Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Распространение серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа у бактерий 12
1.2 Структура серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 15
1.3 Функции серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 22
1.4 Различные методы классификации серин-треониновых протеинкиназ 26
1.5 Происхождение, эволюция и распространение бифидобактерий: возможная роль сигнал-передающих систем в адаптации к различным экологическим нишам 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1 Штаммы бактерий и условия культивирования .35
2.2 Выделение ДНК и РНК из клеток бифидобактерий 35
2.3 Обратная транскрипция 36
2.4 Подбор праймеров и ПЦР 36
2.5 Процедуры молекулярного клонирования 37
2.6 Изучение экспрессии белков в клетках E. coli .38
2.7 Выделение и очистка белков 38
2.8 Aвтофосфорилирование киназ 39
2.9 Геномы грамположительных бактерий и их серин-треониновые протеинкиназы 2.10 Множественное выравнивание и филогенетический анализ серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 41
2.11 Моделирование белковых структур серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 41
2.12 Определение нуклеотидной последовательности геномов 42
2.13 Биоинформатический анализ серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий...43
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждениe 45
3.1 Классификация серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 45
3.1.1 Анализ последовательностей и структур серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 45
3.1.2 Создание и описание классификации 49
3.1.3 Сравнение результатов классификации с филогенетическим анализом серин-треониновых протеиникиназ грамположительных бактерий 56
3.1.4 Моделирование пространственной структуры серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий 58
3.1.5 Поиск и сравнительный анализ серин-треониновых протеинкиназ из секвенированных геномов грамположительных бактерий (представителей родов Mycobacterium, Streptomyces и Bifidobacterium) 60
3.1.6 Возможности практического применения созданной классификации при разработке селективных ингибиторов протеинкиназ 62
3.2 Анализ серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий 66
3.2.1 Идентификация, характеристика и доменная организация серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий 66
3.2.2 Множественное выравнивание и анализ аминокислотных последовательностей серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий .68
3.2.3 Филогенетический анализ серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий..72
3.2.4 Расположение генов серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий на хромосомной карте .76
3.2.5 Ортологи генов серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий в геномах актинобактерий; предполагаемые функции серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий 78
3.2.6 Клонирование генов серин-треониновых протеинкиназ штамма B. longum B379M... 82
3.2.7 Экспрессия генов серин-треониновых протеинкиназ штамма B. longum B379M в клетках E. coli .83
3.2.8 Экспрессия генов серин-треониновых протеинкиназ в клетках бифидобактерий 84
3.2.9 Изучение возможности автофосфорилирования для протеинкиназ Pkb2 и Pkb5 .85
Заключение 88
Выводы 90
Список сокращений 91
Словарь терминов .92
Список литературы
- Различные методы классификации серин-треониновых протеинкиназ
- Выделение и очистка белков
- Анализ последовательностей и структур серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий
- Идентификация, характеристика и доменная организация серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий
Различные методы классификации серин-треониновых протеинкиназ
Одной из особенностей позволяющей отличить бактериальные СТПК, от эукариотических, является конформация активационной петли. У эукариот, эта петля, как правило, неупорядочена и блокирует активный сайт, когда он не фосфорилируется [Johnson et al., 1996]. Таким образом, она играет роль ворот, закрывающих доступ к каталитическому сайту. После фосфорилирования, активационная петля принимает альтернативную конформацию, открывающую АТФ доступ и является составной частью сайта связывания мишени [Huse and Kuriyan, 2002]. Активационная петля у PknB, наоборот, разупорядоченная, хотя и показано, что она фосфорилируется и полностью активна in vitro [Manuse et al., 2016]. Это говорит о том, что в дополнение к фосфорилированию необходимы другие события, включающие связывание субстрата, для того чтобы генерировать активное состояние у бактериальных СТПК. Эта гипотеза подтверждается фосфорилированием белка GarA из M. tuberculosis [Villarino et al., 2005]. GarA содержит FHA-домен, который распознает фосфопептиды. Было показано, что взаимодействие GarA с фосфотреонинами активационной петли PknB имеет важное значение при фосфорилировании GarA при помощи PknB. Таким образом, околомембранный домен PknB, который фосфорилируется, может участвовать в стабилизации фосфорилированной активационной петли до состояния соответствующего конформации «открытые ворота» [Manuse et al., 2016].
