Введение к работе
Актуальность темы. Вопрос о том, через какие механизмы программа, записанная в геноме зиготы, реализует себя во взрослый организм, является центральным не только для биологии развития, его решение будет иметь принципиальное значение для всей биологии в целом. Поскольку цитоплазма яйцеклетки играет исключительно важную роль в раннем развитии всех животных (уже сам объем яйцеклетки указывает на это), то прояснение вопроса об уровнях взаимодействий ядро-цитоплазма, происходящих на первых этапах цитодиф-ференцировки и морфогенеза, представляется одним на возможных подходов к решению данной проблемы.
Дискуссия между преформистами и эпигенетиками разрешилась принятием идеи о том, что первичным толчком к дифференцировке клеточных линий является унаследование, в результате оошизмати-ческой сегрегации, определенного участка цитоплазмы зиготы. Во исследования, проводимые на млекопитающих, не подтверждают эту гипотезу. Если это действительно так, то раннее развитие млекопитающих, в филогенетическом ряду позвоночных, является в своем роде уникальным.
Первый вопрос, обсуждаемый нами, - зто вопрос о том, почему же эволюция онтогекезов, идя в направлении замены мозаичного типа развития регуляторним, лишь у млекопитающих прошла весь путь до конца. "Но для того, чтобы понять эмбриональное развитие, нас должно интересовать не только то, что происходит, но и то, когда это происходит"(Satoh, 1982). Вопрос о механизме биологических часов развития успешно решается на земноводных, но данные, полученные для млекопитающих немногочисленны и в большинстве своем противоречивы. Суть проблемы заключается в том, что ни ядерно-цитоп-лазматическое соотношение (ЯЦС), ни количество циклов репликации ДНК, ни какой-либо другой фактор клеточного цикла не является ключевым в запуске первых морфогенетических процессов у млекопитающих.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение систем регуляции, используемых ранними зародышами млекопитающих, их сравнение с нижестоящими видами, рассмотрение закономерностей эволюционных преобразований, происходивших в филзмбриоге-незе позвоночных. В задачи исследования входило: изучение расположения бластомеров друг относительно друга, относительно оси
анизотропии ооцита, с целью выявления возможных закономерностей в дроблении зародышей; разработка метода нарушения пространственной организации морфогенетических детерминант (если таковые имеются) в цитоплазме зиготы, наблюдение за развитием зигот с перемешанной цитоплазмой. Основной задачей данной работы было изучение роли ЯЦС в запуске процесса кавитации. Для этого изучалось влияние неблагоприятных условий на развитие доимплантационных зародышей. Одним из путей прояснения роли ЯЦС в раннем развитии было наблюдение за параметрами развития гаплоидных, триплоидных зигот, зародышей с измененным объемом цитоплазмы. Изначальной целью работы по изучении влияния субоптимальных условий на процессы морфогенеза было выявление критерия жизнеспособности морул и бластоцист, развившихся in vitro. Но оказалось, что подученные результаты южно использовать для прояснения роли ЯЦС в регуляции раннего развития, поэтому основная часть экспериментов была спланирована для решения именно этой задачи.
Научная новизна. Разработан метод перемешивания цитоплазмы зигот млекопитающих; микроманипуляционные методы, используемые для пересадок ядер, впервые применены для получения триплоидов, зародышей с измененным объемом цитоплазмы. Впервые неопровержимо доказано, что механизм ооплазматической сегрегации не участвует в процессе дифференцировки на первых этапах развития млекопитающих. Шказано, что ЯЦС не играет решающей роли в механизме биологических часов раннего развития млекопитающих. Обсуждены закономерности перехода от мозаичного типа развития к регуляторному, возможные причины, позволившие лишь млекопитающим пройти весь этот путь до конца
Практическая ценность. Преодоление технических трудностей, стоящих на пути клонирования . млекопитающих, является одной из центральных практических задач экспериментальной эмбриологии. Но результаты работ, проведенных за последние 10 лет, указывают на то, что модифицировать систему такой сложности, как ядро дифференцированной клетки, просто путем его пересадки в энуклеирован-ный ооцит или зиготу, весьма маловероятно. Проведенные нами исследования взаимоотношений ядра и цитоплазмы в раннем развитии указывают на то, что, в отличие от земноводных, цитоплазма зигот млекопитающих .не обладает регуляторними свойствами и, соответственно, не способна "перепрограммировать" дифференцированный геном. Наш вывод заключается в том, что для решения проблемы клони-
' .' 2
рованин млекопитающих необходимо привлечение других методов перепрограммирования генома, помимо пересадки ядра в энуклеиро-ванный ооцит или зиготу.
Вами показано, что подсчет числа клеток у морул и бластоцист, развившихся in vitro, лучше характеризует жизнеспособность зародышей, чем процент развития до морфологически нормальных бластоцист. Этот метод ухе был использован нами в лаборатории IVF Illinois для проверки качества срод, используемых при in -vitro оплодотворении и культивировании человеческих преэмбрионов.
Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертации, были представлены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1988), 11-м Международном эмбриологическом конгрессе. (Ійдерланда, 1989).
Публикации. Содержание работы изложено. в 9 публикациях в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух глав, заключения и выводов. Диссертация изложена на 111 стр. содержит 11 рисунков и 5 таблиц. Список литературы содержит 212 работ отечественных и аарубежных авторов.