Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 16-59
1.1 Современнaя концeпция этиолoгии и патогенезa эссенциальной гипертензии 16-22
1.2 Молекулярно-генетические аспекты эссенциальной гипертензии 22-33
1.3 Полиморфизм генов системы эндотелиновых пептидов 34-44
1.4 Полиморфизм генов бета-адренорецепторов 44-50
1.5 Полиморфизм гена сосудистого эндотелиального фактора роста А 51-53
1.6 Полиморфизм генов молекул клеточной адгезии ICAM-1 и VCАМ-1 53-59
Глава 2 Материалы и методы исследования 53-87
2.1 Формирование групп испытуемых и коллекции образцов биологического материала 60-70
2.2 Методы исследования 70
2.2.1 Клинико-лабораторное и инструментальное обследование 70-76
2.2.2 Методы молекулярной генетики 77-
2.2.2.1 Выделение тотальной геномной ДНК из цельной венозной крови 77
2.2.2.2 Метод полимеразной цепной реакции синтеза ДНК 78-82
2.2.2.3 Рестрикционный анализ амплифицированной ДНК 83
2.2.2.4 Электрофорез фрагментов ДНК 83-84
2.2.3 Статистические методы анализа результатов исследования. 84-87
Глава 3 Результаты исследования
3.1 Семейный анамнез и клинические особенности эссенциальной гипертензии у мужчин
3.2 Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов-кандидатов с эссенциальной гипертензией
3.3
Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов–кандидатов с уровнем артериального давления
3.4 Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов–кандидатов с показателями внутрисердечной гемодинамики и ремоделирования сердца у пациентов с эссенциальной гипертензией
3.5 Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов–кандидатов с эссенциальной гипертензией с учетом наличия избыточной массы тела и ожирения
3.6 Исследование роли межгенных взаимодействий аллельных вариантов генов-кандидатов в формировании предрасположенности к эссенциальной гипертензии
3.7 Прогнозирование риска развития эссенциальной гипертензии..
Глава 4 Обсуждение результатов исследования выводы практические рекомендации
Список литературы
- Молекулярно-генетические аспекты эссенциальной гипертензии
- Клинико-лабораторное и инструментальное обследование
- Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов-кандидатов с эссенциальной гипертензией
- Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов–кандидатов с эссенциальной гипертензией с учетом наличия избыточной массы тела и ожирения
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы исследования
Эссенциальная гипертензия (ЭГ) представляет собой хроническое заболевание, основным проявлением которого является стойкое повышение артериального давления (АД) при отсутствии каких-либо патологических процессов в организме, вследствие которых могло бы произойти повышение АД. На долю ЭГ приходится более 90% всех случаев артериальной гипертензии (АГ) [Чазова И.Е. и др., 2010]. Среди ведущих модифицируемых факторов риска инвалидизации и преждевременной смертности АГ занимает первое место. Распространенность ЭГ в большинстве стран мира такова, что это заболевание оценивают как величайшую неинфекционную пандемию. По состоянию на 2010 год 29.8% взрослого населения мира (1.33 миллиарда человек) страдали АГ (30.7% мужчин и 28.8% женщин) [Mills K.T. et al., 2015]. В России (по данным за 2006 год) распространенность АГ составила 39% среди мужчин и 41% среди женщин [Шальнова С.А. и др., 2008].
Несмотря на достигнутые успехи, до сих пор нет полного понимания и единой концепции этиологии и патогенеза ЭГ. Признано, что ЭГ является многофакторным полигенным заболеванием [Levy D. et al., 2009; Rafiq S. et al., 2010]. Она развивается в связи с влиянием факторов окружающей среды на генетически предрасположенный организм, характеризуется длительным латентным периодом и тяжелыми клиническими последствиями. К настоящему времени обозначены и детально исследованы отдельные патогенетические механизмы развития ЭГ, среди которых повышение активности симпатической нервной системы, активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, нарушение функций эндотелия, сосудистого тонуса, электролитного обмена. Этиология, патогенез и клинические проявления ЭГ могут иметь гендерные особенности [Брагина А.Е., 2016; Карпенко М.А., 2003]. Эта проблема мало изучена. Известно, что мужчины в большей мере предрасположены к развитию ЭГ в возрасте 35-50 лет, тогда как женщины в возрасте после наступления менопаузы; дебют АГ у мужчин приходится в основном на молодые годы, заболеваемость АГ нарастает постепенно на протяжении всей жизни. Показатели, характеризующие поражение органов-мишеней и эндотелиальную дисфункцию, связаны у мужчин с гемодинамическими параметрами и курением, тогда как у женщин – с ожирением и изменениями концентраций половых гормонов и альдостерона [Брагина А.Е., 2016].
