Роль генетических факторов в развитии и эффективности терапии параноидной шизофрении Гареева Анна Эмировна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 20

1.1.Эпидемиология шизофрении 21

1.2.Этиология и патогенез шизофрении 22

1.3.Генетические факторы развития шизофрении 34

1.4.Исследование генов-кандидатов с развитием шизофрении 44

1.5. Полногеномные ассоциативные исследования 74

1.6.Фармакогенетические исследования эффективности антипсихотиков

1.7.Фармакодинамические исследования эффективности антипсихотиков

1.8.Фармакокинетические исследования эффективности антипсихотиков

1.10.Фармакогенетические тест-системы 105

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 108

2.1. Материалы исследования 108

2.2. Методы исследования 109

2.2.5. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени с флуоресцентной меткой

2.2.6. Анализ полиморфных вариантов генов с помощью биочипа 118

2.2.7. Генотипирование с использованием SNPlex платформы (Applied Biosystems)

2.2.8. Полногеномное генотипирование полиморфных локусов 126

2.3.Клинико-диагностические методы 127

2.4.Статистическая обработка полученных результатов 128

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 135

3.1.Анализ генетической структуры выборки русских, татар и башкир по данным полногеномного исследования

3.2. Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы

3.2.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов дофаминергической системы с развитием параноидной шизофрении

3.2.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов серотонинергической системы с развитием параноидной шизофрении

3.2.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов глутаматергической системы с развитием параноидной шизофрении

3.2.4.Анализ ассоциации полиморфных локусов rs2746071, rs2746072, 243 rs2746073, rs4606, rs3767488 гена RGS2 с риском развития параноидной шизофрении

3.2.5.Анализ ассоциации полиморфного варианта rs2270641 гена SLC18A1 с развитием параноидной шизофрении

3.2.6.Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов нейротрофинов и нейрексинов с развитием параноидной шизофрении

3.2.7.Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов, ассоциированных с шизофренией по данным полногеномных исследований, с развитием параноидной шизофрении

3.3. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов нейротрансмиттерных систем с эффективностью терапии галоперидолом

3.3.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов дофаминергической и серотонинергической систем с эффективностью терапии галоперидолом

3.3.2.Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов глутаматергической системы с эффективностью терапии галоперидолом

3.4.Полногеномный анализ ассоциации. 360

3.4.1.Полногеномный анализ ассоциации в объединенной выборке больных

3.4.2.Полногеномный анализ ассоциации параноидной шизофрении в этнических группах русских, татар и башкир

3.5.Анализ межгенных взаимодействий в формировании 461

предрасположенности к развитию параноидной шизофрении 3.6.Мета-анализ результатов исследования 476

Заключение 480

Выводы 500

Список литературы

• Полногеномные ассоциативные исследования
• Анализ полиморфных вариантов генов с помощью биочипа
• Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы
• Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов дофаминергической и серотонинергической систем с эффективностью терапии галоперидолом

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Шизофрения одно из тяжелейших психических заболеваний. По некоторым оценкам данное заболевание поражает от 0,3 до 0,7% населения земного шара (Bosia et al., 2015). По оценкам ВОЗ в мире насчитывается около 45 миллионов больных шизофренией. Заболевание манифестирует в молодом возрасте 15-25 лет, имеет хроническое течение, приводящее к инвалидизации и социальной дезадаптации, ложась бременем на семью и общество.

За более, чем 50 летнюю историю изучения шизофрении, показано, что в развитии данного многофакторного заболевания играют роль как генетические, так и средовые факторы. Однако, генетические факторы, безусловно, играют определяющую роль в предрасположенности к шизофрении. Коэффициент наследуемости шизофрении составляет около 80%, что характерно для наиболее высоко наследуемых многофакторных заболеваний (Bosia et al., 2015).

Степень разработанности темы исследования

В мире ведётся активный поиск генов, отвечающих за формирование предрасположенности к шизофрении и индивидуальной чувствительности к нейролептикам, что связано с несомненной актуальностью изучения факторов риска развития шизофрении. К настоящему времени выполнены анализы ассоциации шизофрении по полиморфным вариантам 1000 генов, что ставит шизофрению среди наиболее изучаемых заболеваний. Проведено более двадцати полногеномных анализов сцепления, выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием шизофрении 1q21-q22 (Brustowicz et al., 2000; Rosa et al., 2002; Zheng et al., 2006); 8p21 (Kendler et al., 1996; Blouin et al., 1998; Gurling et al., 2001); 13q32 (Blouin et al., 1998; Brustowicz et al., 1999) и 6p21-p22 (Moises et al., 1995; Straub et al., 1996; Schwab et al., 2000; Maziade et al., 2001).

