Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор 11
1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе ишемического инсульта .11
1.2. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза ишемического инсульта 16
1.3. Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение 21
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Характеристика материала исследования .35
2.2. Диагностика ишемического инсульта 36
2.2.1. Анкетирование пациентов 36
2.2.2 Молекулярно-генетические методы 37
2.2.3. Отбор генов и полиморфизмов 38
2.2.4. Генотипирование ДНК-полиморфизмов 40
2.2.5. Генетико-статистический и биоинформатический анализ данных .43
Глава 3. Результаты собственных исследований. Связь полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ с предрасположенностью к ишемическому инсульту 47
3.1. Сравнительная характеристика частот аллелей исследуемых полиморфных вариантов генов у жителей Центральной России 47
3.2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов MMPs с предрасположенностью к ишемическому инсульту 52
3.3. Анализ средовых факторов риска развития ишемического инсульта и их совместного влияния с полиморфными вариантами генов MMPs на развитие болезни 57
Глава 4. Связь полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ с клиническими особенностями ишемического инсульта 62
4.1. Анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ с возрастом манифестации ишемического инсульта и локализации окклюзии мозговых сосудов .62
4.2. Связь полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ с клиническими проявлениями ишемического инсульта 68
4.3. Связь полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ с клинико-лабораторными показателями при ишемическом инсульте 73
Глава 5. Комплексный биоинформатический анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ в развитие ишемического инсульта 75
5.1. Моделирование межгенных и генно-средовых взаимодействий, формирующих предрасположенность к ишемическому инсульту 75
5.2. Биоинформатический анализ регуляторного потенциала полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ .81
5.3. In silico анализ молекулярных взаимодействий генов матриксных металлопротеиназ с генными сетями и метаболическими путями, вовлеченными в патогенез и клинические проявления ишемического инсульта 86
Вывoды 100
Список сокращений .102
Список литературы 104
Приложения 134
- Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
- Анализ средовых факторов риска развития ишемического инсульта и их совместного влияния с полиморфными вариантами генов MMPs на развитие болезни
- Моделирование межгенных и генно-средовых взаимодействий, формирующих предрасположенность к ишемическому инсульту
- In silico анализ молекулярных взаимодействий генов матриксных металлопротеиназ с генными сетями и метаболическими путями, вовлеченными в патогенез и клинические проявления ишемического инсульта
Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
ММРs - основные регуляторы состава внеклеточного матрикса (ВКМ), своевременная деградация которого является основой процессов эмбриогенеза, морфогенеза, ремоделирования тканей, репарации [Siefert S. et al., 2012; Bonnans C. et al., 2014]. ММРs обнаружены в биожидкостях и экстрацеллюлярном матриксе, плазматической мембране, эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях всех клеток организма [Nissinen L. et al., 2014]. Преимущественно синтез протеаз происходит в клетках линии фибробластов, в фагоцитах, макрофагах, лимфоцитах, эндотелиоцитах [Newby A.C., 2012; Fanjul-Fernаndez M. et al., 2010]. ММРs относятся к индуцируемым энзимам, владеющим субстратной специфичностью, кроме ММР2 и ММР17. ММРs условно подразделяются на коллагеназы, желатиназы, мембраносвязанные ММРs, стромелизины, матрилизины [Kerkelii B. et al., 2013; Fields G.B. et al., 2016]. Данные о биологической роли MMPs предствлены в таблице 1. Следует отметить, что каталитическая активность ММРs регулируется на уровне активации профермента путем удаления продомена, на уровне торможения ТIМП, неспецифическими ингибиторами протеаз (-2-макроглобулин и др.) [Bourboulia D. et al., 2010]; на секреторном уровне [Gaffney J. et al., 2015]. Активность ММРs зависит от уровня экспрессии генов, главная роль отводится присутствию в промоторном участке гена ММP однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и от пребывания в тканях эндогенных активаторов и ингибиторов ММРs [Saratzis A. et al., 2015]. Гормонам, цитокинам, онкогенам, факторам роста отведена роль активаторов ММPs [Gaffney J. et al., 2015]. К ингибиторам ММРs относятся низкомолекулярные белки, являющиеся специфическими тканевыми ингибиторами и действующие избирательно. Селективно связываясь с ММPs, формируют нековалентные комплексы, которые блокируют путь субстратов к каталитическим центрам [Devulapalli K. et al., 2014; Hoseini S.M. et al., 2015].