Исследование полиморфизма генов представляет собой одно из направлений научного поиска, благодаря которому открываются перспективы для
понимания на молекулярно-генетическом уровне этиологии заболевания,
индивидуальной подверженности индивида к заболеванию, роли
наследственности в реализации эффектов средовых факторов риска. Поиск генов
предрасположенности к ЭГ интенсивно ведется как отечественными, так и
зарубежными исследователями. Результаты многочисленных работ обобщены в
обзорных статьях [Маркель А.Л., 2008; Arora P. et al., 2010; Ehret G.B. et al., 2013;
Munroe P.B. et al., 2013; Padmanabhan S. et al., 2015; Waken R.J. et al., 2017; Zhao Q.
et al., 2013; Zheng J. et al., 2015]. К настоящему времени стало очевидным, что
изучение молекулярно-генетических основ регуляции АД и развития ЭГ является
более сложной и трудоемкой задачей, чем это можно было прогнозировать,
учитывая наличие выраженного наследственного компонента в возникновении
заболевания. В частности, результаты проведенных полногеномных
ассоциативных исследований (GWAS – Genome-Wide Association Studies) позволили выявить более ста генетических маркеров, связанных с развитием ЭГ, которые в совокупности определяют лишь 2.2% вариабельности систолического и диастолического АД [Ehret G.B. et al., 2011]. Кроме того, существует проблема воспроизводимости результатов GWAS в популяциях разных народов. Получены неоднозначные, порой противоречивые, сведения в отношении ассоциации аллельных вариантов генов с ЭГ в популяциях разных народов мира, также выявлены гендерные особенности ассоциаций. Следует отметить, что многие исследования выполнены на выборках больных ЭГ, сформированных, главным образом, по критерию повышения АД и неоднородных по половому, этническому, геграфическому и другим признакам. В связи с этим высказываются предположения о том, что более многообещающим подходом в изучении наследственной предрасположенности к ЭГ может быть углубленное исследование аллельных вариантов генов, продукты которых входят в состав уже известных путей регуляции АД и являются мишенями антигипертензивной терапии, в детально фенотипированных выборках, в том числе с учетом пола, этнической принадлежности и региона проживания [Padmanabhan S. et al., 2012].
Население Российской Федерации этнически разнородно. Исследования по генетике многофакторных заболеваний, в том числе по генетике ЭГ, немногочисленны и выполнены, главным образом, на выборках из русского по этнической принадлежности населения [Булгакова И.В., 2014; Кривошей И.В., 2014; Матвеева В.А., 2012; Минушкина Л.О., 2008; Полоников А.В., 2006; Солодилова М.А., 2009; Тимашева Я.Р., 2008; Шестаков А.М., 2010].
В связи со сказанным выше были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования состояла в оценке вклада полиморфизма некоторых генов регуляции сосудистого тонуса и межклеточной адгезии в генетическую предрасположенность к эссенциальной гипертензии у мужчин, татар по этнической принадлежности.
Задачи:
-
Анализ клинических особенностей эссенциальной гипертензии у мужчин с отягощенным семейным анамнезом.
-
Генотипирование больных эссенциальной гипертензией и здоровых мужчин по полиморфным сайтам генов:
эндотелина 1 (EDN1, rs5370),
рецептора эндотелина А (EDNRA, rs6842241),
рецептора эндотелина В (EDNRB, rs5351),
эндотелинпревращающего фермента 1 (ECE1, rs213045),
бета-1-адренергического рецептора (ADRB1, rs1801252),
бета-2-адренергического рецептора (ADRB2, rs1042713),
бета-3-адренергического рецептора (ADRB3, rs4994),
- сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA, rs35569394, –
2549(18)I/D)),
молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1, rs5498),
васкулярной молекулы межклеточной адгезии 1 (VCAM1, rs3917010).
3. Анализ ассоциаций полиморфных сайтов перечисленных генов с параметрами
гемодинамики и клиническими показателями у больных эссенциальной
гипертензией.
4. Анализ ассоциаций с эссенциальной гипертензией полиморфных сайтов
перечисленных генов с учетом наличия факторов риска.
5. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании
предрасположенности к эссенциальной гипертензии.
6. Оценка потенциальной возможности аллельных вариантов генов-кандидатов
как предикторов развития эссенциальной гипертензии у мужчин.
Научная новизна полученных результатов
Впервые на однородной по гендерной и этнической принадлежности выборке (мужчины-татары) проведено исследование молекулярно-генетических основ ЭГ с использованием полиморфных сайтов генов EDN1, EDNRA, EDNRB, ECE1, ADRB1, ADRB2, ADRB3, VEGFA, ICAM1, VCAM1. Обнаружены ассоциации с заболеванием полиморфных сайтов генов EDNRA (rs6842241), EDNRB (rs5351) и ADRB2 (rs1042713). В результате анализа межгенных взаимодействий выявлены сочетания генотипов и/или аллелей, ассоциированные с развитием ЭГ у мужчин; в составе таких сочетаний, помимо аллельных вариантов генов EDNRA, EDNRB и ADRB2, представлены также аллельные варианты генов VCAM1, ADRB1, ADRB3,
ICAM1, EDN1, ассоциации с ЭГ каждого из которых в отдельности не были
выявлены. Установлено, что полиморфизм генов EDN1 (rs5370), VCAM1
(rs3917010), ICAM1 (rs5498) влияет на вариабельность показателей
диастолического АД (ДАД), гена ADRB2 (rs1042713) на вариабельность показателей систолического АД (САД) у здоровых мужчин, тогда как полиморфизм гена ICAM1 (rs5498) на вариабельность показателей ДАД, а генов VEGFA (rs35569394), EDNRB (rs5351) на вариабельность показателей САД у мужчин с ЭГ. Выявлена ассоциация полиморфного варианта rs213045 гена ECE1 с показателем функции ЛЖ сердца (ударным объемом) у мужчин с ЭГ. В целом получены новые знания о том, что полиморфизм генов регуляции сосудистого тонуса и молекул межклеточной адгезии играет роль в формировании предрасположенности к развитию ЭГ у мужчин.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования вносят вклад в обширный фактический материал о
роли полиморфизма генов в формировании предрасположенности к
многофакторным заболеваниям, способствуют более глубокому пониманию этиологии ЭГ у мужчин, открывают возможности как для детализации уже устоявшихся концепций, так и для выдвижения новых гипотез. Результаты исследования, в частности, разработанная прогностическая модель, могут применяться в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска развития заболевания среди мужчин-татар, проживающих в Республике Башкортостан. Данные, полученные в ходе исследования, используются в учебном процессе на кафедре факультетской терапии Башкирского государственного медицинского университета.