Метод полногеномных ассоциативных исследований GWAS, позволяющий одновременно генотипировать несколько сотен тысяч полиморфных локусов генов, является результатом колоссальных технологических достижений и в настоящее время ускоряет преобразование исследования многофакторных заболеваний. За последние годы было проведено более 30 GWAS с риском развития шизофрении в различных популяциях мира, обнаружены новые гены, ассоциированные с развитием шизофрении у европейцев: Xp22.32/Yp11.3(CSF2RA) (Lencz et al., 2007), 8p12 (NRG1), 2q32.1 (ZNF804A) (O’Donovan et al., 2008; Williams et al., 2011), 6p22.1 (HIST1H2AG), 2q34 (ERBB4) (Shi et al., 2009), 12q24.23 (CCDC60), 22q11.2 (MYO18B) (Kirov et al., 2009), 6p21 (область главного комплекса гистосовместимости MHC), 11q24 (NRGN), 18q21 (TCF4) (Stefansson et al., 2009), 15q25.2 (ADAMTSL3) (Need et al., 2009), 9p21 (PLAA), 16p12 (ACSM1), 10q21 (ANK3) (Athanasiu et al., 2010), 1q43 (SDCCAG8) (Ripke et al., 2013); в азиатских популяциях: 10q26 (OAT) (Ikeda et al., 2010); 6p23 (JARID2) (Liu et al., 2009). 7q22 (RELN) у евреев (Shifman et al., 2008).

Одно из последних крупномасштабных полногеномных ассоциативных исследований было проведено в 2014 г. в рамках консорциума PGC-SZ с участием

36989 больных шизофренией и 113075 здоровых индивидов. В результате этого исследования была установлена ассоциация полиморфных локусов генов дофаминергической - ген DRD2, и глутаматергической нейротрансмиссии – гены GRIN2A, GRIA1, GRM3 с риском развития шизофрении, что согласуется с одной из ведущих гипотез развития шизофрении – гипофункцией глутаматергической системы (Ripke et al., 2014; Zang et al., 2015).

В целом, генетические исследования показали сложность генетической архитектуры шизофрении, а также ее полигенную природу. Одна из гипотез состоит в том, что один или несколько путей патогенеза объединяет многие эмпирические данные, полученные при изучении шизофрении. Однако, механизмы, благодаря которым эти однонуклеотидные варианты повышают риск шизофрении до сих пор остаются непонятными. Биологическая роль этих ОНП и то, как они взаимодействуют с другими генами и средовыми факторами пока не ясны (Giusti-Rodriguez et al., 2013). Таким, образом, выявлено, что в этиопатогенезе шизофрении принимает участие множество функционально взаимосвязанных генов, среди которых гены дофаминергической, глутаматергической, серотонинергической нейротрансмиссии, семейства нейротрофинов и нейрексинов, сигнальной трансдукции. В России несколькими группами исследователей проводилось изучение полиморфных вариантов генов дофаминергической, серотонинергической и глутаматергической системы и нейротрофинов (Голимбет с соавторами, 2005; Колесниченко с соавторами, 2005). Полногеномные ассоциативные исследования ОНП в российских популяциях не проводились.

В настоящее время антипсихотики являются единственным типом препаратов, использующихся в лечении шизофрении. Эффективность терапии шизофрении антипсихотиками демонстрирует неудовлетворительные результаты. Так, более 20% больных шизофренией определяют, как антипсихотикорезистентные, означающее, что пациент не чувствителен по крайней мере к двум нейролептикам, один из которых принадлежит ко второму поколению (атипичных) (Bosia et al., 2015). Именно комбинация факторов, влияющих на лекарственный метаболизм (фармакокинетика) и действие лекарственного препарата (фармакодинамика), лежат в основе различий в ответе на один и тот же препарат (Pouget et al., 2014). Существует очевидный генетический вклад в вариабельности ответа на психотропные препараты. Более того, известно, что побочные эффекты, вызванные приемом этих препаратов, могут иметь еще более сильную генетическую компоненту (Ravyn et al., 2013). Идентификация специфических генетических полиморфных локусов, лежащих в основе наследственной предрасположенности ответа на психотропные препараты, находится в активной фазе в течение последних 20 лет (Pouget et al., 2014).

Несмотря на многочисленность генетических исследований шизофрении и фармакогенетических исследований нейролептиков, полученные результаты противоречивы, плохо воспроизводятся в последующих работах и характеризуются наличием выраженных межэтнических различий. Широкая вариабельность

клинических проявлений шизофрении и эффективности антипсихотических препаратов свидетельствует о необходимости изучения как общих генетических факторов риска развития шизофрении, так и специфических факторов, предрасполагающих к определенным эндофенотипам данного заболевания. В связи с этим, актуальной проблемой является идентификация этноспецифических факторов риска развития параноидной шизофрении, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболевания и разрабатывать профилактические мероприятия с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. На основании вышесказанного определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Комплексный анализ генетической предрасположенности к развитию параноидной шизофрении и индивидуальной чувствительности к типичному нейролептику -галоперидолу.

Задачи исследования

1. Провести анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов-кандидатов дофаминергической системы - DRD2 DRD3 DRD4, COMT, серотонинергической системы - HTR2A, TPH1), глутаматергической системы - GRM3, GRIA2, GRIK2, GRIN2B, переносчиков моноаминов - SLC18A1, системы нейротрофинов и нейрексинов - BDNF, NTRK2, NTRK3, NGF, NXPH1, NRXN1, гена регулирующего сигнальную активность G-белка - RGS2, генов, ассоциированных с развитием шизофрении по данным ранее проведенных полногеномных ассоциативных исследования - CACNA1C, ANK3, ZNF804A, RELN, DISC1 у больных параноидной шизофренией и в контрольной группе индивидов.

2. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с предрасположенностью к параноидной шизофрении с учетом ряда клинических характеристик и этнической принадлежности индивидов.

3. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с эффективностью терапии больных шизофренией типичным нейролептиком галоперидолом с учетом этнической принадлежности индивидов.

4. Провести полногеномный анализ ассоциации 576335 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием параноидной шизофренией с учетом этнической принадлежности индивидов, наследственной предрасположенности, типом течения заболевания и суицидального поведения.

5. Провести репликативное исследование локусов, ассоциированных с параноидной шизофренией, по данным полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) в независимой выборке больных.

6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию параноидной шизофрении с учетом этнической принадлежности индивидов.

7. Провести мета-анализ результатов исследования ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием параноидной шизофрении у индивидов русской и татарской этнической принадлежности.

Научная новизна работы

Впервые молекулярно-генетическое исследование параноидной шизофрении проведено у индивидов русской, татарской и башкирской этнической предрасположенности с использованием двух основных подходов, применяемых в настоящее время для поиска генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям – исследование генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциаций. Проведен анализ ассоциации генов дофаминергической системы DRD2 (rs1800497, rs6275), DRD3 (rs6280) DRD4 (rs4646984, rs747302), COMT (rs165599, rs4818, rs4680), генов серотонинергической системы HTR2A (rs79970, rs6311, rs6313, rs6314), TPH1 (rs1800532), генов глутаматергической системы GRM3 (rs274622, rs187993, rs6465084), GRIA2 (rs6536221, rs4441804, rs4302506), GRIK2 (rs2227281, rs2227283, rs2235076, rs995640), GRIN2B (rs1805502, rs1805476, rs1805247, rs1805482, rs7301328, rs34315573), гена транспортера моноаминов SLC18A1 (rs2270641), генов семейства нейротрофинов и нейрексинов BDNF (rs2203877, rs7124442, rs6265, rs10767665, rs1491850), NTRK2 (rs10465180, rs1899640, rs11140800, rs1443445, rs2289658, rs4406490), NTRK3 (rs1435402, rs1946698, rs7170062, rs11631508, rs12594283, rs3825884, rs1110306, rs11073767, rs11629691, rs7176520), NGF (rs7523086, rs12145726), NXPH1 (rs7795595, rs10272916, rs7801099, rs2349488, rs6952939, rs2107280, rs6974213, rs4455737, rs886505), NRXN1 (rs17572910, rs10490168, rs12995518, rs1469157, rs1217436, rs694309, rs2678228, rs4971552, rs1469794, rs11885824), семейства генов регулирующих сигнальную активность G-белка RGS2 (rs2746071, rs2746072, rs2746073, rs4606, rs3767488), генов, ассоциированных с развитием шизофрении по данным ранее проведенных полногеномных ассоциативных исследования CACNA1C (rs1006737), ANK3 (rs10761482), ZNF804A (rs1344706), RELN (rs7341475), DISC1 (rs3737597). Выявлены маркеры риска развития различных клинико-патогенетических вариантов параноидной шизофрении и эффективности терапии типичным нейролептиком галоперидолом.

Впервые проведен полногеномный анализ ассоциации 576335

однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием параноидной формы шизофрении у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Идентифицированы полиморфные локусы, ассоциированные с развитием параноидной шизофрении с полногеномным уровнем значимости. Обнаружена выраженная ассоциация параноидной шизофрении с полиморфными локусами, локализованными в областях 1q23.3, 4p15.2, 20q13.31. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития параноидной шизофрении у русских, татар и башкир.

Впервые определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов, дофаминергической, глутаматергической систем и

системы нейротрофинов, предрасполагающих к развитию шизофрении у индивидов русской и татарской этнической принадлежности.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к параноидной шизофрении. На основании результатов данного исследования разработан патент на изобретение № 2506595. Приоритет изобретения 26 апреля 2012 г. Зарегистрирован 10 февраля 2014 г. «Способ прогнозирования риска развития параноидной шизофрении». Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития параноидной шизофрении и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Методология и методы исследования

Методологическую основу работы составил системный подход, позволяющий
рассматривать различные аспекты патогенеза и поиска диагностических критериев
такого тяжелого психического заболевания как параноидная шизофрения, на основе
использования комплекса методов включающего медико-статистический,

клинический, генетический, анализ литературных источников, ведущих

отечественных и зарубежных ученых в области психиатрической генетики.

Источниками информации служили данные медицинской документации, истории болезней, специальные анкеты, банк ДНК больных параноидной шизофренией и здоровых индивидов. Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН, Эстонском Биоцентре г. Тарту, Институте молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта. Полногеномное ассоциативное исследование и биостатистическая обработка данных проведена в Университете г. Кардифф, Великобритания в рамках международного консорциума по психиатрической генетике PGC (Psychiatric Genome Consortium).

Положения, выносимые на защиту

7. Развитие параноидной шизофрении у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов HTR2A, DRD2, DRD4, GRM3, SLC18A1, GRIA2, GRIN2B, RGS2, NTRK3, NXPH1, у татар - с полиморфными вариантами генов TPH1, DRD4, GRM3, SLC18A1, GRIK2 GRIN2B, RGS2, RELN.

