Введение к работе
Актуальность темы.
Биолюминесценция или способность организмов светиться в темноте, присуща ряду прокариот и эукариот, и обусловлена протеканием специфических биохимических реакций, в ходе которых испускаются кванты света. Реакции биолюминесценции, протекающие in vitro, нашли применение в разнообразных тест-системах обнаружения различных ферментов, метаболитоз, гормонов, лекарств. В молекулярной биологии гены биолюминесценции широко используется в качестве репортеров для исследования регуляции генов.
Перенос люминесцентных гєеов в несветігліеся органами, количественное изучение экспрессии в них биолюминесценции' при учете зависимости светпродуцирующей реакции от метаболизма клетки-хозяина, может позволить понять биохимические особешюсти этих клеток. Созданные таким путем светящиеся бактерии в дальнейшем могут быть использованы в качестве биосепсоров в токсикологических исследованиях.
Представляется перспективным использование Оиолюминесцентных генов в качестве маркеров микроорганизмов для изучения процессов взаимодействия бактерий с растениями, при интродукции микроорганизмов в окружающую среду, в модельных экспериментах по віикнвае-мости бактерий. Способность к свечению позволяет легко идентифицировать колонии бактерий и обнаруживать микроорганизмы в субстратах среды с помощью специальных устройств, регистрирующие фотоны. Актуальной проблемой является разработка простых и наглядных способов слежения за судъбой биоконтролирующих штаммов, используемых для обработка семян, с целью обоснования практических рекомендаций применения бактериальных средств защиты растений. '
Цель настояаеп раеоты заключалась в создании системи мсісї-торинта микроорганизмов на основе генов биолюминесценции и исследовании экспрессии биолюминесценции в различных бактериях. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- создать генетическую конструкцию, несущую оперся биолюминес
ценции МОрСКОЙ»СВеТЯЩейСЯ баКТерИИ Photobacterlum leiognathl Ha
векторе с широким кругом хозяев;
отработать методы ': переноса данной конструкты в различные, микроорганизмы и количественно исследовать экспрессию люминесценции в этих организмах;
исследовать стабильность наследования созданной плазмлды в бактериях;
- исследовать, влияет ли функционирование биолшинесцентной
системы в бактериях на их свойства;
- исследовать выживаемость сконструированных светящихся бактерий
в образцах почвы методом посева разведений и люминометрическим
способом; проанализировать сохраняемость люминесцентной плазмиды
в штамме в образцах почвы;
осуществить мониторинг распределения светящихся бактерий в процессе роста растений из семян, инкрустированных маркированным штаммом в условиях климакамеры и в открытом грунте;
исследовать возможность мониторинга с помощью биолшинесцент-ной плазмиды активности фермента ИШ-оксидоредуктазы в клетках.
Научная новизна и практическое значение работы. Автором впервые количественно исследована экспрессия биолши-
НеСЦеНТНОЙ СИСТеМЫ МОрСКОЙ СВеТЯЩеЙСЯ бактерий P.leiognathi,
состоящей из пяти генов, в ряде грамогрицательных бактерий. Разработан способ мониторинга с помощью биолшинесцентной метки биоконтролирующих бактерий в процессе развития растений из семян, обработанных светящимся штаммом, в модельных экспериментах в климакамере и в полевых условиях. Показана возможность использования биолшинесценцш для приблизительной оценки сроков хранения обработанных штаммом семян и исследования способности штаммов колонизировать растения. Люминесцентная метка вводилась
В бИОКОНТрОЛИруЩИЙ ШТаММ Enterobacter agglomerana; ПО ДаННЫМ
литературы ранее данный вид бактерий не использовался в подобных
экспериментах. Созданная генетическая конструкция» несущая гены
биолюминесценции, как продемонстрировано в настоящей работе;
может - быть использована для мониторинга активности фермента
ОШ-оксидоредуктазы в бактериальных клетках и скрининга фрагмен
тов ДНК-в составе плазмид на оксидоредуктазнуо активность.
Qftbfi.M работы- -
Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литература. Список литературы включает 146 литературных источников отечественных и зарубежных авторов. Материал диссертации изложен на 120 страницах машинописного текста и включает 14 рисунков и 2 таблицы. Апробация работы .
Основные результаты диссертационной работы были представлены на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии расте-
r>
вий" (18-20 мая 1993г, г.Пущино), в виде доклада на научной конференция "Интродукция микроорганизмов в окрукаэдуа среду" (17-19 мая 1994 г., г.Москва) и на семинаре лабораторій генетики микроорганизмов Центра "Биоинженерия" (1995).
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре литературы приведены сведения об организации наиболее известных биолгаинесцентннх систем - светлячков и морских светящихся бактерий, подробно показаны различные аспекти их использования - в тест-системах обнаружения различных веществ, для исследования регуляции генов, в качестве генетически* маркеров микроорганизмов.