Методология и методы исследования
Диссертационная работа выполнена с использованием стандартной
методологии ассоциативных исследований типа «случай-контроль»; в качестве
маркеров были отобраны аллельные варианты генов-кандидатов заболевания.
Формирование выборки осуществляли на основе принципов биоэтики. Проводили
анализ сведений, изложенных в историях болезни и полученных в результате
анкетирования, лабораторных и инструментальных исследований. В работе
применяли современные методы молекулярно-генетического анализа.
Статистический анализ полученного массива данных выполняли с помощью пакетов программ SPSS V.21, ARLEQUIN V. 3.5, APSampler V. 3.6.0.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Полиморфные сайты генов EDNRA (rs6842241), EDNRB (rs5351) и ADRB2 (rs1042713) ассоциированы с ЭГ у мужчин.
-
Сочетания аллельных вариантов генов EDNRB (rs5351), EDNRA (rs6842241), ADRB1 (rs1801252), ADRB2 (rs1042713), ADRB3 (rs4994), EDN1 (rs5370), VCAM1
(rs3917010), ICAM1 (rs5498) при высоком уровне статистической значимости
ассоциированы с риском развития ЭГ у мужчин; самые высокие шансы развития
ЭГ определены для носителей сочетания
EDNRB*rs5351*G/G+ADRB2*rs1042713*A+VCAM1*rs3917010*A, низкие – для
носителей сочетания EDNRB* rs5351*A+EDNRA* rs6842241*C+ADRB3*
rs4994*T
3. Полиморфизм генов EDN1 (rs5370), VCAM1 (rs3917010), ICAM1 (rs5498)
ассоциирован с вариабельность показателей ДАД, гена ADRB2 (rs1042713) с
вариабельностью показателей САД у здоровых мужчин, тогда как полиморфизм
гена ICAM1 (rs5498) с вариабельностью показателей ДАД, а генов VEGFA
(rs35569394), EDNRB (rs5351) с вариабельностью показателей САД у мужчин с
ЭГ.
-
Полиморфный локус rs213045 гена ECE1 ассоциирован с состоянием сократительной функции левого желудочка у мужчин, страдающих ЭГ.
-
Индекс массы тела и генотипы EDNRB*G/G и ADRB2*G/G являются предикторами риска развития ЭГ у мужчин.
Степень достоверности и апробация результатов
Работа выполнена с использованием этнически однородных выборок больных ЭГ мужчин и практически здоровых мужчин без признаков сердечнососудистых заболеваний. Возраст манифестации заболевания в группе больных сопоставим с календарным возрастом в контрольной группе. Для достижения цели исследования были использованы современные молекулярно-генетические и статистические методы, адекватные поставленным задачам. Материалы диссертационной работы были представлены на Шестой Международной школе молодых учных по молекулярной генетике «Геномика и системная биология» (Звенигород, 2014), III Международном конгрессе «Артериальная гипертензия – от Короткова до наших дней» (Санкт-Петербург, 2015), Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2015), 25th European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection event (Milan, 2015), 5th World Congress on Controversies to Consensus in Diabetes, Obesity and Hypertension (Istanbul, 2015), Всероссийской конференции «Кардиология в XXI веке: традиции и инновации» (Рязань, 2016), 26th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Seoul, 2016), European society of cardiology congress (Rome, 2016), 26th European meeting on hypertension and cardiovascular protection (Paris, 2016), XIII Всероссийском форуме «Артериальная гипертензия 2017 как междисциплинарная проблема» (Уфа, 2017).
Личное участие автора
Цель, задачи и дизайн исследования разработаны совместно с научными руководителями. Основные результаты получены непосредственно автором
работы. Соискатель самостоятельно изучил литературу по теме диссертации, написал рукопись данной работы. Обсуждение и подготовка к опубликованию результатов исследования выполнены автором с помощью руководителей и сотрудников лаборатории физиологической генетики ИБГ УНЦ РАН.
Публикации
По итогам проведенного исследования опубликовано 13 научных работ, в числе которых три статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа «Роль полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса и молекул межклеточной адгезии в формировании предрасположенности к эссенциальной гипертензии у мужчин» соответствует формуле специальности 03.02.07 – «Генетика». В данной диссертации исследован полиморфизм генов-гандидатов ЭГ и выявлены аллельные варианты генов, предрасполающие к развитию заболевания у мужчин, татар по этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан.
Структура и объм диссертации
Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 14 рисунков. Библиографический список включает 357 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.