Изучение структур бактериальных СТПК продемонстрировало конформационное сходство бактериальных СТПК с эукариотическими серин-треониновыми киназами. Действительно, консервативные структурные особенности характерны как для эукариотических, так и для бактериальных киназ, и включают в себя каталитический домен представленный двумя долями, каталитическую петлю и Р-петлю (в которых расположены остатки, вовлеченные в передачу фосфата), что ещ раз подтверждает консервативность механизма фосфорилирования [Ruggiero et al., 2012].
В литературе описано участие СТПК эукариотического типа в процессах деления клеток и биосинтеза клеточной стенки [Molle and Kremer, 2010; Liebeke et al., 2010; Ruggiero et al., 2012; Fiuza et al., 2008]. Известно также, что СТПК играют существенную роль в нормальном функционировании клетки, в образовании биопленок [Hussain et al., 2006; Madec et al., 2002], в спорообразовании [Madec et al., 2002] и в реакции на стресс [Absalon et al., 2009; Neu et al., 2002]; помимо этого СТПК вовлечены в транспорт глюкозы и потребление гликогена [Deol et al., 2005; Nariya and Inouye, 2002; 2003], участвуют во вторичном метаболизме и формообразовании [Umeyama et al., 2002], в биосинтезе пуринов [Rajagopal et al., 2005] и, конечно же, СТПК играют важную роль в формировании вирулентности у патогенных микроорганизмов [Av-Gay and Everett, 2000; Rajagopal et al., 2006; Wiley et al., 2006]. Такая универсальность этих ферментов отражена в разнообразии внеклеточных доменов, которые сопровождают консервативный каталитический домен киназы [Av-Gay and Everett, 2000; Petrickova and Petricek, 2003; Tyagi at al., 2010].
Функции СТПК наиболее хорошо изучены у патогенов. Для выживания патогенные микроорганизмы развили многочисленные и сложные механизмы адаптации к изменениям окружающей среды. Эти механизмы были развиты для того, чтобы вызывать соответствующие физиологические изменения в ответ. Внеклеточные сигналы, как правило, ретранслируются в клетку посредством обратимого фосфорилирования через протеинкиназы [Wright and Ulijasz, 2014].
Большое количество работ посвящено изучению физиологической роли протеинкиназ в процессах связанных с делением клетки и е ростом [Molle and Kremer, 2010; Beltramini et al., 2009; Hempel et al., 2012; Gopalaswamy et al., 2009]. Например, гены микобактериальных СТПК pknA и pknB организованы в оперон, который кодирует белки, участвующие в становлении формы клетки (Wag31) и биосинтезе клеточной оболочки (Roda, РВРА) [Kang et al., 2005]. Избыточная экспрессия, равно как и снижение экспрессии, генов pknB и/или pknA изменяют клеточный фенотип у различных штаммов микобактерий. В частности, микобактериальные клетки, у которых транскрипция гена pknB или pknA частично ингибируется, имеют сильно вытянутую форму. Эти морфологические изменения являются доказательством того, что эти две киназы являются ключевыми регуляторами клеточной репликации и становления формы клетки у микобактерий [Ruggiero et al., 2012]. Аналогично описанному выше примеру известно, что уменьшение количества белка FtsZ у микобактерий приводило к формированию длинных нитевидных клеток [Lutkenhaus et al., 1980]. (FtsZ широко распространен у микобактерий и является одним из главных цитоскелетных организаторов [Hett and Rubin, 2008; Dziadek et al., 2003]). Thakur и Chakraborti показали модуляцию деятельности FstZ при помощи PknA, и, таким образом, авторы подтвердили роль PknA в регуляции клеточного деления у микобактерий [Thakur and Chakraborti, 2006]. Помимо этого показано, что синтетические ферменты клеточной стенки так же регулируются при помощи киназ PknA или PknB, подтверждая тем самым связь между СТПК-зависимым фосфорилированием и биосинтезом пептидогликана при росте клетки в длину [Thakur and Chakraborti, 2008; Parikh et al., 2009; Dasgupta et al., 2006].
