 г.; г) XV Всероссийское, совещание "Структура и функции клеточного ядра". Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г.; д) отчетная конференция "Динамика генофондов растений, животных и человека". Москва, 2005; е) отчетная конференция "Динамика генофондов растений, животных и человека". Москва, 2007; ж) V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 20-22 ноября 2007 г. Кроме того, результаты были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2005 и 2007 годов.
13 Публикации
По результатам работы опубликованы девять статей.
Вклад автора
Автором были выполнены следующие виды работ: получение и культивирование используемых в работе первичных линий фибробластов грызунов, получение суспензий хромосом большей части животных, вовлеченных в исследование, дифференциальное окрашивание кариотипов всех исследованных видов, микродиссекция библиотеки хромосомы 16 золотистого хомячка. Автор готовил препараты для гибридизации in situ, анализировал результаты локализации пэйнтинг-проб, идентифицировал хромосомы и принимал непосредственное участие в обработке и анализе полученных данных. Подготовка публикаций проводились автором совместно с аспиранткой Н.А. Лемской, к.б.н. П.Л. Перельман и д.б.н. А.С. Графодатским.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 212 ссылок, и 3 приложений. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков.
Сравнительный хромосомный пэйнтинг
Хромосомный пэйнтинг, как наиболее быстрый метод выявления гомологичных хромосомных элементов и определения числа хромосомных перестроек у разных видов, занимает важное место на современном этапе сравнительного анализа хромосом млекопитающих. Метод основан на флуоресцентной in situ гибридизации набора меченых специфических последовательностей ДНК (пэйнтинг-проб) одного вида на препараты метафазных хромосом того же (гомологичная гибридизация) или другого вида (гетерологичная гибридизация). Пэйнтинг-пробы могут представлять собой как меченые хромосомо-, так и районоспецифические библиотеки.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ был разработан Дж. Голлом и М. Пардыо в 1969 г. и стал незаменимым для выявления участка хромосомы, в котором располагается интересующий исследователя фрагмент ДНК (Pardue, Gall, 1969). Первые пэйнтинг пробы представляли собой радиоактивно меченые хромосомоспецифичные фаговые библиотеки человека, которые использовались только в гомологичной гибридизации для картирования хромосомных перестроек (например, Cannizzaro et al, 1985). In situ гибридизация с использованием радиоактивно меченых проб давала очень низкое разрешение, требовала значительного времени для детекции сигнала и статистического накопления данных, поэтому вскоре уступила место нерадиоактивной или флуоресцентной in situ гибридизации (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) (Pinkel et al, 1986). Первые пэйнтинг-пробы для FISH также представляли собой хромосомоспецифичные фаговые библиотеки человека, и использовались только в гомологичной гибридизации при анализе сложных аберраций хромосом человека в клинической диагностике (Pinkel et al, 1988). Низкая представительность зондов, достигаемая при клонировании в фагах, приводила к сильному фоновому сигналу, поэтому дальнейшее развитие метода было связано с поисками способов увеличения представительности библиотек и новых источников получения хромосомо- и районоспецифичной ДНК (Ried et al, 1998).