Молекулярно-генетические аспекты эссенциальной гипертензии
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в результате проведенного исследования материалы важны для популяционно-генетической характеристики разных этнических групп населения Российской Федерации, они вносят вклад в обширный фактический материал о роли полиморфизма генов в формировании предрасположенности к многофакторным заболеваниям, способствуют более глубокому пониманию этиологии ЭГ у мужчин, открывают возможности как для детализации уже устоящихся концепций, так и для выдвижения новых гипотез. Они могут быть использованы при проведении дальнейших исследований по генетике ЭГ. Разработанная прогностическая модель может применяться в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска развития заболевания среди мужчин-татар, проживающих в Республике Башкортостан. Данные, полученные в ходе исследования, используются в учебном процессе на кафедре факультетской терапии Башкирского государственного медицинского университета.
Методология и методы исследования
Диссертационная работа выполнена с использованием стандартной методологии ассоциативных исследований типа «случай-контроль»; в качестве маркеров были отобраны аллельные варианты генов-кандидатов заболевания. Формирование выборки осуществляли на основе принципов биоэтики. Проводили анализ сведений, изложенных в историях болезни и полученных в результате анкетирования, лабораторных и инструментальных исследований. В работе применяли современные методы молекулярно-генетического анализа. Геномную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Геномное типирование проводили либо посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), либо посредством ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом. Праймеры и эндонуклеазы рестрикции подбирали с помощью стандартных программ. Статистический анализ полученного массива данных выполняли с помощью пакетов программ «SPSS V.21», «ARLEQUIN V. 3.5», «APSampler V. 3.6.0».
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Полиморфные сайты генов EDNRA (rs6842241), EDNRB (rs5351) и ADRB2 (rs1042713) ассоциированы с ЭГ у мужчин. 2. Сочетания аллельных вариантов генов EDNRB (rs5351), EDNRA (rs6842241), ADRB1 (rs1801252), ADRB2 (rs1042713), ADRB3 (rs4994), EDN1 (rs5370), VCAM1 (rs3917010), ICAM1 (rs5498) при высоком уровне статистической значимости ассоциированы с риском развития ЭГ у мужчин; самые высокие шансы развития ЭГ определены для носителей сочетания EDNRB rs5351 G/G+ADRB2 rs1042713 A+VCAM1 rs3917010 A, низкие – для носителей сочетания EDNRB rs5351 A+EDNRA rs6842241 C+ADRB3 rs4994 T. 3. Полиморфизм генов EDN1 (rs5370), VCAM1 (rs3917010), ICAM1 (rs5498) ассоциирован с вариабельностью показателей ДАД, гена ADRB2 (rs1042713) с вариабельностью показателей САД у здоровых мужчин, тогда как полиморфизм гена ICAM1 (rs5498) с вариабельностью показателей ДАД, а генов VEGFA (rs35569394), EDNRB (rs5351) с вариабельностью показателей САД у мужчин с ЭГ. 4. Полиморфный локус rs213045 гена ECE1 ассоциирован с состоянием сократительной функции левого желудочка у мужчин, страдающих ЭГ. 5. Индекс массы тела и генотипы EDNRB G/G и ADRB2 G/G являются предикторами риска развития ЭГ у мужчин, татар по этнической принадлежности. Степень достоверности и апробация результатов Работа выполнена с использованием этнически однородных выборок пациентов с ЭГ и практически здоровых мужчин без признаков сердечно сосудистых заболеваний. По возрасту манифестации заболевания группа больных сопоставима с календарным возрастом контрольной группы. Для достижения цели исследования были использованы современные молекулярно-генетические и статистические методы, адекватные поставленным задачам.
Материалы диссертационной работы были представлены на Шестой Международной школе молодых учных по молекулярной генетике «Геномика и системная биология» (Звенигород, 2014), III Международном конгрессе «Артериальная гипертензия – от Короткова до наших дней» (Санкт-Петербург, 2015), Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2015), 25th European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection event (Milan, 2015), 5th World Congress on Controversies to Consensus in Diabetes, Obesity and Hypertension (Istanbul, 2015), Всероссийской конференции «Кардиология в XXI веке: традиции и инновации» (Рязань, 2016), 26th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Seoul, 2016), European society of cardiology congress (Rome, 2016), 26th European meeting on hypertension and cardiovascular protection (Paris, 2016). Личное участие автора Цель, задачи и дизайн исследования разработаны совместно с научными руководителями. Основные результаты получены непосредственно автором работы. Соискатель самостоятельно изучил литературу по теме диссертации, написал рукопись данной работы. Обсуждение и подготовка к опубликованию результатов исследования выполнены автором с помощью руководителей и сотрудников лаборатории физиологической генетики ИБГ УНЦ РАН. Публикации По итогам проведенного исследования опубликовано 13 научных работ, в числе которых три статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Диссертационная работа «Роль полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса и молекул межклеточной адгезии в формировании предрасположенности к эссенциальной гипертензии у мужчин» соответствует формуле специальности 03.02.07–генетика. В данной диссертации исследован полиморфизм генов-гандидатов ЭГ и выявлены аллельные варианты генов, предрасполающие к развитию заболевания у мужчин, татар по этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан.