8. Маркерами повышенного риска непрерывного типа течения параноидной шизофрении у русских являются аллель rs6314*C и генотип rs6314*C/C гена HTR2A, rs1800497*A2 и rs1800497*A2/A2 гена DRD2, rs4646984*S и rs4646984*L/S гена DRD4, rs187993*G и rs187993*G/G гена GRM3, rs2270641*A и rs2270641*A/A гена SLC18A1, rs1805247*T и rs1805247*T/T гена GRIN2B, rs1805476*A и rs1805476*A/A гена GRIN2B, rs2746071*G и

rs2746071*G/G, гена RGS2. У татар - аллель rs747302*G и генотип rs747302*G/G гена DRD4, rs4646984*S гена DRD4, rs6280*S/G гена DRD3, rs6465084*A и rs6465084*A/A гена ОТйШ, rs2270641*A/A гена SLC18A1, rsl805247*T и rs1805 247 "Т/Тгена GRIN2B, rs2746071 *G и rs2746071 *G/G гена

3. Маркерами повышенного риска эпизодического типа течения параноидной шизофрении у русских являются аллель rs!800497*A2 и генотип rsl800497*A2/A2 гена 7Ш)2, rs4646984*S гена /ШН rsl87993*G и ra7S7993*G/G гена ОТйШ. У татар - аллель rs 1800532*А и генотип rs!800532*A/A гена 7ТЯ7, rs747302*G/G гена DRD4, rs4646984*S гена7J7?Z>/, rs6465084*A и rs6465084*A/A гена ОТйШ, rs4302506*C гена GtfL42, rs27 46071 *G и rs27 46071 *G/G гена ЖЖ.

4. Маркерами эффективности галоперидола у русских в отношении негативной симптоматики являются генотипы rs6313*C/C гена ЯГД24, rsl800532*C/C гена 7ТЯ7, rs6280*S/S гена /Ш)5, rs!87993*T/T гена ОТйШ; в отношении общепсихопатологической симптоматики - rs 1800532*С/С гена 7ТЯ7 и rs2270641*C/C гена SLC18A1; в отношении позитивной симптоматики -: rs4646984*L/L гена 7Ш)4, rs4818*G/G гена С(9МГ; у татар - в отношении негативной симптоматики являются генотипы rs4680*H/H гена С<9МГ, rs6465084*G/G гена ОТйШ, rs4606*С/С гена RGS2, в отношении позитивной симптоматики - rs6465084*G/G гена GRM3; у русских и татар в отношении позитивной симптоматики - rs!800497*Al/Al гена DRD2, общепсихопатологической симптоматики - rs4818*G/G гена СОМТ.

5. Маркерами низкой эффективности галоперидола у русских в отношении негативной симптоматики являются генотипы - rs4441804*C/C гена GRIA2 и rs2227281*T/T гена GRIK2, в отношении позитивной симптоматики -rs4441804*C/C гена GRIA2. У татар в отношении негативной и общепсихопатологической симптоматики является генотип rs!805502*C/C гена GRIN2B.

6. По данным полногеномного анализа, наиболее высокий уровень ассоциации ПШ обнаружен с полиморфным локусом rs 192927334 (р=5,99Е-08; pfdr=2,11Е-03). Обнаружена ассоциация полиморфных локусов rs73254185, гена РНК LOC105374536 (р=3,7Е-09; pfdr=0,0116) и rs587778384 гена GNAS (р=6,13Е-07; pfdr=0,017). С наибольшей частотой аллели и генотипы повышенного риска данных локусов встречались у больных с непрерывным типом течения.

7. Этноспецифическим маркером риска развития параноидной шизофрении, идентифицированным при полногеномном анализе ассоциации у татар, является полиморфный вариант rsl2376586 (р=1,89Е-07; pfdr=0,005), расположенный в области 9q21.12. В этнических группах русских и башкир этноспецифических маркеров риска ПШ не установлено.

8. Комбинации полиморфных вариантов генов предрасполагают к развитию параноидной шизофрении у индивидов русской DRD2*COMT, RGS2*GRIN2B и татарской этнической принадлежности BDNF*NTRK2, NXPH1*NTRK3, BDNF*NTRK3, GRM3*DRD2.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных в ходе исследования результатов подтверждена применением современных молекулярно-биологических и биостатистических подходов и объемом проведенной работы.

Результаты исследования соответствуют данным, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Проведенный статистический анализ подтверждает достоверность полученных результатов. Выводы полностью и в строгой логической последовательности отражают полученные результаты.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: международных конференциях Европейского общества генетики человека (Барселона, 2008, Гетеборг,2010, Нюренберг, 2012, Париж, 2013, Милан, 2014, Глазго, 2015), европейского конгресса по нейропсихофармакологии (Париж, 2011; Вена, 2012, Берлин, 2014, Амстердам, 2015), VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011), Х Научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014), IV Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014), VII Съезда Российского общества Медицинских Генетиков (Санкт-Петербург. 2015), Международной научной конференции Научного Парка СПбГУ (Санкт-Петербург, 2015).