Для СТПК, в отличие от гистидиновых киназ, характерно следующее свойство: одна СТПК способна регулировать большое разнообразие белков, важных для различных клеточных функций, в том числе транскрипции и трансляции, деления клеток, состояния покоя (диапауза), устойчивости к антибиотикам, бактериальной персистенции и экспрессии факторов вирулентности [Wright and Ulijasz, 2014]. Разнообразие субстратов СТПК было продемонстрировано несколькими протеомными исследованиями. Некоторые примеры: M. tuberculosis, для которой был выявлен 301 белковый субстрат для 11 СТПК локализованных в этом организме [Av-Gay and Everett, 2000; Prisic et al., 2010]; другой пример, L. monocytogenes, у которой было обнаружено 62 субстрата для двух е СТПК [Lima et al., 2011]; и исследования проведенные на S. agalactiae, у которой было обнаружено 10 потенциальных субстратов для единственной известной у не СТПК [Silvestroni et al., 2009]. Стоит также отметить, что количество СТПК на бактериальный геном обычно гораздо меньше, чем двухкомпонентных систем [Wright and Ulijasz, 2014].
Постоянно растущий список субстратов СТПК эукариотического типа включает в себя разнообразнейшие белки, и в последнее время пришли к выводу, что СТПК напрямую модулируют транскрипционную машину у многих патогенных микроорганизмов [Wright and Ulijasz, 2014]. Эта новая форма регулирования служит дополнительным средством, при помощи которого бактерии могут изменить свой транскриптом в ответ на специфичные внешние раздражители [Wright and Ulijasz, 2014]. Тем не менее, идентификация и описание специфических субстратов СТПК затруднительны, скорее всего из-за их разнородности. В статье Pereira и соавторов рассматриваются более ста субстратов для 30 различных СТПК [Pereira et al., 2011]. Следует подчеркнуть, что большинство этих субстратов было идентифицировано путем фосфопротеомных подходов и/или при анализе киназ in vitro или с помощью сайт-направленного мутагенеза, и подтверждения in vivo на сегодняшний день отсутствуют [Pereira et al., 2011].
О функциях СТПК стало известно гораздо больше с появлением трехмерной кристаллической структуры PknB из M. tuberculosis [Ortiz-Lombardia et al., 2003; Young et al., 2003]. Киназные домены СТПК у бактерий являются довольно консервативными и из литературных данных известно, что общие для PknB из M. tuberculosis [Mieczkowski et al., 2008], PrkC из B. subtilis [Madec et al., 2003] и PrkC из S. aureus [Debarbouille et al., 2009], киназные домены способны подвергаться автофосфорилированию [Ruggiero et al., 2012]. При изучении кристаллической структуры киназного домена PknB была предложена модель, в которой происходит димеризация внутриклеточных киназных доменов, в ответ на связывание PASTA-доменами муропептидов, что приводит, в результате, к фосфорилированию серина и треонина, расположенных в активационной петле киназы (Рис. 4) [Mieczkowski et al., 2008; Madec et al., 2002]. Таким образом сенсорные (внеклеточные) домены СТПК должны передавать сигналы, например, о связывании муропептидов, и способствовать этим димеризации внутриклеточного домена киназы.
Выделение и очистка белков
Для классификации и моделирования структуры серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа различных грамположительных бактерий, из базы данных GenBank, NCBI (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi) [Benson et al., 2011], были отобраны геномы 100 штаммов грамположительных бактерий, принадлежащих 88 различным видам, и 15 родам: Actinomyces, Bacillus, Bifidobacterium, Corynebacterium, Clostridium, Frankia, Lactobacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Saccharopolyspora, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Thermobifida; в работу вошли штаммы как патогенных микроорганизмов, так и представителей комменсальной микробиоты человека, а также микроорганизмов, способных продуцировать антибиотики. Полный перечень геномов исследованных в работе приведен в Приложении 1. Преимущественно отбирались полностью секвенированные геномы бактерий.