Клинико-лабораторное и инструментальное обследование
Изучение генов, ответственных за синтез компонентов ренин-ангиотензиновой системы, позволило обнаружить связь полиморфного варианта rs699 (M235T, NM_000029.3:c.803T C, NP_000020.1:p.Met268Thr) гена ангиотензиногена (AGT) с развитием гипертензии и повышением концентрации ангиотензиногена в плазме крови [Jeunemaitre X, 1992]. Полиморфизм rs699 гена AGT характеризуется однонуклеотидной заменой, обуславливающей несинонимичную замену M235T в аминокислотной последовательности белка, которая не влияет на стабильность молекулы белка. Однако впоследствии было обнаружено, что данный полиморфный вариант находится в неравновесном сцеплении с однонуклеотидным полиморфизмом rs5051 в коровой последовательности промотора гена AGT (A-6G, NM_000029.3:c.-44G A), который ассоциирован с повышением уровня экспрессии гена [Inoue I. et al., 1997]. Чтобы установить роль полиморфных вариантов, влияющих на экспрессию гена AGT в регуляции АД, была создана линия мышей с различным числом копий гена agt [Smithies O., Kim H. S., 1994]. Титруя дозу гена, авторы продемонстрировали наличие корреляции между числом копий гена и содержанием ангиотензиногена в плазме крови, а также наличие положительной линейной зависимости между числом копий гена и уровнем АД [Kim H. S., 1995]. Несмотря на то, что найденная ассоциация полиморфизма гена AGT с гипертензией является биологически обоснованной и получила подтверждение в экспериментах с лабораторными животными, попытки воспроизвести полученный результат в разных популяциях не увенчались успехом [Doria A. et al., 1996; Mondry A. et al., 2005]. Подобные противоречия обнаружены и в отношении полиморфизма, обусловленного делецией в гене ангиотензинпревращающего фермента (ACE), который ассоциирован с уровнем фермента в плазме крови [Das M. et al., 2008; Gu X. X. et al., 1994; Ji L. D. et al., 2010; Rigat B. et al., 1990]. Другим примером, иллюстрирующим, насколько затруднительно экстраполировать данные, полученные в результате экспериментов с использованием модельных объектов, на человека, является ген глутатион-S-трансферазы (GSTM1). В экспериментах со склонными к возникновению инсульта спонтанно гипертензивными крысами (SHRSP) была установлена возможная роль GSTM1 в качестве гена-кандидата АГ [Jeffs B. et al., 2000]. В почках у крыс линии SHRSP наблюдалось снижение активности глутатион-S-трансферазы, сопровождающееся повышением уровня окислительного стресса [McBride M. W. et al., 2005]. Снижение уровня глутатион-S-трансферазы в гладкомышечных клетках сосудов также способствует увеличению выработки АФК и пролиферации клеток [Yang Y. et al., 2009]. Несмотря на то, что была выявлена связь полиморфных вариантов гена GSTM1 с гипертензивной нефропатией и хронической почечной недостаточностью, ассоциаций с АГ обнаружить не удалось [Agrawal S. et al., 2007; Chang J. et al., 2013; Delles C. et al., 2008].
Для поиска генов, обуславливающих вариабельность уровня АД и предрасположенность к ЭГ, были разработаны подходы и технологии полногеномных ассоциативных исследований. Результаты таких исследований каталогизируются на сайте Национального института исследований генома человека (NHGRI) и Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI) [Welter D. et al., 2014]. Полногеномный скрининг свободен от концепции ген-кандидатного подхода. Он заключается в анализе с использованием значительно количества (от 500000 до 1 миллиона) редких, или, напротив, распространенных аллелей (частота минорного аллеля составляет не менее 5% в популяции) в выборках большой численности, поэтому принятый уровень значимости составляет 5 х 10-7. Для повышения статистической силы исследования, результаты GWAS объединяют с целью проведения мета-анализа. Кроме того, при помощи данных, полученных при генотипировании представителей отдельных популяций, которые доступны в «International HapMap Project» и «1000 Genomes Project», проводится изучение дополнительных SNP, находящихся в неравновесном сцеплении с вариантами, идентифицированными при GWAS [Abecasis G. R. et al., 2010; Frazer K. A. et al., 2007]. Вспомогательным методом является картирование генов, связанных с развитием заболевания, аллельные варианты которых встречаются с различной частотой в разных этнических группах (admixture mapping analysis). Данный подход является перспективным в отношении АГ, так как это заболевание имеет различную распространенность в разных расовых и этнических группах [Deo R. C. et al., 2007; Zhu X. et al., 2011]. К настоящему времени по результатам нескольких исследований выявлены «полногеномного» уровня значимости ассоциации с ЭГ отдельных полиморфных маркеров [Franceschini N. et al., 2010; Hastie C. E. et al., 2010; Hindorff L. A. et al., 2009; Rafiq S. D. et al., 2010; Zheng J. et al., 2015]. В то же время в работе, где в качестве маркеров анализировались однонуклеотидные замены в 160 генах, не было получено значимых результатов [Sober S. et al., 2009]. Ни одна из ассоциаций в данном исследовании не подтверждалась после введения поправки Бонферрони на множественность сравнений. В результате одного из первых полногеномных исследований, проведенных консорциумом Wellcome Trust Case Control Consortium (2000 больных ЭГ, 3000 лиц контрольной группы, проживающих в Великобритании) также не было выявлено маркеров риска заболевания [Caulfield M. et al., 2003]. Безрезультатным оказалось и другое масштабное исследование (KORA– Kooperative Gesundheitsforschung in der RegionAugsburg) [Org E. et al., 2009]. Однако в итоге выполнения ряда исследований были идентифицированы, как предрасполагающиe к ЭГ, гены STK39 и CDH13, подтверждена роль генов РААС (ACE, AGT, AGTR1, CYP11B2, NR3C2, REN) [Levy D. et al., 2007; Org E. et al., 2009; Wang Y. et al., 2009]. Неожиданные результаты были получены в проекте, в котором с помощью панели из 800000 SNP и выборки из 1017 афроамериканцев (жителей США) нашли ассоциации с ЭГ полиморфных сайтов генов PSM1, SLC24A4, YWHA7, IPO7, CACANAH1H. Эти гены кодируют белки, играющие определенную роль в регуляции разнообразных процессов (в чатности, репарации ДНК, транспорте ионов, метаболизме углеводов и аминокислот, связыванию и импорту рибосомальных белков). Однако, исходя из современных концепций регуляции АД и патогенеза ЭГ, как полагают авторы, эти гены трудно причислить к генам-кандидатам АД и ЭГ [Adeyemo A. et al. 2009].