Следует отметить, что в последние годы активно изучается связь ММPs с развитием ССЗ [Abd El-Aziz T.A. et al., 2016], так как разрушение ВКМ, вызванное воздействием ММРs, имеет очень важное значение в патогенезе инсульта, атеросклероза и других ССЗ [Olsen V. et al., 2014]. Анализ литературы свидетельствует о том, что к формированию ишемического инсульта могут быть причастны ММP1, ММP2, ММP3, ММP8, ММP9, ММP10 и ММP12 [Chang J.J. et al., 2016; Nie S.W. et al., 2014; Del Porto F. et al.,2017; Ma F. et al., 2016; Mahdessian H. et al., 2017; Chehaibi K. et al., 2014; Rodrguez J.A. et al., 2013; Zhu F. et al., 2013].
Матриксная металлопротеиназа 1
ММР1 – ключевой фермент, гидролизующий волокна интерстициального фибриллярного коллагена [Zheng X. et al., 2012]. К главной функции относится гидролиз компонентов внеклеточного матрикса. Субстратом для гидролиза являются аггрекан, коллаген I, II, III, VII, X, XI типов, казеин, желатин, фибронектин, витронектин, ламинин, серпины, 2-макроглобулин, фактор роста фибробластов (FGF), интерлейкин (IL1), энтактин, фибриноген [Devulapalli K. et al., 2014]. Продукт синтеза ММР1 представляет собой полипептидную цепочку, в которую входит 469 аминокислот. Молекулярная масса равна 54 кДа. Ген, который кодирует ММР1, является частью кластера генов (gene cluster) ММPs, локализующих в хромосоме 11q22.2. В структуру молекулы ММР1 входит «цистеиновый выключатель» [Niu W. et al., 2012]. Необходимо отметить, что ММР1 как профермент подвергается секреции фибробластными и эпителиальными клетками, остеобластами, хондроцитами, макрофагами, эндотелиоцитами [Gordon М.K. et al., 2010]. Цитокинами, онкогенами, гормонами, факторами роста, интерлейкинами, нейропептидами осуществляется регулирование экспрессии ММP1 на генном уровне [Mazor R. et al., 2013]. Индукция фермента после трансляции удается за счет влияния ММP3 и ММP10, химазы, плазмина; уровень ММР1 в тканях остается достаточно низким [George J. et al., 2012]. Следует отметить, что ингибирование продукции ММP1 осуществляется ТIМП-1 и ТIМП-2 и макроглобулинами. Увеличение концентрация ММP1 происходит при ремоделировании тканей, развитии эмбриона, процессах регенерации [Siefert S. et al., 2012]. На сегодняшний день опубликовано наибольшее количество работ, посвященных функциональному исследованию SNP-полиморфизма -1607 (1G/2G) rs1799750 MMР1. Высокая экспрессия ММР1 зависит от аллеля -1607 2G, которая включает дополнительный гуанин в позиции -1607 (5 -GGAA-3 вместо 5 -GAA-3 ) в кодирующую последовательность [Chaudhary A.K. et al., 2010].
Важно отметить, что ММР1 является причиной заболеваний, таких как ИБС [Velho F.M. et al., 2010], атеросклеротическое поражение сосудов [Abilleira S. et al., 2006], гломерулонефрит [Djuric L.T. et al., 2014], ХОБЛ [Hu C. et al., 2013], ревматоидный артрит [Lepetsos P. et al., 2014], хронический панкреатит [Sri Manjari K. et al., 2013], рак желудка [Devulapalli K. et al., 2014], конъюктивит [Leonardi A. et al., 2013]. Доказаны ассоциации полиморфизма -1607 (1G/2G) rs1799750 гена MMР1 с ССЗ [Wen D. et al., 2014].