Аминокислотные последовательности 471 СТПК были извлечены из выбранных геномов, и были идентифицированы их каталитические домены [Hanks et al., 1988]. Поиск СТПК проводился различными методами. Для аннотированных последовательностей СТПК, был произведен поиск с использованием запросов «Pkn», «Pk» и «serine/threonine protein kinase» по белковым и нуклеотидным базам данных на сайте NCBI. Так же, в качестве исходных запросов были взяты хорошо изученные и описанные 11 последовательностей СТПК M. tuberculosis [Av-Gay and Everett, 2000] и 34 последовательности СТПК S. coelicolor [Petrickova and Petricek, 2003], с их помощью проводился поиск потенциальных СТПК по гомологии с помощью программы blastp (онлайн версия, сайт NCBI). Список запросов был итеративно расширен за счет включения последовательностей, найденных с помощью начального набора (34+11), и поиск был повторен. Все идентифицированные последовательности были проверены на наличие Hanks-доменов [Hanks et al., 1988; 2003]. Список всех СТПК грамположительных бактерий исследованных в работе приведн в Приложение 1. 2.10 Множественное выравнивание и филогенетический анализ серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий
Для проведения множественного выравнивания исследуемый набор из 471 последовательности СТПК, для удобства анализа, был сокращн с использованием следующего критерия: 70% идентичности последовательностей, при расчте с помощью программы blastp (онлайн версия, сайт NCBI). Результирующий набор из 219 последовательностей был использован для построения филогенетического дерева. Множественное выравнивание 219 последовательностей (Приложение 2) было выполнено с использованием алгоритма ClustalX [Larkin et al., 2007]. Редактирование выравнивания проводилось вручную с помощью редактора BioEdit [Hall, 1999] (URL: http://www.mbio.ncsu.edu/ BioEdit/). Филогенетическое дерево было построено с помощью пакета программ MEGA 4 [Tamura et al., 2007], используя следующие параметры: метод присоединения соседей (Neighbor joining, NJ) [Saitou and Nei, 1987], модель p-distance.
Моделирование структур СТПК проводилось с помощью программы Modeller 9v7 [Sali and Blundell, 1993]. В качестве шаблонов были использованы структуры PknB M. tuberculosis: 1O6Y [Ortiz-Lombardia et al., 2003], 1MRU [Young et al., 2003], 2FUM [Wehenkel et al., 2006], 3F61 и 3F69 [Mieczkowski et al., 2008] – для всех групп, за исключением группы IV, для которой в качестве шаблона была использована структура PknG M. tuberculosis: 2PZI[Scherr et al., 2007] (для каждого шаблона приведн код доступа в банке данных PDB, URL:
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Использование в качестве шаблонов структур СТПК исключительно из M. tuberculosis обусловлено отсутствием на момент проведения исследования кристаллических структур СТПК иных грамположительных бактерий. Всего было построено 20 моделей, по одной для каждой группы. Все модели имели хорошее стереохимическое качество: оценивали качество карты Рамачандрана с помощью программы PROCHECK [Laskowski et al., 1993] и качество укладки белка с помощью программы ProSA [Sippl, 1993] (Приложении 3). Параметры качества: не более 3% остатков в условно разрешнных и запрещнных областях карты Рамачандрана и z-score –5.
Визуализация изображений, представленных в работе, выполнена с помощью следующих программ: ConSurf (http://www.bio-sof.com/consurf ) [Ashkenazy et al., 2010], Chimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ docs/credits.html) [Pettersen et al., 2004], Sybyl 8.0 (https://www.certara.com/), VIDA (OpenEye Scientific Software) (http://www.eyesopen.com/vida).
Для проведения секвенирования 10 геномов была использована платформа 454 GS Junior (Roche, Швейцария) (Таблица 3). Пробоподготовка для секвенирования была проведена в соответствии с рекомендациями производителя и с использованием соответствующих реагентов. Библиотеки фрагментов ДНК (ShotGun) готовили по стандартному протоколу (Rapid Library); секвенирование фрагментных библиотек на приборе Roche 454 GS Junior проводили с использованием версии реактивов Titanium (Roche); средняя длина единичных прочтений высокопроизводительного секвенирования составляла около 450 нуклеотидов. Сборка отдельных прочтений фрагментов ДНК в контиги проводилась с помощью программного обеспечения 454 GS De Novo Assembler версии 3.0 (с параметрами по умолчанию). При секвенировании было обеспечено в среднем 24-кратное покрытие.
Для двух геномов было проведено полногеномное секвенирование (Таблица 3). Порядок контигов определяли с помощью программы Mauve версия 2.3.1. [Darling et al., 2010], а также используя 454ContigGraph – текстовый файл получаемый на выходе c секвенатора. В тех случаях, когда это было возможно, рассматривались так же референсные геномы. После установления порядка, в котором расположены контиги друг по отношению к другу, геномы собирали с образованием конечной последовательности. Контиги соединяли следующим образом: на конец каждого контига подбирались праймеры (праймеры были синтезированы фирмой Синтол (Россия)), проводилась ПЦР, и ПЦР продукты секвенировали по методу Сэнгера. ПЦР проводили со смесью высокоточных ДНК-полимераз из набора Tersus PCR kit (Eurogen, Россия) на приборе «Терцик» («ДНК Технология», Россия). Температурный режим подбирали с учетом длины и GC состава праймеров. Секвенирование фрагментов ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, США) в ФНКЦ физико-химической медицины, ФМБА, Москва, Россия.