Более обнадеживающие результаты были получены в ходе выполнения проектов в рамках двух консорциумов: Global BPgen (Global Blood Pressure Genetics, 34433 больных ЭГ в первом исследовании, 99802 – во втором) и CHARGE (Cohorts for Heart and Aging Research in Genome Epidemiology, 29136 больных) [Levy D. et al., 2009; Newton-Cheh C, et al., 2009]. По результатам Global BPgen было открыто восемь ассоциированных с заболеванием хромосомных локусов (1p36, 10q24, 17q21, 4q21, 10q21, 12q24, 15q24 и 17q21). Обнаруженные локусы включают гены, которые относятся к «правдоподобным» генам-кандидатам ЭГ: MTHFR, CLCN6, NPPA, NPPB, AGTRAP (1p36), CYP17A1, AS3MT, CNNM2, NT5C2 (10q24), PLCD3, ACBD4, HEXIM1, HEXIM2 (17q21), FGF5, PRDM8, c4orf22 (4q21), c100orf107, TMEM26, RTKN2, RHOBTB1, ARID5B (10q21), SH2B3, ATXN2 (12q24), CYP1A1, CYP1A2, CSK, LMAN1L, CPLX3, ARID3B (15q24), ZNF652, PHB (17q21). По результатам CHARGE идентифицированы гены, ассоциированные с САД (тринадцать генов), ДАД (двадцать генов) и ЭГ, (десять генов).
Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов-кандидатов с эссенциальной гипертензией
Проводилось комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. Пациенты были опрошены на предмет наличия жалоб, были проанализированы данные медицинского анамнеза, результаты обследования с помощью клинико-лабораторных и инструментальных методов, в том числе результаты ЭКГ-обследования (в 12 стандартных отведениях), эхокардиографического, доплеровского исследования, холтеровского мониторирования (по показаниям), велоэргометрии. При объективном осмотре оценивались антропометрические показатели, производилось измерение роста (с точностью до 0.5 см) и массы тела (с точностью до 0.1 кг). Для дальнейшего анализа использовали такой показатель как ИМТ или индекс Кетле-II, формула которого приведена ниже. ИМТ (кг/м2) = масса тела (кг) / рост (м)2.
ИМТ считали нормальным при его величине 18.5-24.99 кг/м2, об избыточной массе тела заявляли, если ИМТ составлял 25.0-29.9 кг/м2 , ожирение регистрировали при ИМТ 30 кг/м2 и более (согласно Национальным рекомендациям по кардиоваскулярной профилактике, 2011). Для уточнения наличия абдоминального ожирения измерялась окружность талии (горизонтально, на середине расстояния между 12-м ребром и гребнем подвздошной кости с точностью до 0.5 см), абдоминальное ожирение признавали при окружности талии 94 см и более [Национальные рекомендации по кардиоваскулярной профилактике, 2011]. Площадь поверхности тела определяли по формуле: масса тела 0,425(кг)хрост 0,725 (см)х0,007184 (г/м2). Измерение АД проводили на правой руке при помощи стандартного сфигмоманометра трехкратно аускультативным методом Н. С. Короткова после 5-минутного отдыха в положении сидя с точностью до 2 мм рт ст. В качестве САД регистрировали первую, а в качестве ДАД пятую фазу тонов Короткова. Определяли среднее значение АД по стандартной формуле. В соответствии с рекомендациями экспертов Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), Международного общества артериальной гипертензии (МОАГ) и Всероссийского Научного Общества Кардиологов (ВНОК) уровень АД, равный или превышающий 140/90 мм.рт.ст., расценивали как наличие АГ. При значениях САД или ДАД 140-150/90-99 мм.рт.ст. определяли АГ первой степени, 160-179/100-109 мм.рт.ст. - АГ второй степени, 180/110 мм.рт.ст. и более - АГ третьей степени.
Пациентов, которые выкуривали не менее одной сигареты в день, относили к группе регулярных курильщиков.
Оценка семейного анамнеза проводилась путем анкетирования по вопросам, представленным в стандартном опроснике ВОЗ «Семейный анамнез»; отмечали наличие ССЗ (АГ и других, случаи нарушений мозгового кровообращения, инфаркта миокарда, смерти по причине инсульта) у родителей, родных братьев и сестер, детей, т.е. у родственников 1-ой степени родства. Семейный анамнез считали отягощенным при наличии у опрошенных участников исследования 2-х или более больных родственников.