Одновременно с развитием FISH для выделения хромосомного материала был разработан метод сортировки хромосом или хромосомного сортинга, базирующийся на проточной цитофотометрии- с применением специально созданных сортеров - приборов, позволяющих собирать фракции индивидуальных хромосом, изолированных из митотических клеток (VanDilla et al, 1986; Ferguson-Smith, 1997). Изначально хромосомы для сортировки окрашивались флуоресцентными красителями, такими как Хёкст, пропидиум иодид, этидиум бромид или хромомицин A3. Хромосомы разделялись в зависимости от интенсивности флуоресценции в одноволновом возбуждении лазера. Разработка метода позволила существенно улучшить качество пэйнтинг-проб и соотношение сигнал-фон. На первом этапе в качестве объектов, исследований выбирали малохромосомные виды животных: китайский хомячок (2n=20) (Gray et al, 1975), индийский мунтжак (2n=10) (Carrano et al, 1976). Позже были отсортированы хромосомы видов с более сложными кариотипами: человек (Carrano et al, 1979), мышь (Disteche et al, 1981) и свинья (Grunwald et al, 1986). На этой стадии можно было разделить большинство хромосом и определить морфологический полиморфизм и перестройки, однако, примерно одинаковые по размеру хромосомы со сходным содержанием ДНК (содержанием красителя) разделить было невозможно, поскольку они попадали в один пик (Gray, Cram, 1990). Позже технология была усовершенствована путем введения комбинированного окрашивания хромосом двумя флуорохромами (обычно используют Хёкст, специфичный к АТ-парам, и хромомицин A3, специфичный к GC-парам), двухволнового возбуждения флуоресценции и регистрации двух сигналов флуоресценции окрашенных хромосом в двух разных спектральных интервалах. При таком подходе хромосомы разделялись не только по размеру, но и по AT/GC содержанию (Ferguson-Smith et al, 1998). Таким образом, были получены библиотеки всех хромосом человека (VanDilla et al, 1986). Был также разработан высокоскоростной сортер, позволивший в 8-10 раз сократить время сортировки (Gray et al, 1987; Ibrahim, van der Engh, 2004). В настоящее время метод проточной сортировки хромосом наиболее часто используется для создания пэйнтинг-проб (Ferguson-Smith et al, 2000; Chowdhary, Raudsepp, 2001).
При помощи программного обеспечения определяется интенсивность флуоресценции каждой хромосомы, количественная информация о сортируемых хромосомах суммируется и выводится в виде графического изображения -проточного каріютіта1 (например, рис. 4). Проточный кариотип представляет собой результирующее распределение флуоресцентных сигналов. По осям отложены величины сигналов флуоресценции используемых флуорохромов. Темные области обозначают положение пиков хромосом. При окрашивании хромосом красителями Хёкст и хромомицин A3 выше диагонали располагаются АТ-богатые хромосомы, а ниже ГЦ-богатые (Ferguson-Smith et al, 1998). Проточный кариотип индивидуален для каждой особи и для каждого вида. Вариация внутри вида обусловлена полиморфизмом по содержанию некодирующих высокоповторяющихся последовательностей в основном в центромерном гетерохроматине или хромосомными перестройками. Проточный кариотип отражает важные параметры сортировки хромосом: 1). Каждый пик характеризует определенный тип хромосом. 2). Площадь пика пропорциональна частоте встречаемости данной группы хромосом. 3). Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна размеру хромосом. 4). Площадь под линией обломков (располагаются по диагонали ближе к нулю) является мерой частоты обломков или перестроенных хромосом и может служить мерой степени разрыва хромосом и ядер (Gray et al, 1987; Gray, Cram, 1990).
Получение культуры перечных фибробластов
Для получения культур фибробластов из- органов и тканей животных применяли разные методические подходы. Основная доля культур первичных фибробластов была получена без использования ферментов, в некоторых случаях для обработки кусочков тканей применяли трипсин.
Получение культур без ферментативных обработок тканей. Метод в основном применялся для получения культур фибробластов из кусочков кожи, межреберных мышц, тканей уха и хвоста животных. Кусочки наружных органов животных тщательно ополаскивали 70% этанолом, затем освобождали от волос и кожи. Очищенные кусочки тканей помещали в стерильные чашки Петри и тщательно несколько раз ополаскивали раствором Хэнкса, содержащим высокие концентрации антибиотиков (400 мкг/мл пенициллина, 400 мкг/мл стрептомицина и 10 мкг/мл амфотерицина В). Кусочки межреберных мышц стерильно вырезали из грудной клетки животного и ополаскивали раствором Хэнкса. Затем кусочки тканей переносили в сухую и стерильную чашку Петри, ополаскивали ростовой средой и тщательно измельчали. Размельченную тканевую массу переносили на дно сухого культурального пластикового флакона и равномерно распределяли по всей поверхности дна. Флаконы переворачивали вверх дном, наливали небольшое количество ростовой среды (2 мл на флакон с площадью дна 25 см2), плотно закрывали и оставляли на сутки при 37С для фиксации кусочков на поверхности сосуда. Через 24 часа культуральный сосуд переворачивали, крышку приоткрывали, сосуд оставляли в С02-инкубаторе (37С и 5% С02) для культивирования первичных фибробластов.