Далее проводили электрофорез ДНК в горизонтальном 1% – 1,5% агарозном геле (в зависимости от длины амплифицированного ПЦР фрагмента) в трис-боратном буфере (TBE) при напряженности электрического поля 5В/см, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Для определения размеров фрагментов ДНК в качестве стандартов использовали ДНК-маркеры фирмы Thermo Fisher Scientific (США). Выделение фрагментов ДНК из геля проводилось набором Thermo Fisher Scientific K0691 (США).
Анализ последовательностей и структур серин-треониновых протеинкиназ грамположительных бактерий
Группа I и группа II включают в себя наибольшее количество бактериальных СТПК; исключением из первой группы являются протеинкиназы принадлежащие родам Staphylococcus и Thermobifida; а из группы два протеинкиназы принадлежащие родам Streptococcus и Frankia. Специфической особенностью сигнатуры группы I является единственный гидрофильный остаток, обычно Thr или реже Ser, в последней позиции сигнатуры преимущественно гидрофобного сайта связывания аденина. II группа характеризуется отсутствием доноров и акцепторов водородных связей в аденин-связывающем кармане за исключением основной цепи шарнирной области. Во второй группе можно выделить две подгруппы: протеинкиназы, содержащие два остатка Met в двух последних позициях сигнатуры, и остальные киназы, более разнообразные и обладающие меньшим количеством алифатических остатков. Разница между этими двумя подгруппами была описана в работе Mieczkowski и соавт. [Mieczkowski et al., 2008]: после внесения мутаций в остатки метионина PknB M. tuberculosis (группа IIa), имитирующих киназу PknD M. tuberculosis, авторами было обнаружено, что мутант, но не фермент дикого типа, оказывается чувствительным к ингибиторам протеинкиназы А (PKA) KT5720.
Группа III характеризуется наличием в качестве привратника остатка треонина (Thr). Этот привратник довольно мал, что может приводить к увеличению доступного объема кармана связывания. Остаток Ile, занимающий последнее положение в сигнатуре, консервативен внутри третьей группы.
Группа IV представлена протеинкиназами, сходными с киназой PknG M. tuberculosis. Аденин-связывающая область этой группы очень узкая и гидрофобная благодаря нескольким остаткам Ile. Киназы, формирующие эту группу, обладают дополнительной петлй вблизи входа в аденин-связывающий карман [Scherr et al., 2007]. Киназа PknG M. tuberculosis секретируется в клетки хозяина при инфицировании, являясь фактором вирулентности и резистентности [Walburger et al., 2004; Wolff et al., 2009], и можно предположить, что и другие члены этой группы могут обладать аналогичными биологическими функциями.
Группа V представлена исключительно киназами бифидобактерий. Она похожа на третью группу в связи с наличием Thr в качестве привратника, но между этими группами есть существенная разница, заключающаяся в наличии остатка Cys в четвертом положении сигнатуры. Тиольная группа этого остатка может коваленто связываться с лигандом или служить донором/акцептором водородной связи.
Группы VI-XX содержат 10 членов и были названы нами малыми. Эти группы вместе с уникальными протеинкиназами (не отнеснными ни к одной из групп) характеризуются более индивидуальными комбинациями рассматриваемых остатков аденин-связывающей области. Этот факт позволяет предположить более высокую специфичность киназ, формирующих эти группы. Помимо этого, большинство аденин-связывающих карманов, принадлежащих малым группам являются менее гидрофобными и имеют более перспективные для дизайна селективных ингибиторов комбинации доноров и акцепторов водородных связей. Большинство малых групп, подобно группе V, являются родоспецифичными. Среди малых групп можно выделить следующие надгруппы:
Двадцать групп, сформированных в ходе нашего исследования, весьма разнообразны, но можно проследить и ряд закономерностей. Во-первых, «потолок» аденин-связывающего кармана, как правило, гидрофобный (Рис. 9). Первый остаток сигнатуры - всегда объмный гидрофобный остаток, как правило, Leu или Ile. Присутствие гидроксил-содержащего остатка является общим исключением для малых групп: XIII, XVIII и XIX, а группа XI является существенным исключением, так как обладает остатками Arg и Glu в третьей и четвертой позиции сигнатуры. Шарнирная область является более вариабельной. Наиболее важным остатком в этой области является привратник, отделяющий аденин-связывающий карман от «задней» части киназного домена. В большинстве случаев в этом положении появляется остаток Met; Thr, Ile и ароматические остатки в качестве привратника также довольно типичны. Остаток сигнатуры, расположенный после привратника, как правило, не способствует связыванию лиганда, но в случае нахождения в этой позиции Tyr возможна связь между лигандом и его гидроксильной группой (возможно в группах: I-IV, VI-XIII, XV-XVI, XVIII-XIX). Помимо Tyr, в этой позиции встречаются также остатки Phe и Leu, другие остатки – редкость. В седьмой позиции сигнатуры обычно расположен гидрофобный остаток, наиболее заметные исключения: в группах VII и XV – His, а в группе VIII – Cys.
