Введение к работе
Актуальность теки. Перенос и экспрессия генов г клетках млекопк-ші-іх, в том числе и человека, представляет значительный интерес как
фундаментальной молекулярной биологии, таї: и для ее прикладных обтек. Современный -уровень развития технологии- рекокбинантных ДНК воляет создавать практически любые сочетания генетического материа-
Однако; репликация и экспрессия рекомбинантов могут оказаться не-местимыми с процессами жизнедеятельности реципиентных клеток. Соэ-ие вектора на основе ДНК вируса oY40 с синтетическим геном, кодиру-м биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин и ана-
зкспрёссии этого "гена" представляется весьма актуальной задачей, чение которой, возможно, поможет преодолевать некоторые трудности, занные с клонированием тибридных молекул ДНК. Избрав в качестве мо-и для наших исследований систему, содержащую ключевой компонент ликреинкининовой системы - пептид брадикинин, мы руководствовались бражениями связанными с возможной перспективой ее использования »в отерапии. Известно, что генетические дефекты, вызывающе, утрату собности синтезировать брадикинин. приводят к наследственно-обус-ленным заболеваниям - некоторым формам гипертенгии и бронхиаль-
астме" ( Wuepper К.р., .1972; ' Donaldson.V.H., е.а., 1976 ). С по-
ью же предложенной нами конструкции SV40(brd) можно попытаться кор-
тировать патологические дефекты сначала на уровне клеточных культур,
атем на уровне организма, что в настоящее время также является ак-
льной задачей.- '.
Дель данной работы заключается в исследовании экспрессии неприрод-синтетическсй короткой нуклеотидной последовательности, кодирующей
иологически активный пептид брадикинин в зукариотических клетках. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериг-
тальные задачи: . -
1) Создать вектор на основе ДНК вируса SV40 с синтетическим г.еном,
ирующим биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин.
2) Провести молекулярно-генетический анализ ДНК и РНК, выделенных
трансфицированшк плазмидой SY40(brd) клеток культуры CV-1 почки
еной африканской мартьшки и культуры клеток почки эмбриона человека амм 293) с целью проверки стабильности структуры SV40(brd) после сирования вируса. а так».е для выявления' и исследования- экспрессии пикинина в культивируемых клетках CV-і и 293 стамма.
..-4-
3) Изучить . биологическую активность нарабатываемого продукта культуре караиомкоцитов, его влияние на сократительную агатаяость к ток.
Задача настоящего исследования заключается в. конструировании основе ДНК вьруса SV40 рекомбинанта SV40(brdX-, в котором в 3'-конце часть ге.на VP1, кодирующего основной структурный, белок оболочки вир встроена синтетическая последовательность "гена" брадикинина, в изу нии экспресскя введенного в составе.рекомбинанта "гена" брадикинина пермиссивных для вируса SV40 клетках культуры CV-1 почки африканс зеленой мартдаш и в непермиссивной для вируса SV40 культуре гле почки эмбриона человека ( штамм 293 ), а также в исследовании физио гической активности синтезируемого брадикинина. Эти исследова представляются первым и необходимым этапом изучения возможности э прессии искусственно введенных в клетки млекопитающих генов биологи ки активных пептидов.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые получен
комбинантный геном SV40(brd), обеспечивающий без участия вируса -
мойщика высокий уровень'экспрессии "гена" брадикинина в заражен
клетках млекопитающих и служащий основой формирования биологически
тивных вирусных частиц. - - -
Разработка система тестирования брадикинина на культуре кардис оцитов новорсэденных- крысят. Чувствительность метода на 5-6 поряд выше традиционно используемых мєтодое тестирования этого нейропепт на гладкомышечных препаратах некоторых органов и тканей отдельных дов животных, что позволяет анализировать концентрации "рекомбинант го" брадикинана в диапазоне от 10_17м до 10"SM.
Практическая ценность работы. заключается в том, что получение настоящей работе генно-инженерная конструкция, сохраняющая', в се составе целый геном вируса SV40 и не требующая для репликации ву. са-помощника," (1) может служить моделью для изучени экспрессии кое ких нуклеотидаых последовательностей in vitro; (2) использоватьс качестве вектора для переноса чужеродных генов в клетки млеколитак: с целью получения образования биологически активных низкомолекуляс пептидов в системе'in vitro; (3) для получения' трансгенных живої гипертензиЕней линии с синтетическим "геном" брадикинина с целью V.
і действия брадккинина в системе in vivo.
Экспериментальные данные по тестированию биологической активности ізированного "рекомбинантного" брадикинина с помощью культуры кар-юцитов могут представлять практический и теоретический интерес в ;тве обоснований для разработки гённотёрапевтических подходов в гаи вопросов, связанных, с коррекцией гипертензивных состояний, яв-;я ценными в методическом аспекте.
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
-
Сконструированный рекомбинантный геном SV40(brd), созданный на зе ДНК вируса SV40 путем введения в 3'-концевую часа гена VP1 гтической последовательности гена брадикинина, представляет собой ильную систему, не требующую для репликиции вируса-помощника, и эщую основой формирования активных вирусных частиц.
-
SV40(brd) характеризуется, интенсивной экспрессией синтетичес-последовательности "гена" брадикинина в трансформированных реком-* нтом клетках CV-і^и 293 штамма.
-
Культура кардиомиоцитов новорожденных крысят использована в стве новой высокочувствительной системы детекции синтетического икинина и" тестирования физиологической активности "рекомбинантного" икинина.
-
Физиологическая активность полученного пептида соответствует ености синтетического пептида брадикинина.
Апробация работы. .Результаты исследования были представлены на V ной конференции по генетике соматических клеток в культуре t Чер-ловка, 1993 г.), на 4-ой конференции "Геном человека"-94 ( Черно-вка, 1994 г.) и на научном семинаре института генетики человека-
РАЇЛН, состоявшемся в мае 1994 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано-4 работы, 4 щятся в печати, получено .1 удостоверение на рационализаторское докение.
Структура и объем работы. Работа изложена на 1аз страницах ма-шисного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания риалов и методов исследования, полученных результатов и ш обсук-и, общего заключения, выеодов и списка литературы. Диссертация со-