Получение культур с обработкой тканей трипсином. Метод использовали только для тканей легкого; процедуру получения первичных фибробластов проводили стандартным образом (Nesterova et ai, 1994). Для увеличения выхода фибробластов, способных дать монослойный рост, обработку трипсином кусочков тканей и забор суспензии клеток для посадки проводили в 2 приема, при этом при повторной трипсинизации время обработки ткани уменьшали в 2-3 раза. Время первой обработки трипсином изменяли от 30 мин. до 60 мин. в зависимости от возраста животного (чем моложе, тем короче обработка). Для ускорения прикрепления и распластывания фибробластов полученную суспензию клеток помещали в культуральный сосуд с небольшим количеством ростовой среды (2 мл на флакон с площадью дна 25 см2) в СОг-инкубатор (37С и 5% С02). Через 24-48 ч. ростовую среду заменяли на свежую в объеме необходимом для культивирования клеток.
Культивирование и хранение первичных фибробластов В качестве ростовой среды при получении культур использовали среду аМЕМ, смеси сред аМЕМ/DMEM (1:1) или F12/DMEM (1:1) с добавлением 12-15% эмбриональной сыворотки и антибиотиков (гентамицина 50 мкг/мл, ампициллина 100 мкг/мл и амфотерицина В 2,5 мкг/мл). Выбор той или иной среды зависел от условий получения культур и от ростовых характеристик клеток. Пересев клеток проводили 2-3 раза в неделю с кратностью рассева- 1/2-1/4. Содержание эмбриональной сыворотки постепенно уменьшали до 10%. Варьирование условий культивирования велось в зависимости от особенностей каждой культуры: использовались другие комбинации антибиотиков, разное сочетание сред, менялась частота и кратность пересева, в некоторых случаях для стимулирования роста добавляли 3-5% среды AmnioMax (Sigma), стимулирующей пролиферацию фибробластов. Культуры первичных фибробластов использовали для приготовления метафазных хромосом на самых ранних пассажах (3-5) или при повторном введении в культуру после хранения в жидком азоте (в основном до 15 пассажа).
Для криоконсервации клеток (использовали в основном клетки в стадии активного роста) использовали культуральную среду аМЕМ или DMEM с добавлением 40% сыворотки (смесь эмбриональной сыворотки и сыворотки новорожденных телят в отношении 1:1) и 10% DMSO. Суспензию клеток разливали в пластиковые ампулы, помещали в специальные пенопластовые контейнеры и оставляли при температуре -70С не менее, чем на 48 ч., затем ампулы переносили в жидкий азот на хранение.