Матриксная металлопротеиназа 2
ММР2 является представителем подсемейства желатиназ, основная функция гидролиз входящего в базальные мембраны коллагена IV типа [Shao J.Y. et al. 2011]. Важно отметить, что ММP2 участвует в таких важнейших биологических процессах, как ангиогенез, остеогенез, регенерация и ремоделирование тканей, созревание кровеносных сосудов, овуляция и имплантация эмбриона, инволюция молочной железы [Zhang Y. et al., 2013]. Следует отметить, что стабильность молекулы пептидазы создает структура продомена ММР2 состощая из двух цистеинов [Karasneh J.A. et al. 2014]. Продуктом синтеза ММР2, является негликозилированный профермент, основой синтеза которого является ряд клеток, состоящий из ГМК стенок сосудов, фибробластных клеток, хондроцитов, эндотелиоцитов моноцитов, кератиноцитов [Gonzalez-Arriaga P. et al., 2012]. Профермент активируется под действием МТ1-ММP, отдельных химических соединений, аутолиза [Li X. et al., 2013]. ММР2 включает 660 аминокислот, молекулярная масса 73,9 кДа [Schmid-Schnbein G.W., 2011]. Подавление экспрессии гена ММP2 происходит за счет эндогенных ингибиторов (2-макроглобулин) и TIMP-1, -2, -3, -4 [Guo X.T. et al., 2012]. Гидролизу в присутствии ММР2 подлежат декорин, коллаген IV, V, VII, X типов, фибронектин, эластин, желатин, аггрекан, витронектин [Palei A.C. et al., 2012].
Нарушение экспрессии ММP2 связано с развитием рака толстой кишки [Xu E. et al., 2014], первичной открытоугольной глаукомы [Kaminska A. et al., 2014], с атеросклерозом сонных артерий [Wang F. et al., 2011].
Ген ММР2 находится в положении 16q12.2. Полиморфизмы промоторной области ММP2, к которым относятся -1306C T, -1575G А, -1015C Т (-735C T) rs2285053 и -168G Т, в настоящее время подлежат активному изучению [Mishev G. et al., 2014]. SNP-полиморфизмы, вызывающие изменение экспрессии гена и имеют функциональное значение [Bahrehmand F. et al., 2012]. Важно отметить, что полиморфизм -1306С/T rs243865 ММP2 ассоциирован с патологией ССС [Chaudhary A.K. et al., 2016].
Матриксная металлопротеиназа 3
ММP3 является важным представителем подсемейства стромелизинов, отвечает в основном за гидролитическое расщепление фибронектина. В ее состав входит 477 аминокислот, молекулярная масса равна 54 кДа [Flores-Pliego A. et al., 2015]. Следует отметить, что ММР3 секретируется хондроцитами, эпителиоцитами, эндотелиоцитами, фибробластами, клетками соединительной ткани [Saratzis A. et al., 2015]. Ген ММP3 находится в положении 11q22.2. Цитокинами, опухолевыми промоторами и факторами роста регулируется экспрессия гена ММР3 [Wang J. et al., 2011]. ММP3 обладает небольшой субстратной специфичностью, и протеолитическому расщеплению подвергаются ламинин, коллаген III, IV, IX и X, хрящевые протеогликаны, желатин I, III, IV и V, кроме фибронектина [Niu W. et al., 2012]. Увеличение концентрация ММР3 происходит при таких процессах, как атерогенез, регенерация тканей после повреждения, возникновение и рост опухолей [Olsen V. et al., 2014]. По результатам исследований ряд ученых пришли к выводу, что ММР3 оказывает влияние на процесс возникновения и прогрессирования атеросклероза [Sakowicz A. et al., 2013], ИМ и ИБС [El-Aziz T.A. et al., 2016]. Необходимо отметить, что полиморфизм -1612 5А/6А rs3025058 ММР3 ассоциирован с заболеваниями ССС [Saratzis A. et al., 2015].
Анализ средовых факторов риска развития ишемического инсульта и их совместного влияния с полиморфными вариантами генов MMPs на развитие болезни
Хорошо известно, что ишемический инсульт является типичным мультифакториальным заболеванием, в формировании которого играют роль сложные взаимодействия между генетическими и средовыми факторами [Humphries S.E., 2004; Bersano A., 2008; Boehme A.K., 2017]. В этой связи для понимания молекулярных механизмов развития болезни представляется принципиально важной задачей изучение совместного влияния полиморфных вариантов генов и средовых факторов риска.