Личный вклад

Автором лично разработана идея и дизайн исследования. Все результаты, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора, начиная с этапа планирования, разработки методических подходов и их выполнения, сбора первичных данных, создания банка ДНК больных параноидной шизофрении и контрольных групп сравнения, проведения экспериментальных исследований, статистического анализа полученных данных, обобщении и апробации полученных результатов на конференциях различного уровня, а также написания и оформления статей в научные журналы и рукописи диссертации и автореферата.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 49 печатных работ, в том числе 15 статей в журналах, рекомендуемых ВАК по теме диссертации, 5 глав в 3 коллективных монографиях, 1 патент на изобретение, 15 публикаций, посвященных исследованиям в области психогенетики.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа «Роль генетических факторов в развитии и эффективности терапии параноидной шизофрении» соответствует формуле специальности «03.02.07 – Генетика (биологические науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и

реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Генетика человека. Медицинская генетика».

Полногеномные ассоциативные исследования

Было сделано предположение о том, что позитивная симптоматика при шизофрении развивается вследствии гиперактивности дофаминергической нейротрансмиссии (Laruelle et al., 2014) Классическая дофаминергическая гипотеза развития шизофрении основана на выявлении высоких концентраций дофамина в терминалях и D2 рецепторах субкортикальной области головного мозга и прилежащем ядре (Laruelle et al., 2014). По мере накопления знаний в этой области, была сформулирована гипотеза о том, что дефицит дофаминовой нейротрансмиссии в рецепторах дофамина DRD1 в префронтальной коре головного мозга, может быть вовлечен в развитие когнитивных нарушений и негативной симптоматики при шизофрении (Laruelle et al., 2014). Конвергенция доклинических и клинических данных предполагает, что дисфункция дофаминергической системы может происходить вслед за нарушением функции NMDA рецепторов. В настоящее время становится ясным то, что дофаминергическая система играет модулирующую роль в работе глутаматергической системы (Laruelle et al., 2014). Результаты ряда исследований показали повышение пресинаптической дофаминергической активности у больных шизофренией, не получавших лечение в дорсальном стриатуме, а не в вентральном. В дополнении к данному факту, была обнаружена корреляция снижения дофаминергической активности в вентральном стриатуме с тяжестью негативной симптоматики у больных, не получающих лечения (Laruelle et al., 2014).

Внутриутробное воздействие материнской вирусной инфекции ассоциируется высоким риском развития шизофрении и других психических расстройств, вследствии нарушения нейронального развития ЦНС у плода (Luchicchi et al., 2016). Известно, что факторы иммунного ответа оказывают негативное воздействие на созревание головного мозга, что и является предрасполагающим фактором возникновения патологии в будущем по мере развития ребенка. Поскольку нейроны дофаминергической системы вентральной области покрышки и их регионы мишени играют существенную роль патогенезе шизофрении и других эндогенных психозов, многие исследователи пытаются объяснить, каким образом происходит нарушение дофаминовой активности и ее функционирования на моделях «активации иммунной системы у матери». Luchicchi с соавторами использовали иммунно опосредованную модель нарушения нейронального развития, основанную на пренатальном применении полирибоинозиновой-полирибоцитидиловой кислоты (PIC) у крыс для имитации вирусной инфекции и последующего нарушения поведения подобного шизофрении у потомства. В результате было обнаружено, что у взрослых крыс, при применении данного вещества (PIC) наблюдался дефицита сенсорного регулирования, памяти, социального взаимодействия и увеличение уровня дофамина в прилежащем ядре головного мозга, а не в префронтальной коре. Также наблюдалось снижение спонтанного разряда и активности популяции дофаминовых нейронов. Таким образом, данные результаты подтверждают, что активация иммунной системы у матери может вызывать тяжелые нарушения в дофаминергической системе у плода (Luchicchi et al., 2016).

Нарушение глутаматного нейромедиаторного пути лежит в основе гипоглутаматергической гипотезы шизофрении, являющейся одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении и привлекающей внимание исследователей в последнее время. Глутамат является основным возбуждающим нейротрансмиттером ЦНС его используют все нейроны коры головного мозга, проецирующие аксоны за её пределы. Все рецепторы глутамата подразделяются на ионотропные и метаботропные. К ионотропным рецепторам глутамата (ИРГ) относят NMDA рецепторы: (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRIN3B), каинатные (GRIK1, GRIK2, GRIK3, GRIK4, GRIK5) и AMPA (GRIA1, GRIA2, GRIA3, GRIA4A). ИРГ инициируют быструю деполяризацию, обеспечивая проникновение натрия или кальция в нейроны через каналы, образованные самим рецептором. Уникальность NMDA рецепторов состоит в том, они открываются сочетанием двух «ключей» - лигандов и напряжения, и активируются только при совпадении деполяризационного смещения мембранного потенциала и присоединения глутамата к рецептору. Механизм действия метаботропных рецепторов глутамата mGlu1-8 заключен в модулировании нейротрансмиссии посредством активации механизмов синаптической передачи с участием G-протеинов. Сообщается о способности некоторых mGlu-рецепторов, особенно подтипа mGlu5, тесно взаимодействовать с NMDA-рецепторами и напрямую модулировать функции рецепторного канала NMDA. Изменения степени аффинности рецепторов глутамата, их транскрипции, и измененная экспрессия их субъединиц в префронтальной коре головного мозга, гиппокампе, и таламусе больных шизофренией обнаружены post mortem (Clinton, Meador-Woodruff, 2004). Кроме того, примерами послужили и снижение количества субъединиц NR1 рецептора NMDA в гиппокампе и фронтальных зонах коры головного мозга, повышенную экспрессию переносчиков глутамата (EAAT) в таламусе, и изменения в NMDA-связанных внутриклеточных белках, таких как PSD95 и SAP102, в префронтальной коре и таламусе. Метод визуализации с использованием нового SPECT-трейсера рецептора NMDA (1231I) CNS-1261 (Pilowsky et al., 2005) позволил наблюдать снижение связывания с NMDA-рецептором в гиппокампе пациентов, не получающих лечение. Данные результаты иллюстрируют недостаточность NMDA-рецепторов при шизофрении.