Лабораторные методы обследования включали в себя выполнение общих и биохимического анализов крови и мочи. Забор крови для исследования проводили из локтевой вены утром натощак после 12-ти часового голодания. Для получения сыворотки кровь инкубировали при комнатной температуре, а затем центрифугировали (3000 об/мин, 15 минут), образцы замораживались и хранились (-70С) до проведения анализа. Концентрацию глюкозы (ммоль/л) в сыворотке венозной крови определяли глюкозооксидазным методом натощак с использованием диагностических наборов фирмы «Biocon» (Германия). Нормальными значениями считали уровень гликемии менее 5.6 ммоль/л; при содержании глюкозы натощак от 5.6 ммоль/л до 7.0 ммоль/л устанавливали гипергликемию натощак; лица, имеющие гликемию натощак 7.0 и более ммоль/л в исследование не включались. Концентрация сывороточного креатинина определялась фотометрическо-колориметрическим методом по Jaffe; нормальными показателями считали значения в диапазоне 80-115 мкмоль/л, повышение концентрации креатинина диагностировали при уровне превышающим 116 мкмоль/л (Рекомендации Европейского Общества Кардиологов по лечению артериальной гипертонии, 2007). Функциональное состояние почек оценивали также по расчетной скорости клубочковой фильтрации (СКФ), определяемой по формуле СKD-EPI по креатинину (согласно Национальным рекомендациям по основным принципам скрининга, диагностики, профилактики и подходы к лечению хронической болезни почек 2009 г. в модификации 2011 г.) [Смирнов А. В. и др., 2012]: СКФ=141х(0.993)Возрастх(Креатинин сыворотки, мг/дл/0.9)0412, при концентрации креатинина в сыворотке крови не более 80 мкмоль/л; СКФ=141х(0.993)Возрастх( Креатинин сыворотки, мг/дл/0.9)-1210, при концентрации креатинина в сыворотке крови более 80 мкмоль/л; где СКФ - скорость клубочковой фильтрации, Была проведена стандартизация формулы с учетом площади поверхности тела, поэтому результаты расчета для СКФ даны в мл/мин/1.73м2.
Анализ ассоциаций полиморфных сайтов генов–кандидатов с эссенциальной гипертензией с учетом наличия избыточной массы тела и ожирения
Для анализа межгенных взаимодействий и поиска сочетаний генотипов и/или аллелей, ассоциированных с ЭГ, использовали алгоритм APSampler. Было получено множество возможных (2587) уникальных сочетаний, из которых после введения поправки на множественность сравнений осталось девять паттернов, статистически значимо ассоциированных с ЭГ (таблица 15).
Наиболее часто в составе сочетаний, ассоциированных с ЭГ, обнаруживались аллели и генотипы полиморфного участка rs5370 гена EDNRB (представлен в 8 из 9 паттернов), в пяти из девяти сочетаний – аллель rs1042713 A гена ADRB2, в трех из девяти – аллель rs3917010 A гена VCAM1. Аллельные варианты генов ADRB1 (rs1801252 A), ADRB3 (rs1042713 A), ICAM1 (rs5498 E) и EDNRA (rs6842241) представлены в 2 из 9 комбинаций каждый, и аллель rs5370 G гена EDN1 обнаружен в составе лишь одного сочетания, ассоциированного с ЭГ. Выявлено шесть сочетаний, предрасполагающих к развитию ЭГ, и три сочетания протективного эффекта в отношении риска развития заболевания. Самый высокий риск развития ЭГ определен для носителей сочетания, состоящего из трех составных элементов: EDNRB rs5351 G/G+ADRB2 rs1042713 A+VCAM1 rs3917010 A (OR=4.15, CI: 2.68–6.44, PBonf=5.43 10–8); на рисунке 11 представлена диаграмма Эйлера-Венна, характеризующая взаимодействие компонентов этого сочетания.
Сочетания генотипов и/или аллелей исследуемых полиморфных сайтов генов-кандидатов, ассоциированные с риском развития эссенциальной гипертензии у мужчин Генотип или аллель в составе сочетания Частота, % р рBonf OR (CI) SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 Контроль ЭГ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EDNRB rs5351 G/G ADRB2 rs1042713 A VCAM1 rs3917010 A 20.57 51.81 4.22 10n 5.43 108 4.15 (2.68-6.44) EDNRB rs5351 G/G ADRB2 rs1042713 A - 25.24 54.12 2.03 109 2.61 106 3.49(2.30-5.32) EDNRB rs5351 G/G VCAM1 rs3917010 A - 33.97 63.78 1.43 109 1.83 106 3.42 (2.27-5.15) EDNRB rs5351 G ADRB2 rs1042713 A VCAM1 rs3917010 A 47.85 70.47 3 106 0.004 2.6(1.72-3.92) EDNRB rs5351 G 1С AMI rs5498 E ADRB1 rsl801252 A ADRB2 rs1042713 A 35.58 56.38 3.42 105 0.04 2.31 (1.54-3.46) EDN1 rs5370 G ADRB1 rsl801252 A ADRB2 rs1042713 A 1С AMI rs5498 E 37.71 58.46 1.97 105 0.03 2.19 (1.52-3.19) EDNRB rs5351 A EDNRA rs6842241 C ADRB3 rs4994 T - 58.37 27.27 з іо–10 3.86 107 0.27 (0.18-0.41) 133 Продолжение таблицы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EDNRB rs5351 A EDNRA rs6842241 C 60.29 29.32 3.47 1(T10 4.47 1 T7 0.27 (0.18-0.41) EDNRB rs5351 A ADRB3 rs4994 T 58.57 29.9 4.88 1(T9 6.28П0-6 0.3 (0.20-0.46) Примечание: р – уровень значимости, рBonf – уровень значимости с поправкой Бонферрони на множественность сравнений, OR (odds ratio) – показатель соотношения шансов, CI – 95% доверительный интервал показателя соотношения шансов 134 Рисунок 11 – Диаграмма Эйлера-Венна, характеризующая взаимодействие компонентов сочетания EDNRB G/G+ADRB2 A+VCAM1 A, для которого была выявлена ассоциация с эссенциальной гипертензией при помощи программы APSampler [Favorov A. V. et al., 2005]. Примечание: каждый круг символизирует один из составных элементов сочетания, а области пересечения кругов соответствуют их комбинациям; окраска этих областей варьирует в пределах градиентной шкалы, представленной на рисунке, в соответствии со значениями ORR (отношение отношения шансов, определяющееся путем деления OR, полученного для комбинации двух компонентов, на произведение OR, полученных для них обоих при индивидуальном анализе) [Lvovs D. et al., 2012].