С помощью анкетных ретроспективных данных в обследуемых группах пациентов нами были проанализированы известные средовые факторы риска развития инсульта: курение [Shah R.S., Cole J.W., 2010; Peters S.A., 2013], злоупотребление алкоголем [Zhang C., 2014; Jones S.B., 2015], психологические стрессы [Stuller K.A., 2012; Booth J., 2015] и низкий уровень физической активности [Middleton L.E., 2013; Wang X., 2014]. В таблице 13 представлены результаты сравнительного анализа средовых факторов риска в группах больных ишемическим инсультом и здоровых индивидов.
Как можно увидеть из представленных в таблице 13 данных, такие факторы, как курение, злоупотребление алкоголем, психологический стресс и гиподинамия, ассоциировались с повышенным риском развития ишемического инсульта независимо от пола и возраста пациентов.
Затем нами были оценены совместные влияния полиморфных вариантов генов MMPs и средовых факторов риска развития ИИ. В таблице 14 представлены результаты анализа влияния средовых факторов риска на развитие ИИ у носителей полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ. Анализ различных генетических моделей позволил выявить синергичные эффекты полиморфных вариантов генов MMP1 (rs1799750), MMP8 (rs11225395) и MMP9 (rs17576) и отдельных факторов на риск развития ИИ. В частности, установлено, что у лиц с генотипами 1G/1G-2G/2G MMP1 (эффект сверхдоминирования) и низким уровнем физической активности имеет место повышенный риск развития ИИ (corOR=1.86, 95% CI 1.21-2.86, P=0.004), тогда как у носителей данного генотипа с умеренной или высокой физической активностью влияние генотипа на риск развития ИИ не наблюдалось.
У некурящих индивидов выявлена отчетливая тенденция взаимосвязи генотипа C/T с пониженным риском развития ИИ (corOR=0.75, 95% CI 0.56-1.01, P=0.06), тогда как у курильщиков защитный эффект указанного генотипа не наблюдался. Защитный эффект в отношении развития ИИ также выявлен у некурящих индивидов носителей гомозиготного генотипа G/G MMP9 (corOR=0.33, 95% CI 0.15-0.74, P=0.007), в то время как у курильщиков с гетерозиготным генотипом A/G MMP9, напротив, имел место повышенный риск развития болезни (corOR=1.66, 95% CI 1.08-2.56, P=0.02). Кроме того, наблюдалась отчетливая тенденция в ассоциации генотипа A/G MMP9 с повышенным риском развития ИИ у лиц, злоупотребляющих алкоголем (corOR=2.55, 95% CI 0.80-8.10, P=0.057). Все выявленные нами генно-средовые взаимодействия, ассоциированные с риском развития ишемического инсульта, не зависели от пола и возраста пациентов.
Затем для кодоминантных моделей выявленных GxE взаимодействий дополнительно были проанализированы мультипликативные модели взаимодействия MMP9 с курением и злоупотреблением алкоголем, а также MMP2 с гиподинамией в детерминации риска развития ИИ. В таблице 15 представлены мультипликативные модели взаимодействия полиморфных вариантов генов MMP9, MMP2 и средовых факторов в детерминации риска развития ИИ. Из таблицы 15 видно, что с увеличением числа копий аллеля G гена MMP9 пропорционально увеличивались шансы развития ИИ среди курильщиков. Аналогичный тренд наблюдался и у лиц, злоупотребляющих алкоголем. Примечательно, что среди пациентов с гетерозиготным генотипом A/G лица, злоупотребляющие алкоголем, имели наиболее высокий риск развития ИИ (corOR 5.45 95% CI 1.85-16.01, P=0.001). Кроме того, обнаружено, что с увеличением числа копий аллеля T гена MMP2 увеличивались шансы развития ИИ у лиц с низким уровнем физической активности. Таким образом, в отношении полиморфных вариантов rs17576 гена MMP9 и rs243865 MMP2 нами установлен аддитивный эффект SNPs или т.н. allele dosage effect (эффект дозы аллеля) – ситуация, когда риск развития болезни у лиц, подвергающихся воздействию фактора риска, возрастает пропорционально числу унаследованных ими «рисковых» аллелей. В целом полученные результаты демонстрируют синергизм влияния полиморфных вариантов генов MMPs и известных средовых факторов риска на предрасположенность к ишемическому инсульту.