Анализ полиморфных вариантов генов с помощью биочипа

Основная группа исследования включала 817 неродственных индивидов (437 мужского пола, 380 женского пола) с диагнозом параноидной шизофрении с непрерывным и эпизодическим типом течения заболевания. Обследованные являлись пациентами Республиканской клинической психиатрической больнице №1 Министерства здравоохранения Республики Башкортостан. Диагноз был установлен согласно с международной классификации болезней десятого пересмотра (МКБ-10). Средний возраст больных составил 24,9±8,9 лет. Средний возраст начала заболевания составил 22,4±7,3 лет. На каждого больного путем индивидуального опроса и анализа истории болезни была заполнена специально разработанная анкета, в которую заносились паспортные данные больных, жалобы, клинико-анамнестические данные, все проводимые общеклинические и специальные методы исследования.

Состав общей выборки больных параноидной шизофренией по этнической принадлежности был следующим: русские - 320, татары – 357, башкиры – 139.

Из 817 больных ПШ общей выборки, у 258 индивидов (110 русских и 148 татар), была проведена оценка эффективности терапии типичным нейролептиком – галоперидолом в 1 день назначения препарата, а затем на 21 и 45 дни по шкале позитивных и негативных симптоматики (PANSS).

В качестве контроля исследована группа, состоящая из 989 индивидов (402 русских, 383 татар, 204 башкир) той же возрастной группы, не состоявшие на учёте у психиатра и нарколога и отрицавшие у себя отягощённую наследственность по психическим заболеваниям. Средний возраст здоровых доноров составил 32,4±12,4 года. Независимая выборка больных состояла из 190 индивидов (68 русской, 61 татарской и 61 башкирской этнической принадлежности). Независимая выборка контроля состояла из 238 здоровых индивидов: 95 русских, 83 татар и 60 башкир. Все участники исследования или их законные представители дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований. Данное исследование было одобрено локальным биоэтическим комитетом ИБГ УНЦ РАН.

ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Кровь набирали в стерильныепробирки, содержащие мелкодисперсный антикоагулянт EDTA-K3 (производство GreenCross MS Corp., Корея).

Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера (320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MDBPl2, 10мМ трис-HCl, pH 7,6) и центрифугировали при 40С и 4000 об./мин. в течение 20 минут. Над осадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 минут. К полученному осадку добавляли 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0, 75 мМNaCl). Затем ресуспензировали полученный раствор и переносили его в стерильные пластиковые пробирки объёмом 2 мл, добавляли 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали при 370С в течение 16 часов.

Экстракцию ДНК проводили в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола – Трис-HCI, pH 7,8), смесью фенола – хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3.

Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -200С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Амплификацию изученных локусов (DRD2 (rs1800497, rs6275), DRD3 (rs6280), DRD4 (-616C G, 120-bp VNTR), GRIN2B (rs34315573, rs1805502, rs7301328, rs1805482, rs1805247, rs1805476), RGS2 (rs2746073, rs2746072, rs3767488, rs2746071, rs4606), GRIK2 (rs2235076, rs2227283, rs995640, rs2227281) проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик» производства компании «ДНК-технология» (г.Москва).

Перечень исследованных локусов, их обозначения, последовательности специфических олигонуклеотидных праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в таблице. Праймеры для генотипирования полиморфных большей части локусов изученных генов (табл. 2) были подобраны самостоятельно с помощью программы Primer3 v.0.4.0 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Для большинства локусов амплификация была выполнена в 15 мкл общего объема смеси, содержащей следующие обязательные компоненты: 25 мМTris-HCl, pH 8.4, 50 мМKCl, 1,5 мМ MDBPl2, 250мкМ каждого dNTP, по 10 пмоль каждого из праймеров, 10-20 нг тотальной ДНК и 0,05 единицы Taq ДНК-полимеразы Termusaquaticus (производства фирмы «Cилекс», г. Москва).