Следует отметить, что, хотя в составе комбинаций, ассоциированных с ЭГ, как и ожидалось, представлены аллельные варианты генов, для которых обнаружена ассоциация с заболеванием при индивидуальном анализе (EDNRB, ADRB2), тем не менее, рассмотрение межгенных взаимодействий позволило выявить значимость в детерминации риска ЭГ тех аллельных вариантов генов VCAM1, ADRB1, ADRB3, ICAM1, EDN1, которые не были ассоциированы с этим заболеванием каждый в отдельности, или уточнить роль, которую играют отдельные компоненты, входящие в состав сочетаний. Так, нами была найдена ассоциация с ЭГ четырхаллельного сочетания EDN1 rs5370 G+ADRB2 rs1042713 A+ICAM1 rs5498 E+ADRB1 rs1801252 A (OR=2.19, CIOR 1.52–3.19, PBonf=0.030) (рисунок 12). Для трх компонентов этого составного маркера (EDN1 rs5370 G, ICAM1 rs5498 E, ADRB1 rs1801252 A) не было выявлено ассоциаций с ЭГ при индивидуальном анализе. В тоже время, хотя и не было выявлено ассоциации с ЭГ аллеля ADBR2 rs1042713 A или генотипа ADBR2 rs1042713 A/A, было показано, что генотип ADBR2 rs1042713 A/G является предрасполагающим в отношенни риска развития ЭГ (OR=1.68), а генотип ADBR2 rs1042713 G/G – протективным (OR=0.58). Также следует отметить, что полиморфные сайты генов, аллельные варианты которых входят в состав выявленных сочетаний, ассоциированы с показателями АД у нормотензивных мужчин (rs5370 гена EDN1, rs1042713 гена ADRB2, rs3917010 гена VCAM1, rs5498 гена ICAM) и пациентов с ЭГ (–2549(18)I/D гена VEGFA, rs5351 гена EDNRB, rs5498 гена ICAM), с ЭГ при избыточной массе тела (rs5351 гена EDNRB). Это дает основание полагать, что в наблюдаемых ассоциациях сложно-составных маркеров с ЭГ могут играть роль ассоциации этих маркеров с показателями физиологических признаков.
Диаграмма Эйлера-Венна, характеризующая взаимодействие компонентов сочетания EDN1 G+ADRB2 A+ICAM1 E+ADRB1 A, для которого была выявлена ассоциация с эссенциальной гипертензией. Примечание: то же, что и к рисунку 11 Таким образом, в результате анализа межгенных взаимодействий нами обнаружены сочетания генотипов и/или аллелей, ассоциированные с развитием ЭГ мужчин, татар по этнической принадлежности.
Для оценки возможной роли различных факторов, анализируемых в проведенном исследовании, как предикторов развития ЭГ был проведен логистический регрессионный анализ. В качестве предикторов использовали бинарные (качественные) и количественные переменные. Разрабатывались статистические модели оценки вероятности развития ЭГ с последующим отбором оптимальной модели. Модель с наилучшими предиктивными качествами отбиралась на основании ряда критериев. Принималась во внимание статистическая значимость модели, статистически значимые эффекты каждого из предикторов, значения процента правильной классификации больных ЭГ и здоровых. Оценку уравнений регрессии выполняли методом пошагового включения предикторов. Относительный вклад каждого из предикторов оценивали с помощью величин статистик Вальда, стандартизированных коэффициентов регрессии, уровней значимости. Процент правильной классификации использовали как критерий согласия реального распределения наблюдений по отдельным градациям факторов риска на основе уравнения логистической регрессии. Наличие или отсутствие ЭГ рассматривали в качестве зависимой дихотомической переменной, в качестве независимых переменных – возраст, ИМТ, наличие наследственной предрасположенности к ССЗ, носительство генотипов по полиморфным сайтам генов-кандидатов. С помощью метода логистической регрессии установлено влияние на формирование ЭГ таких переменных, как ИМТ, генотипы EDNRА А/А, EDNRB G/G, ADRB2 A/G, ADRB2 G/G. Результаты анализа представлены в таблице 16 и на рисунке 13.