Клетки костного мозга. Костный мозг вымывали из трубчатых костей конечностей животных раствором Хэнкса или раствором DPBS в пробирку для центрифугирования. Тщательно разбивали костный мозг с помощью пастеровской пипетки, центрифугировали и осторожно сливали супернатант. К осадку добавляли 10 мл теплой культуральной среды RPMI или F12/RPMI (1:1) с добавлением эмбриональной сыворотки (5-10%) и раствора бромистого этидия (в конечной концентрации 1,5 мкг/мл). Тщательно пепетировали, суспензию переносили в сосуд для культивирования и помещали в СОг-инкубатор с температурой 37С на 1-1,5 ч. За 40 мин. до конца культивирования добавляли раствор колхицина (в конечной концентрации 0,1 мкг/мл). По окончании культивирования суспензию клеток переносили в пробирку, центрифугировали, сливали культуральную среду. К осажденным клеткам добавляли гипотонический раствор КС1, суспензию тщательно перемешивали и помещали на 30-50 мин. в термостат или на 8-10 минут на водяную баню с температурой 37С. По истечении времени гипотонии проводили предфиксацию: в суспензию добавляли несколько капель фиксатора (8-Ю капель на 4-5 мл суспензии), аккуратно перемешивали и выдерживали 10-15 мин. в холодильнике при +4 С. Затем центрифугировали, сливали жидкость, осадок клеток заливали небольшим количеством (1-2 мл) свежеприготовленного охлажденного до -20С метанол-уксусного фиксатора, тщательно суспендировали и оставляли в холодильнике при -20С С на 30 мин. Центрифугировали, меняли фиксатор, оценивали качество полученного материала. На всех этапах фиксации центрифугирование проводили в центрифуге Т32А Janetzki при 1000-1500 об./мин. в течение 5 мин.
Некоторые параметры методики варьировали. Иногда костный мозг инкубировали в среде с добавлением 2-4% сыворотки при 37С в течение 1-2 суток. В этом случае колхицин добавляли в пробирку за 1 ч. до начала фиксации. Иногда колхицин вводили животному внутрибрюшинно за 20-90 мин. до забоя (в зависимости от вида животного) из расчета 1 мл на 100 г массы. Животное забивали, вырезали трубчатые кости конечностей, вымывали костный мозг раствором Хэнкса или раствором DPBS. Далее действовали, как описано выше. Клетки тщательно суспендировали на всех стадиях.
Китайский и золотистый хомячки
Полный набор пэйнтинг-проб хромосом золотистого хомячка (Mesocricetus auratus, MAU) локализован на G-окрашенных метафазных хромосомах китайского хомячка (Cricetulus griseus, CGR). Примеры флуоресцентной in situ гибридизации приведены на рис. 9. Двадцать аутосомных проб М. auratus выявили 25 консервативных сегментов в геноме С. griseus (рис. 10). Номенклатура хромосом С. griseus соответствует Ray, Mohandas, 1976. Количество сигналов, данных каждой пробой М. auratus, приведено в табл. 4. Аутосомные пэйнтинг-пробы С: griseus выявили 25 пар гомологичных сегментов в кариотипе М. auratus (рис. 11). Пробы хромосом CGR6-9 выявляли по одному району гомологии, пробы CGR3-5 - по два, пробы хромосом CGR1 и CGR2 - по 7 и 5 районов, соответственно. Сходство рисунка G-бэндинга на гомологичных хромосомах и хромосомных сегментах указывает на отсутствие видимых внутрихромосомных перестроек. Однако для некоторых сегментов хромосом CGR1 и CGR2 трудно проследить гомологию на основе бэндинга из-за небольшого размера выявленных фрагментов.
Двадцать проб М. auratus выявили 43 аутосомных консервативных сегмента в геноме мыши (Mus musculus, MMU) (рис. 12). Полный набор хромосомоспецифичных проб М. musculus выявил 45 аутосомных консервативных сегментов в кариотипе М. auratus (рис. 11). Примеры флуоресцентной in situ гибридизации приведены на рис. 9 (в, г). Пробы хромосом MMU9, 19 и X выявляли по одному району гомологии, 13 проб (хромосомы MMU2-8, 11-14; 16 и 18)- по два. Хромосомные пробы MMU1, 10, 15 и 17 метили по З, 3, 3 и 5 районов в геноме М. auratus, соответственно.
По результатам реципрокного пэйнтинга для С. griseus, М. auratus и М musculus была построена сравнительная хромосомная карта (рис. 13).