Моделирование межгенных и генно-средовых взаимодействий, формирующих предрасположенность к ишемическому инсульту
Анализ сложных межгенных генно-средовых взаимодействий представляет собой наиболее важный и сложный этап в изучении природы полигенных мультифакториальных заболеваний. Одним из наиболее популярных подходов, применяющихся с целью анализа межгенных и генно-средовых взаимодействий при мультифакториальных полигенных заболеваниях, является метод логистической регрессии [Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000; Moore J.H., Williams S.M., 2002]. В то же самое время известно, что данный метод, как, впрочем, и другие известные методы параметрической статистики, имеет существенное ограничение при его применении в анализе большого числа переменных, связанное с прогрессивным увеличением числа рассчитываемых параметров, которые в конечном счете существенно снижают статистическую мощность исследования [Peduzzi P. et al., 1996; Concato J. et al., 1996]. Одним из наиболее хорошо апробированных методов непараметрического анализа межгенных и генно-средовых взаимодействий является метод Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), предложенный Ritchie с соавторами [Ritchie et al., 2001; 2015; Moore, 2010] для моделирования сложных эпистатических взаимодействий между генами, которые невозможно оценить, используя традиционные параметрические подходы [Hahn et al., 2003; Moore, 2010]. Использование метода MDR в одновременной оценке взаимодействий множества SNPs позволяет уменьшить размерность числа рассчитываемых параметров путем конструирования новых переменных на основе пулирования генотипов повышенного и пониженного риска развития болезни, в результате чего снижается количество предикторных переменных до одномерного уровня. Сформированная таким образом одномерная переменная тестируется в отношении способности классифицировать и предсказывать фенотип болезни с оценкой ее статистической значимости с помощью пермутационного теста.
В рамках настоящего исследования для моделирования взаимодействия между генами, а также между генами и средовыми факторами риска при ишемическом инсульте нам использовался модифицированный метод MDR Model-Based-MDR (MB-MDR) с помощью статистического пакета mbmdr для R [Calle et al, 2008, 2010]. Первоначальной задачей было моделирование межгенных (GxG) взаимодействий, включающих полиморфные варианты генов матриксных металлопротеиназ и генов-кандидатов ишемического инсульта, установленных в рамках полногеномных ассоциативных исследований в европеоидных популяциях. Были протестированы двух-, трех- и четырех- локусные GxG модели и для каждой модели оценен эмпирический уровень значимости (Рретт) с помощью пермутационного теста. Установлена 21 статистически значимая ( perm 0.05) двухлокусная модель межгенных взаимодействий, ассоциированных с риском развития ишемического инсульта (приложение 1). В таблице 18 представлены результаты по 4 наилучшим двух-, трех- и четырехлокусным GxG моделям, ассоциированным с предрасположенностью к ИИ. Наилучшие двухуровневые GxG модели формировались за счет парных взаимодействий между полиморфными вариантами генов ММРЗ rs3025058, ММР8 rsl 1225395, ММР9 rsl7576, RASEF rs4322086 ZC3HC1 rs1 1556924. Причем три из четырех представленных в таблице 18 GxG моделей были полиморфными вариантами генов MMPs. Каждое трехуровневое сочетание SNPs включало по одному полиморфному варианту гена MMPs (данные варианты подчеркнуты): ММР8 rsl 1225395 х RASEF rs4322086 х ZC3HC1 rsl 1556924, MMPl rsl799750 x SLCOIBI rs899997 x RASEF rs4322086, MMP2 rs243865 x RASEF rs4322086 x ZC3HC1 rs1 1556924 и ММРЗ rs3025058 x RASEF rs4322086 x PEMT rsl2449964.