«Пол» аденин-связывающего кармана (Рис. 9) является наиболее вариабельной областью и построен в основном боковыми цепями аминокислот. Свойства формирующих его остатков существенно различаются: они могут быть объмными или маленькими, гидрофобными или гидроксил-содержащими, могут быть ароматическими (группа X). Различные комбинации свойств этих остатков открывают возможности изучения их в качестве дополнительных критериев для формирования классификации и, например, дизайна селективных ингибиторов.
Область связывания аденина была представлена нами в виде сигнатуры – последовательности из 9 аминокислотных остатков. Два остатка из этой сигнатуры, соответствующие позициям 6 и 7, могут показаться на первый взгляд менее важными, так как их боковые цепи расположены вне сайта связывания. Тем не менее, некоторые замены в этих позициях могут приводить к существенным изменениям в структуре, что может в свою очередь влиять на функциональность киназы. Боковые цепи оставшихся семи аминокислот образуют вариабельную поверхность аденин-связывающего кармана.
Как и последовательности СТПК, бактериальные рода и виды могут быть разделены на группы, в соответствии с предложенной классификацией. Можно предположить, что киназы, характеризующиеся одной и той же сигнатурой, а следовательно относящиеся к одной группе, будут ингибироваться одинаковыми низкомолекулярными соединениями, которые в свою очередь, могут рассматриваться в качестве антибактериальных соединений. Таким образом, практическим применением классификации, может стать разработка селективных ингибиторов СТПК, которые будучи направленными на ингибирование СТПК из одной группы не будут взаимодействовать (или будут слабо взаимодействовать) с СТПК из другой группы; следовательно такие низкомолекулярные ингибиторы, взаимодействующие с СТПК принадлежащими группе содержащей только патогенные микроорганизмы (например группы VII, X, XII XVIII и XIX), не будут затрагивать СТПК пробиотических бактерий, характеризующихся иной сигнатурой и принадлежащих к другим группам (V, VI, IX, XI, XIII, XVI). Возможности практического применения разработанной классификации описаны далее в разделе 3.1.6.
Идентификация, характеристика и доменная организация серин-треониновых протеинкиназ бифидобактерий
Киназа Pkb1 наиболее сходна с киназой pknL из M. tuberculosis (идентичность каталитических доменов – 45%). При аннотации некоторых геномов бифидобактерий е называют PknA2. Протеинкиназы с аналогичной аннотацией также найдены нами и у других актинобактерий: у Gardnerella vaginalis ATCC 14019 (HMPREF0421_20603), Actinomyces sp. oral taxon 848 str. F0332 (HMPREF0972_02091), Nocardia nova SH22a (NONO_c24340) и у Corynebacterium glucuronolyticum ATCC 51867 (HMPREF0294_0634).
СТПК Pkb3 не имеет ортолога среди киназ M. tuberculosis. Но, при выравнивании Pkb3 с протеинкиназами из других актинобактерий, нами были найдены очень сходные с ней киназы (идентичность каталитических доменов до 71%) в следующих бактериальных родах: Gardnerella, Scardovia и Parascardovia. Все эти три рода, как и род Bifidobacterium принадлежат к семейству Bifidobacteriaceae.