Реципрокный хромосомный пэйнтинг выявил 41 и 43 аутосомных консервативных сегмента в кариотипах М. auratus и копытного лемминга (Dicrostonyx torquatus, DTO), соответственно (рис. 11, 14). Пробы хромосом
Результат локализация пэйнтинг-проб золотистого хомячка (MAU) и домовой мыши (MMU) на хромосомах китайского хомячка (CGR, номера хромосом указаны курсивом). Номенклатура хромосом китайского хомячка соответствует Radjabli et al, 2006. Реципрокный хромосомный пэйнтинг между китайским хомячком и мышью был выполнен Янгом с коллегами (Yang et al, 2000). DT0Y2, 9-12 и 15-21 выявляли по одному району гомологии в геноме М auratus, пробы DTOYlq-плечо, 4-6, 8, 13 и 22 - по два, проба DT014 - три, а пробы DT02, 3 и 7 - по четыре гомологичных района. Дополнительно для уточнения данных на хромосомы D. torquatus были локализованы некоторые пробы хромосом М. musculus (MMU11, 12, 13, 17). Впервые показано, что две пары хромосом в кариотипе копытного лемминга D. torquatus, ранее рассматриваемые как В-хромосомы, являются аутосомами.
В работе использованы наборы пэйнтинг-проб С. griseus, М. auratus и М. musculus для установления районов гомологии хромосом между геномами 24 видов мышевидных грызунов. Пробы М. auratus локализованы на хромосомах грызунов из 6 подсемейств: Calomyscinae, Cricetinae, Gerbillinae, Arvicolinae, Muridae, Neotominae (табл. 2). Сводные данные о количестве гибридизационных сигналов на гаплоидный набор, соответствующих каждой хромосомной пробе М. auratus, о количестве аутосомных консервативных сегментов, выявленных в кариотипе каждого исследованного вида, приведены в табл. 4. Ассоциации хромосом и хромосомных сегментов М. auratus, выявленные в ходе анализа, приведены в табл. 5. Наборы пэйнтинг-проб С. griseus и М. musculus были локализованы на хромосомах отдельных видов.
Исследован один представитель рода {Calomyscus sp., CSP) с диплоидным числом хромосом 2п=52 и Nfa=58. Аутосомные пробы М. auratus выявили 35 гомологичных сегментов в. кариотипе Calomyscus sp. (рис. 15). Дополнительно были локализованы отдельные хромосомные пэйнтинг-пробы С. griseus (CGR1, 2, 4, 8) иМ musculus (MMU1, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 18).
Примеры флуоресцентной in situ гибридизации приведены нарис. 16. Геномы единственного представителя рода Cricetus (С. cricetus, CCR), одного из двух представителей рода Allocricetulus (A. eversmanni, AEV) и четырех
Таблица 5. Ассоциации хромосом и хромосомных сегментов золотистого хомячка, выявленные в кариотипах исследованных видов. Идентичные ассоциации, обнаруженные в кариотипах различных видов, выделены одинаковыми цветами.
Филогенетическое положение подотряда myomorpha на общем древе грызунов
Отряд грызунов - самый многочисленный, но наиболее слабо исследованный отряд млекопитающих. Ряд вопросов таксономии и систематики отряда был решен благодаря сравнительным молекулярным исследованиям последовательностей ДНК. Однако некоторые вопросы до сих пор остаются спорными. Известно, что массовая радиация надсемейств грызунов происходила 55-65 млн лет назад (Huchon et al, 2002). Такой краткий в эволюционном плане промежуток времени создает проблемы при использовании замен нуклеотидов в качестве характеристик для филогенетического анализа. Напротив, хромосомные характеристики дают достаточное разрешение, поскольку они вовлечены в процессы видообразования (King, 1993) и могут фиксироваться в течение короткого периода времени (Britton-Davidian et al, 2000; Wang, Lan, 2000; Dobigny et al, 2005; Aniskin et al, 2006).