При анализе наилучших четырехлокусных GxG моделей нами было установлено, что в трех из четырех GxG моделей во взаимодействиях участвовали по два полиморфных варианта генов матриксных металлопротеиназ: ММРЗ rs3025058 х ММР8 rs 11225395 х RASEF rs4322086 х ZC3HC1 rs 11556924, ММР1 rs 1799750 х ММР9 т\7576 х SLCOIBI rs899997 x RASEF rs4322086, MMP3 rs3025058 x MMP8 rsl 1225395 x RASEF rs4322086 x PEMT rs 12449964. Указанные модели показали наилучшие статистики Вальда для GxG взаимодействия высокого риска развития ишемического инсульта (66.04-58.04-57.70 соответственно). В 4-й модели был представлен только один полиморфный вариант MMPs: ММР8 rsl 1225395 х LDLR rs6511720 х RASEF rs4322086 x ZC3HC1 rs1 1556924 (статистика Вальда 55.90). В совокупности нами были установлены 124 статистически значимые (Ррет О.05) трехлокусные GxG модели и 474 четырехлокусные модели межгенных взаимодействий, ассоциированных с риском развития ишемического инсульта (приложения 2 и 3 соответственно). Значительная доля выявленных моделей формировалась за счет полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ. Таким образом, биоинформатический анализ, выполненный методом MB-MDR, позволил нам сделать заключение, что полиморфные варианты генов матриксных металлопротеиназ являются важной компонентой полигенной предрасположенности к ишемическому инсульту и формируют статистически значимые взаимодействия с известными генами-кандидатами заболевания, установленными в результате полногеномных ассоциативных исследований в европеоидных популяциях.
Учитывая мультифакториальную полигенную природу ишемического инсульта, мы посчитали важным смоделировать с помощью метода MB-MDR генно средовые взаимодействия, формирующие предрасположенность к болезни. Главной задачей биоинформатического анализа была оценка соотносительного вклада исследуемых генетических и средовых факторов риска в развитие ишемического инсульта. Нами протестированы двух-, трех- и четырехлокусные GxG и GxE модели и оценены эмпирические уровни значимости с помощью пермутационного теста. В приложениях 4-6 представлены статистически значимые двух-, трех- и четырехуровневые генно-средовые и межгенные взаимодействия, ассоциированные с риском развития ишемического инсульта. В таблице 19 суммированы результаты по 4 наилучшим двух-, трех- и четырех- локусным GxG и GxE моделям, ассоциированным с развитием ИИ. Как можно увидеть из таблицы 19, среди 4 наилучших двухуровневых моделей 3 включали взаимодействия только средовых факторов в формировании риска развития ИИ, а именно: Курение х Гиподинамия, Алкоголь х Гиподинамия, Курение х Алкоголь. Четвертая модель включала взаимодействие только полиморфных вариантов генов ММРЗ rs3025058 х RASEF rs4322086. Напротив, среди 4 представленных в таблице 19 трехуровневых моделей (всего выявлено 403 статистически значимых модели) две формировались за счет взаимодействия полиморфных вариантов генов ММР8 rsl 1225395 х Курение х
Гиподинамия, ММР1 rsl799750 х Курение х Гиподинамия, одна - была представлена взаимодействием AIM1 rs783396 х Курение х Гиподинамия и еще одна включала взаимодействие трех средовых факторов риска: Курение х Алкоголь х Гиподинамия. Четырехуровневые модели формировались за счет ММРЗ rs3025058, ММР8 rs1 1225395, ММР12 rs2276109, ММР9 rsl7576, PEMT rsl2449964, гиподинамии и курения. Таким образом, можно сделать заключение, что средовые факторы риска, такие как курение, злоупотребление алкоголем и гиподинамия, характеризуются более ощутимым влиянием на риск развития ишемического инсульта в сравнении с исследованными полиморфными вариантами генов матриксных металлопротеиназ, а также известными генами - кандидатами предрасположенности к болезни. В то же самое время установлены генно-средовые взаимодействия, в том числе указанных факторов риска, с полиморфными вариантами генов MMPs: от общего числа установленных соответствующих п моделей 52% двухуровневых, 76% трехуровневых и 79% четырехуровневых моделей составляли именно модели, в состав которых входили различные полиморфные варианты генов матриксных металлопротеиназ.