Гомологи для уникальной СТПК Pkb4 (идентичность каталитических доменов от 30% до 40%) были найдены нами только среди бактерий, принадлежащих к семейству
Coriobacteriaceae (тип Actinobacteria). Микроорганизмы принадлежащие к данному семейству были обнаружены как в ЖКТ человека, так и в кишечнике жука-пожарника (или по-другому его называют клоп-солдатик, лат. Pyrrhocoris apterus) [Stackebrandt et al., 1997; Stackebrandt et al., 2013; Rajilic-Stojanovic and de Vos, 2014].
Для киназы Pkb2 также был произведен поиск ортологов в геномах актинобактерий, представленных на сайте NCBI. Нами были обнаружены ортологи СТПК Pkb2 в геномах различных актинобактерий. Стоит отметить, что наибольший процент идентичности каталитического домена (45%) протеинкиназа Pkb2 имеет с СТПК из геномов рода Actinomyces (класс Actinobacteria; порядок Actinomycetales; семейство Actinomycetaceae) – данное семейство является довольно близким таксоном к семейству Bifidobacteriaceae. Ортологи киназы Pkb2 из более далеких таксонов, если судить по филогенетическому дереву актинобактерий [Gao and Gupta, 2012], имели более низкий процент идентичности с бифидобакетриальной киназой, и в частности в случае микобактерий процент идентичности каталитического домена киназы Pkb2 из бифидобактерий с гомологичной ей киназой PknK составляет всего 35%. Стоит отметить, что все киназы обнаруженные нами при поиске ортологов для Pkb2, являются ортологами киназы PknK, что иногда отражено в их аннотации, например: serine/threonine-protein kinase PknK Streptomyces scabiei (SsS58_03137), serine/threonine-protein kinase PknK Nocardia pneumonia (WP_040772965), serine/threonine-protein kinase PknK Rhodococcus sp. (WP_045063369) и т.д.
Ближайший родственник бифидобактерий, принадлежащий к тому же семейству (Bifidobacteriaceae) – Gardnerella vaginalis, она также является комменсалом микробиоты человека и содержит в свом геноме 5 СТПК. Четыре СТПК G. vaginalis являются ортологами консервативных СТПК бифидобактерий, а пятая киназа не является ортологом ни pkb2 ни pkb4.
На сегодняшний день не разработаны эффективные и доступные методы нокаута генов у бифидобактерий, в связи с чем, экспериментальные данные о функциях бифидобактериальных генов крайне ограничены, а о функциях СТПК и вовсе отсутствуют. Но, о функциях генов СТПК можно судить, например, основываясь на результатах in silico анализа гомологов данных генов. Таким образом, мы можем выдвинуть ряд гипотез, относительно функций СТПК бифидобактерий.
На данный момент, наиболее широко исследованы СТПК M. tuberculosis. Основываясь на достаточно высоком проценте идентичности аминокислотной последовательности каталитических доменов СТПК Pkb5 и Pkb6 бифидобактерий и киназ PknB и PknA из M. tuberculosis (Рис. 17), и учитывая сходство генетического окружения оперона pknB-pknA M. tuberculosis [Fernandez et al., 2006] и оперона pkb5-pkb6 бифидобактерий, можно предположить, что и функции у этих генов-ортологов могут быть сходные и связаны с процессами роста и деления клеток. Участие данных генов СТПК в росте и развитии, а также в биосинтезе клеточной стенки, было показано экспериментально в ряде работ, исследовавших эти гены у микобактерий [Sassetti et al., 2003; Kang et al., 2005].
Протеинкиназа Pkb1 является ортологом киназы PknL из M. tuberculosis и, основываясь на литературных данных, можно предположить, что Pkb1, как и PknL, возможно участвует в регуляции клеточного деления и биосинтеза клеточной стенки [Camus et al., 2002; Narayan et al., 2007].
Уникальный ген pkb4, встречается у двух видов B. longum и B. bifidum – характерных и зачастую преобладающих в ЖКТ человека. В связи с этим, нельзя исключать, что присутствие гена pkb4, может быть связано с сохранением высоких пробиотических свойств у данных видов и помогать им успешно колонизировать ЖКТ человека.
Среди протеинкиназ микобактерий ортологом гена pkb2 является киназа pknK, связанная с адаптивными механизмами у этой группы бактерий [Malhotra et al., 2010]. Malhotra и соавторы также показали, что данная киназа у микобактерий участвует в ответе на окислительный стресс, и в регуляции трансляции на различных фазах роста [Malhotra et al., 2010, 2012]. Киназа PknK M. tuberculosis не имеет трансмембранного домена и является цитоплазматической киназой [Prisic and Husson, 2014].