Для определения нуклеотидных замен проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей эндонуклеазой рестрикции (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов - ПДРФ - анализ) BsrBI, TaqI, Ncol, EcoRV, Bspl9I, Ball, Avail, Hsp92II, BSEjI, Ndel, Aval, BstF5I, Acil, , Mval269I, Haelll, Hhal, Sspl, XagI, Hindlll, BsrDI, BsiEI, Bfal, BstNI (производства фирм СибЭнзим, Россия, Fermentas, Литовская Республика, NEB, Англия) в течение 16 часов при температуре, рекомендованными фирмами -производителями. Данные о рестрикционных локусах, названия, названия рестриктаз и длины продуктов расщепления представлены в таблице.

Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров, условия ПЦР, размеры длины продуктов расщепления представлены в таблице 2.

Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы

Мета-анализ результатов исследования. С целью выявления обобщенного эффекта полиморфного маркера, показавшего ассоциацию с риском развития параноидной шизофрении, был проведен мета-анализ. Мета-анализ включал результаты, полученные для групп русской и татарской этнической принадлежности, и был осуществлен с использованием программы PLINK v.2.0. На первом этапе была проведена оценка гетерогенности (статистической неоднородности) результатов эффекта вмешательства в разных изученных группах, характеризуемая критерием гетерогенности Хиггинса (I2). Критерий гетерогенности характеризует долю изменчивости, обусловленную неоднородностью выборок (Higgins, Thompson, 2002). В случае I2 = 0,0 % выборки считаются однородными, а наблюдаемые различия эффектов случайны и обусловлены только дисперсией внутри исследований. В данном случае использовалась модель фиксированных (постоянных) эффектов (метод Мантеля-Ханзеля) (Mantel, Haenszel, 1959). В случае I2 30% выборки низко гетерогенны, при I2=30-50% выборки умеренно гетерогенны, а при I2 50% - выборки высоко гетерогенны, что обусловлено наличием дисперсии внутри исследований (обусловленную случайными отклонениями результатов разных исследований от единого истинного фикMantekсированного значения эффекта), а также дисперсии между исследованиями (обусловленную различиями между изучаемыми выборками по характеристикам индивидов). В данном случае рассматривалась модель со случайным эффектом (метод Дерсимоняна-Лэйрда) (DerSimonia, Laird, 1986). Полногеномный анализ ассоциации однонуклеотидных полиморфных локусов выполнен с помощью пакета программ PLINK 2.0, Shaun Purcell в центре Исследований генетики человека Главного Массачусетского госпиталя и Институте Брода при Гарвардском университете и Массачусетском технологическом институте. Этот пакет программ был создан специально для эффективного всестороннего статистического анализа данных таких крупномасштабных исследований, как полногеномные анализы ассоциации(http://pngu.mgh.harvard.edu/ purcell/plink/index.shtml). PLINK позволяет проанализировать большие наборы данных, включающие сотни тысяч генотипированных маркеров у тысяч индивидов. С помощью этого пакета программ можно выполнить множество разнообразных статистических тестов как на популяционных данных, выборках случай контроль, так и на семейных выборках. Основные функциональные домены PLINK включают: управление данными, сводную статистику для контроля качества данных, определение популяционной стратификации, оценку идентичности по состоянию и идентичности по происхождению (IBS/IBD estimation), анализ ассоциации. Кроме этого, в пакете PLINK реализованы процедуры для анализа неравновесия по сцеплению, мультимаркерных тестов, анализа гаплотипов, анализа ген-средовых взаимодействий, мета-анализа данных и других. PLINK интегрирован с программами g PLINK и Haploview для удобства последующей визуализации, аннотации и хранения результатов (Purcell et al., 2007).

После получения результатов полногеномного генотипирования нами была проведена проверка качества образцов ДНК и прогенотипированных маркеров (PLINK 2.0). Из анализируемой выборки были исключены образцы ДНК, в которых не прошло генотипирование более чем 2% маркеров и образцы ДНК, у которых было выявлено несоответствие между обозначенным и установленным при генотипировании полом. Проанализировав долю идентичных аллелей (identical be state IBS alleles) у различных индивидов, а также долю аллелей с вероятным общим происхождением (identical by descent IBD), мы выявили и исключили из анализируемой выборки дуплицированные образцы ДНК и возможных близких родственников. Из дальнейшего анализа также были исключены ОНП, по которым не прошло генотипирование более чем у 5% индивидов, ОНП с частотой редкого аллеля (minor allele frequency, MAF) менее 0,01 и ОНП со статистически значимым отклонением (p=1,0E-06) от равновесия Харди-Вайнберга (HWE).

Для настоящего исследования был установлен полногеномный уровень значимости p = 1,26E-07.

Статистическая обработка включала множественные проверки гипотез. Проверка на множественность сравнений была проведена процедура FDR (false discovery rate) (Benjamin, Hochberg, 1995), которая позволяет снизить ошибку 1-рода и хорошо согласуется с критерием перестановок.

Для учета популяционной гетерогенности был проведен EIGENSTRAT-анализ исследуемых выборок больных и контроля, позволяющий делать поправку на наличие популяционной стратификации и применяемый при выполнении полногеномных ассоциативных исследований (Price et al., 2006). В основе данного метода лежит вычисление главных компонент генетической изменчивости в исследуемых выборках. Установив оси генетической изменчивости выборки, обусловленные популяционной структурой, но не связанные с заболеванием, метод позволяет для каждого маркера оценить его вес в определении той или иной оси и провести тем самым индивидуальную поправку для каждого кандидатного маркера. Это минимизирует появление ложноположительных ассоциаций в силу генетической гетерогенности выборки и одновременно увеличивает вероятность определения достоверных ассоциаций.