Как уже упоминалось выше (гл. 1.2.4.), панель хромосомных проб человека, используемая для сравнения хромосом плацентарных млекопитающих, была успешно применена только для сравнения геномов немышевидных грызунов (Graphodatsky et al, 2002; Stanyon et al, 2003). В данной работе впервые набор хромосомных пэйнтинг-проб человека был полностью локализован на хромосомах одного представителя подотряда Myomorpha, что позволило выявить хромосомные характеристики в геноме данного вида и провести филогенетический анализ, включающий представителей четырех из пяти подотрядов грызунов: Anomaluromorpha, Castorimorpha, Myomorpha и Sciuromorpha (рис. 31).
Данные различных молекулярных исследований показывают, что подотряд Sciuromorpha занимает базальное положение на древе грызунов, но вопрос о порядке ответвления подотрядов Anomaluromorpha, Castorimorpha, Hystricomorpha и Myomorpha остается нерешенным. Большинство результатов указывает на то, что подотряд Hystricomorpha следующим отделился от ствола древа (Murphy et al, 2001а; Huchon et al, 2002; Adkins et al, 2003) (см. рис. 2). При использовании различных комбинаций последовательностей ядерных генов, были получены следующие схемы филогенетических связей между подотрядами Anomaluromorpha, Castorimorpha и Myomorpha: Anomaluromorpha+Castorimorpha (гены А2АВ, IRBP, vWF, Huchon et al, 2002; гены CB1, IRBP, RAG2, DeBry, 2003), Anomaluromorpha+Myomorpha (гены A2AB и ІБШР, Murphy et al, 2001a; Huchon et al, 2002; гены GHR, BRCA1, Adkins et al, 2003) и Castorimorpha + Myomorpha (ген BRCA1, Adkins etal, 2003).
По результатам нашего исследования подотряд Sciuromorpha занял базальную позицию на общем древе грызунов. Одна сегментная ассоциация (HSA1/7) и разрывы трех синтений (HSA1/10, 7/16 и 9/11) подтверждают существование клады Сазгоптофпа+АлотаЬготофпа+Муотогрпа,- что полностью согласуется с данными молекулярных исследований: . Четыре сегментные ассоциации (HSA3/10, 3/12, 5/17 и 11/15) и разрыв синтений. HSA14/15 были идентифицированы как синапоморфии для Castorimorpha+Myomorpha. Дополнительно результаты сравнительного хромосомного пэйнтинга показывают, что ассоциация HSA12/22 представлена в виде единичного фрагмента в геномах С. fiber и S, betulina, но в виде двух фрагментов у О. ciinicuhis (табл. 6). Это подтверждает справедливость объединения Castorimorpha и Myomorpha. Несмотря на то, что некоторые выявленные характеристики были гомоплазическимш для Castorimorpha, Anomaluromorpha и Myomorpha (четыре для Castor и Pedetes, две для Sicista и Pedetes, см. табл. 6), проведенный анализ четко показывает, что Castorimorpha и Myomorpha филогенетически более близки друг другу, чем Anomaluromorpha.
4.3. Вероятный предковый кариотип отряда грызунов Сегментные ассоциации и разрывы синтений хромосом человека уже использовались как цитогенетические характеристики для различных отрядов плацентарных млекопитающих (Murphy et al, 2004; Springer et al, 2004; Froenicke, 2005; Yang et al, 2006). Данные, полученные в настоящей работе, позволили нам проверить некоторые предположения, касающиеся состава предкового кариотипа отряда грызунов. Поскольку ранее реконструкция предкового кариотипа отряда проводилась на основании исследования геномов белкообразных грызунов, включение в анализ представителей других подотрядов должно было внести некоторые коррективы в состав предкового кариотипа.