In silico анализ молекулярных взаимодействий генов матриксных металлопротеиназ с генными сетями и метаболическими путями, вовлеченными в патогенез и клинические проявления ишемического инсульта
Для понимания полигенных механизмов развития ИИ и вовлеченности в них полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ нами был проведен in silico поиск биологических процессов и метаболических путей, которые могли бы иметь отношение к патогенезу ИИ, на основании спектра идентифицированных нами и описанных выше транскрипционных факторов, регуляторные эффекты которых способны реализоваться посредством взаимодействия с мотивами, расположенными в месте локализации трех полиморфных вариантов генов rs11225395 MMP8, SNP rs243865 MMP2 и rs2276109 MMP12. Ниже представлены результаты биоинформатического анализа, выполненного с использованием online инструмента Enrichment Analysis проекта Gene Ontology (GO, www.geneontology.org/). В качестве функциональных групп использовались биологические функции, которые контролируются теми или иными транскрипционными факторами. Уровень значимости генных онтологий с учетом множественных тестов оценивался методом FDR. SNP -799C T (rs11225395) гена MMP8
Анализ генных онтологий (GO: Gene Ontology, www.geneontology.org) по совокупности описанных выше транскрипционных факторов, ассоциированных с мотивом в области расположения SNP rs11225395 гена MMP8, позволил нам выделить многочисленные биологические функции и метаболические пути, которые контролируются данным спектром факторов транскрипции. Для нас наибольший интерес представляли те биологические процессы и метаболические пути, которые могут иметь отношение к патогенезу ишемического инсульта и его течению. В отношении регуляции липидного обмена, который имеет ключевое значение в формировании атеросклероза сосудов, были установлены следующие статистически значимые онтологии: регуляция секвестрации триглицеридов (GO:0010889, FDR=0.01), отрицательная регуляция секвестрации триглицеридов (GO:0010891, FDR=0.003), регуляция хранения холестерина (GO:0010885, FDR=0.01), отрицательная регуляция секвестрации холестерина (GO:0010887, FDR=0.005), регуляция дифференцировки пенных клеток из макрофагов (GO:0010743, FDR=0.04), отрицательная регуляция дифференцировки пенных клеток из макрофагов (GO:0010745, FDR=0.01), регуляция окисления жирных кислот (GO:0046320, FDR=0.02), положительная регуляция окисления жирных кислот (GO:0046321, FDR=0.01), отрицательная регуляция хранения липидов (GO:0010888, FDR=0.02) и регуляция липидного метаболизма (GO:0019216, FDR=0.05). В отношении другого механизма апоптоза, вовлеченного в патогенез ишемического инсульта, были установлены следующие статистически значимые онтологии: положительная регуляция процесса апоптоза (GO:0043065, FDR=0.04), положительная регуляция запрограммированной клеточной гибели (GO:0043068, FDR=0.04) и положительная регуляция клеточной гибели (GO:0010942, FDR=0.05).
В отношении механизмов регуляции биологических процессов, которые могут лежать в основе восстановления зоны повреждения в головном мозге при ишемическом инсульте и, соответственно, влиять на течение болезни, были выявлены статистически значимые онтологии: отрицательная регуляция пролиферации предшественников нейронов (GO:2000178, FDR=0.02), регуляция пролиферации нейробластов (GO:1902692, FDR=0.04), образование астроцитов (GO:0014002, FDR=0.04), дифференцировка астроцитов (GO:0048708, FDR=0.003), регуляция дифференцировки олигодендроцитов (GO:0048713, FDR=0.05), развитие коры головного мозга (GO:0021987, FDR=0.001), развитие глиальных клеток (GO:0021782, FDR=0.01), миелинизация (GO:0042552, FDR=0.02), ионная изоляция нейронов глиальными клетками (GO:0007272, FDR=0.02), энсхеатмент аксон (GO:0008366, FDR=0.02), дифференцировка глиальных клеток (GO:0010001, FDR=0.003), глиогенез (GO:0042063, FDR=0.008), развитие ЦНС (GO:0007417, FDR=0.00006) и развитие головного мозга (GO:0007420, FDR=0.01).