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов дофаминергической и серотонинергической систем с эффективностью терапии галоперидолом

Таким образом, анализ полиморфного локуса rs6280 гена DRD3 у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы показал, что аллель rs6280 G является маркером повышенного риска развития параноидной шизофрении у татар.

Кроме этого, было выявлено, что аллель rs6280 S и генотип rs6280 S/S являются маркерами пониженного риска развития параноидной шизофрении и развития непрерывного типа течения у индивидов татарской этнической принадлежности. Полученные нами результаты согласуются с данными исследований этого полиморфного локуса в других популяциях. Ассоциация полиморфного локуса rs6280 гена DRD3 была выявлена у европейцев (аллель rs6280 G) (Ventriglia et al., 2002; Vehof et al., 2012). Обнаруженное нами отсутствие ассоциации полиморфного локуса rs6280 гена DRD3 с развитием параноидной шизофрении у индивидов русской этнической принадлежности подтверждает межэтнические различия в подверженности к развитию многофакторных заболеваний и согласуется с результатами ряда работ, в которых также не установлена роль данного полиморфного локуса в развитии шизофрении у европейцев (Crocq et al., 1992; Spurlock et al., 1998; Nthen et al., 1993; Lorenzo et al., 2008; Pawe et al., 2010), в азиатских популяциях (Ma et al., 2008; Utsunomiya et al., 2008; Tee et al., 2011). Полиморфные локусы гена ассоциированы с развитием шизофрении у европейцев (Godlewska et al., 2010; Siz et al., 2010).

D4 рецептор дофамина (DRD4), ген которого у человека расположен на 11 хромосоме в области 11р15.5 и содержит экзонов и 14 интронов. Исследование post mortem выявило увеличение экспрессии рецептора DRD4 в передней коре больных шизофренией по сравнению со здоровыми индивидами (Mitsuyasu et al., 2001). Результаты ряда исследований свидетельствуют о влиянии аллельных вариантов гена DRD4 на уровень его транскрипционной активности и вследствие этого вовлечении гена DRD4 в патогенез шизофрении. Известно об уменьшении конверсии аденозинтрифосфата (ATP) в циклический аденозинмонофосфат (cAMP) в результате ингибирования рецепторами DRD4 активности аденилатциклазы. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что у больных шизофрений наблюдалось шестикратное увеличение плотности рецепторов DRD4 (Mitsuyasu et al., 2001).

У больных параноидной шизофренией и здоровых индивидов контрольной группы проведен анализ частоты однонуклеотидной замены rs747302 (c.-616G C) гена DRD4. Известно, что данный полиморфный локус расположен в промоторном регионе гена DRD4, содержит сайт связывания транскрипционного фактора АР-2, который относится к семейству транскрипционных факторов, участвующих как в процессах активации, так и репрессии транскрипции с помощью сАМР и киназы С (Barr et al., 2001).

По данным проекта «1000 геномов», частота встречаемости аллеля rs747302 C в популяциях мира варьирует, так, аллель rs747302 C реже всего встречается в популяциях китайского происхождения (CHB 31,6%), в европейских популяциях встречается с частотой (CEU 57,1%), а у африканцев (AFR 39,9%) (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population). Учитывая существующие межэтнические различия в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs747302 гена DRD4, анализ ассоциации проводился в отдельных этнических группах и не выполнялся в объединенной выборке.

У индивидов русской этнической принадлежности статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs747302 гена DRD4 между больными и здоровыми индивидами выявлены не были (табл. 11). Так, аллель rs747302 C встречался практически с равной частотой как у больных – в 61,11% случаев, так и у здоровых русских – 65,43%.

У больных татарской этнической принадлежности частота встречаемости аллеля rs747302 G была выше, чем в контрольной группе индивидов (48,64% против, 30,86%) (p=5,23E-06; OR=2,12 CI 95% 1,54 - 2,93). Гомозиготный генотип rs747302 G/G определялся у 24,49% больных по сравнению с 8,57% у индивидов в контрольной группе (p=1,11E-04; OR=3,46 CI 95% 1,81 - 6,62) (табл. 12).

Для оценки возможной ассоциации типа клинического течения параноидной шизофрении с определенными аллельными вариантами полиморфного локуса rs747302 гена DRD4, нами был проведен анализ распределения частот генотипов и аллелей данного ОНП у больных с НТТ и ЭТТ ПШ (табл. 11, 12).

В группе русских больных с непрерывным и эпизодическим типом течения шизофрении частоты генотипов и аллелей у больных и в группе контроля были схожи (табл. 11).

У татар с непрерывным типом течения ПШ частота аллеля rs747302 G (p=1,32E-06; OR=2,79 CI 95% 1,9 - 4,09) и генотипа, гомозиготного по данному аллелю rs747302 G/G (p=4,41E-05; OR=2,16 CI 95% 2,16 - 8,98) были статистически значимо выше, чем в контроле (табл. 12).