Такие ассоциации как HSA8/4/8/12/22, 20/15/14, 7/22/12, 2/17, 10/13, 1/8, 3/9 и распад HSA3 на три независимых фрагмента считаются предковыми для белкообразных грызунов (Stanyon et al, 2003; Li et al, 2004). За исключением ассоциации HSA2/17 (имеется в геноме S. betulina) и разрыва HSA3 (у S. betidina и С. fiber распадается на три фрагмента путем инверсии) остальные характеристики присутствуют в геномах исследованных представителей подотрядов Castoriraorpha, Anomaluromorpha и Myomorpha. По-видимому, HSA2/17 была представлена в кариотипе предка белкообразных грызунов и возникла независимо в геноме S. betulina. Ассоциация HSA8/12, возможно, является предковой для мышевидных и белкообразных грызунов, однако, нельзя исключать конвергенцию этого признака (Stanyon et al, 2003). Для получения однозначного ответа на вопрос о происхождении ассоциаций HSA2/17 и HSA8/12 необходимо исследовать кариотипы представителей подотряда Hystricomorpha.
Ассоциация HSA1/10 рассматривается в качестве предковой для когорты Glires (Rodentia+Lagomorpha), поскольку она была выявлена в геномах кролика, белок, мыши и крысы (Stanyon et al, 2003). Однако ни долгоног, ни бобр, ни мышовка не имеют этой сегментной ассоциации. Происхождение этой ассоциации может быть установлено после исследования большего количества видов.
Значительное число выявленных синтений (HSA3/21, 4/8, 7/16, 12/22, 14/15, 16/19) является предковыми для белкообразных грызунов и для плацентарных млекопитающих в целом (Yang et al, 2006). Данные по ZOO-FISH для небелкообразных грызунов хорошо согласуются с этим заключением, так, ассоциации HSA3/21, 4/8 и 12/22 были выявлены в геномах С. fiber, P. capensis и & betulina, HSA16/19 - у S. betulina и С. fiber, HSA14/15 - у P. capensis. Только синтения HSA7/16 не была идентифицирована ни у одного из трех этих видов. На рис. 32 представлен альтернативный состав предкового кариотипа отряда грызунов, реконструированный с учетом данных, полученных в настоящей работе.
4.4. Хромосомная эволюция в надсемействе Muroidea.
Недавно несколькими группами исследователей (Michaux et al, 2001; Murphy et al, 2001a; Adkins et al, 2002; Steppan et al, 2004; Neumann et al, 2006) no результатам анализа обширного набора молекулярных данных были предложены схемы филогенетических отношений для большинства таксонов грызунов. К сожалению, как и все молекулярные и морфологические филогении, предложенные деревья отражают только возможные филогенетические связи между таксонами, но не дают информации об изменениях в их геномной организации. Кладистический анализ хромосомных характеристик, выявленных по результатам сравнения G-окрашенных хромосом, был проведен только для песчанок рода Taterillus (Dobigny et al, 2005).
Значительный объем сравнительных цитогенетических данных, полученных при исследовании кариотипов представителей надсемейства Muroidea, создает прекрасную базу для проведения кладистического анализа для этого таксона. В ходе выполнения работы для 52 видов Muroidea был проведен кладистический анализ хромосомных характеристик, итогом которого стало построение филогенетического древа (рис. 33). На рис. 35 представлены результаты анализа (без учета подсемейства Gerbillinae, причины рассмотрены в гл. 4.4.1.). По данным пэйнтинга и сравнения G-окрашенных хромосом был реконструирован, состав предкового кариотипа надсемейства с 2п=56 (рис. 34). Из 27 аутосомных элементов 7 соответствуют отдельным хромосомам золотистого хомячка (МАШ, 7, 12, 15, 16, 18, 20), остальные элементы представляют собой отдельные сегменты хромосом золотистого хомячка (MAU4a, 4b; 5а, 5b, 5с, 5d, 8а, 9b, 9с, 10b, lib, 14а, 14b, 19b) или их слияния (MAU2/21, За/На, ЗЬ/13, 6/9а, 8Ь/10а, 17/19а). Ниже будут подробно освещены особенности кариотипической эволюции в каждой из исследованных групп грызунов.