SNP rs243865 гена MMP2
Анализ генных онтологий по совокупности транскрипционных факторов, ассоциированных с мотивом в области расположения SNP rs243865 гена MMP2, позволил нам выделить биологические функции и метаболические пути, которые контролируются данным спектром факторов транскрипции. Выделены биологические процессы и метаболические пути, контролирующие развитие сердечно-сосудистой системы: васкулогенез (GO:0001570, FDR=0.0001), развитие кровеносных сосудов (GO:0001568, FDR=0.0000002), развитие системы сосудов (GO:0001944, FDR=0.0000002), морфогенез сосудов (GO:0048514, FDR=0.00001) и развитие сердечно-сосудистой системы (GO:0072358, FDR=0.0000003). Также были установлены статистически значимые генные онтологии, связанные с транскрипционной регуляцией апоптотического процесса: регуляция процесса апоптоза (GO:0042981, FDR=0.001), положительная регуляция процесса апоптоза (GO:0043065, FDR=0.02), регуляция запрограммированной клеточной гибели (GO:0043067, FDR=0.001), положительная регуляция запрограммированной клеточной гибели (GO:0043068, FDR=0.02), регуляция клеточной гибели (GO:0010941, FDR=0.0002), положительная регуляция клеточной гибели (GO:0010942, FDR=0.02) и отрицательная регуляция клеточной гибели (GO:0060548, FDR=0.02). SNP -82A G (rs2276109) гена MMP12
Анализ генных онтологий транскрипционных факторов, ассоциированных с мотивом в области локализации SNP rs2276109 гена MMP12, позволил выделить отдельные биологические функции и метаболические пути, которые контролируются данным спектром факторов транскрипции и могут быть связаны с патогенезом и течением ишемического инсульта (полный перечень статистически значимых генных онтологий представлен в приложении 18). Генные онтологии включали процессы, сопряженные с регуляцией апоптоза: регуляция клеточной гибели (GO:0010941, FDR=0.04), регуляция процесса апоптоза (GO:0042981, FDR=0.03) и регуляция запрограммированной клеточной гибели (GO:0043067, FDR=0.03). Также установлены статистически значимые онтологии, демонстрирующие вовлеченность в регуляцию метаболизма реактивных форм кислорода: клеточный ответ на реактивные формы кислорода (GO:0034614, FDR=0.02) и регуляция метаболического процесса реактивных форм кислорода (GO:2000377, FDR=0.04). Кроме того, выявлены генные онтологии, отражающие биологические процессы развития нервной системы: развитие нервной системы (GO:0007399, FDR=0.008), регуляция развития нервной системы (GO:0051960, FDR=0.009), положительная регуляция развития нервной системы (GO:0051962, FDR=0.04), нейрогенез (GO:0022008, FDR=0.03), регуляция нейрогенеза (GO:0050767, FDR=0.04) и положительная регуляция нейрогенеза (GO:0050769, FDR=0.004).
Принципиально важной задачей исследования был анализ молекулярных взаимодействий генов матриксных металлопротеиназ с генными сетями и метаболическими путями, вовлеченными в патогенез ишемического инсульта. Для решения поставленной задачи нами использовались биоинформатические инструменты базы данных STRING Database vl0.5 (https://string-db.org/) [Szklarczyk et al, 2017], которые позволяют выявлять функциональные партнеры (т.н. интерактомные карты) белков/генов, взаимодействующих с MMPs и характеризующихся потенциальной вовлеченностью в молекулярные звенья патогенеза ишемического инсульта. Для проведения анализа были отобраны полиморфные варианты генов только тех матриксных металлопротеиназ, которые показали надежные взаимосвязи с риском развития ишемического инсульта на основных этапах исследования (т.е. при анализе ассоциаций ИИ с SNPs, анализе GxG и GxE взаимодействий). Таким образом, нами были отобраны матриксные металлопротеиназы MMP1, MMP2, MMP3, MMP8 и MMP9.