Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Морфогенетическое движение клеток в эмбриогенезе: механизмы и генетический контроль 11
1.1.1. Стадии эмбрионального развития дрозофилы 12
1.1.2. Формирование вентральной борозды 14
1.1.3. Удлинение и сокращение зародышевой полоски 17
1.1.4. Спинное закрытие 21
1.1.5. Развитие трахеи 27
1.1.6. Роль поляризации эпителиальных клеток в морфогенетическом движении 27
1.1.7. Гены, определяющие план строения организма вдоль передне-задний оси, 35
контролируют поляризованное поведение клетки 35
1.2. Происхождение асимметрии: ранняя поляризация 37
1.2.1. Ранний оогенез у дрозофилы 37
1.2.2. Формирование поляризованной цисты 40
1.2.3. Следствие полярности фьюсомы: разные пути детерминации трофоцитов 43
и ооцита 43
1.2.4. Ранняя поляризация ооцита 49
1.2.5. Ориентация ооцита является связующим звеном между ранней и поздней поляризацией яйцевой камеры 53
1.3. Фактор базовой транскрипции trf2 56
Глава 2. Материалы и методы 61
2.1. Культивирование drosophila melanogaster 61
2.2. Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе 61
2.3. Генетические методы 64
2.4. Определение температурочувствительного периода 76
2.5. Анализ поведенческих реакций 76
2.6. Биохимические методы 78
2.7. Приготовление препаратов для микроскопии 90
Глава 3. Результаты и обсуждение 97
3.1. Определение температурочувствительного периода мутации lawcp1 98
3.2. Генетический анализ мутации lawcp1 в комбинациях с различными аллелями генов комплекса achaete-scute, генов cut, serrate и delta 107
3.3. Исследование рецепторной чувствительности у мутантов lawcp1 117
3.3.1. Исследование вкусовой чувствительности у гомеозисных мутантов lawcp1 117
3.3.2. Исследование ольфакторной чувствительности у гомеозисных lawc-мутантов 119
3.3.3. Исследование иннервации гомеозисных органов и ног у lawc-мутантов
3.4. Влияние мутации lawcp1 на взаимодействие генов white И zeste 123
3.5. Картирование мутации lawcр1 128
3.6. Использование генетической системы химерного белка p-ph для репрессии транскрипции гена-мишени 130
3.7. Молекулярное клонирование района lawc 133
3.8. Изучение экспрессии и определение нуклеотидной последовательности района lawcр1 134
3.9. Получение и краткая характеристика видимых lawc-аллелей
3.10. Мутация lawcp1 нарушает экспрессию фактора базовой транскрипции trf2 138
3.11. Trf2 контролирует экспрессию гена spineless 140
3.12. Поиск межгенных взаимодействий при помощи делеционного картирования 141
3.13. Нарушения в репродуктивной системе самцов lawcp1e(y)1u1/y 155
3.14. Анализ музейных летальных lawc-мутаций 162
3.15. Получение и изучение новых летальных lawc-АЛЛЕЛЕЙ
3.15.1. Результаты мутагенеза 168
3.15.2. Установление генотипа полученных леталей 169
3.15.3. Дупликационное картирование 170
3.15.4. Молекулярная природа полученных мутаций 173
3.15.5. Получение и анализ реинверсий и спонтанных мутаций 180
3.15.6. Rescue-анализ лабораторных летальных аллелей 182
3.15.7. Поиск точечных мутаций в районе ОРС гена Trf2 184
3.16. Исследование роли trf2 в формировании хромоцентра и компактизации хромосом 186
3.16.1 Исследование причин нерасхождения хромосом у lawc-мутантов в оогенезе 187
3.16.2. TRF2 участвует в формировании прицентромерного гетерохроматина 189
3.16.3. Эффект подавления экспрессии гена Trf2 на компактизацию политенных хромосом в соматических тканях D. melanogaster 190
3.17. Роль изоформ trf2 в эмбриогенезе d. melanogaster 195
3.17.1. Определение стадии летальности lawc-мутантов 195
3.17.2. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию укороченной изоформы белка TRF2 196
3.17.3. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка TRF2 202
3.17.4. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов линии с мутацией, нарушающей экспрессию N-концевого домена белка TRF2
3.18. Исследование материнского эффекта trf2 207
3.19. Роль trf2 в оогенезе
3.19.1. Анализ репродуктивной системы слабофертильных и стерильных самок 209
3.19.2. Клональный анализ летальных lawc-аллелей в репродуктивной системе мозаичных самок 214
3.20. Анализ картины экспрессии гена trf2 221
Глава 4. Заключение 223
Выводы 227
Список цитированной литературы 228
- Формирование вентральной борозды
- Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе
- Исследование рецепторной чувствительности у мутантов lawcp1
- Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка TRF2
Введение к работе
Актуальность проблемы. Координированное развитие организмов обеспечивается сбалансированным функционированием сигнальных каскадов, а также гормональной и нервной регуляцией. На генетическом уровне эти процессы контролируются конкретными генами, при этом изменение в экспрессии отдельного гена может приводить к изменениям экспрессии множества других генов, проявляющимся на уровне тканей, органов и организма в целом. Поиск и изучение таких генов является актуальной задачей в настоящее время. Очевидно, их мутации должны вызывать плейотропный эффект, который указывает на транс-регуляторную функцию гена-кандидата. Такие гены должны играть стабилизирующую роль в эволюционном процессе, поскольку любое изменение в их экспрессии непременно отразится на целой системе органов и тканей. Однако их копии при возникновении дупликаций вполне могут играть двигательную роль в эволюции благодаря возможности мутировать, не испытывая давления со стороны естественного отбора. Через сайты связывания в районах подконтрольных им генов-мишеней, транс-регуляторные гены могут создавать своеобразные операционные системы, способствуя координированному развитию конкретных органно-тканевых структур. Примером таких генов могут служить открытые на D. melanogaster гомеобокс-содержащие гены, эволюционная роль которых не вызывает сомнение. Другой пример - гены, кодирующие факторы, которые используются сейчас для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чья определяющая роль в становлении статуса клетки также несомненна. Тем не менее, далеко идущие эволюционные преобразования организмов, например, такие, как возникновение билатеральной симметрии и формирование третьего зародышевого листка (мезодермы), должны осуществляться через изменения машины базовой транскрипции.
Процесс транскрипции у эукариотических организмов осуществляют РНК-полимеразы.
Для того чтобы РНК-полимераза связалась с промотором гена, необходимо присутствие
большого числа вспомогательных белковых факторов транскрипции. Основную роль в этом
процессе отводили базовому фактору транскрипции TBP, который связывается с коровой
последовательностью ТАТА (ТАТА-бокс), входящей в состав промоторов. Однако, факторы,
способствующие транскрипции генов, промоторы которых не содержат ТАТА-бокса, долгое
время оставались неизвестными, пока не обнаружили ещ три гена, родственных Tbp, продукты
которых имеют структурное сходство ДНК-связывающего домена и выполняют схожую с
белком TBP функцию. Один из них - ген TBP related factor 2 (Trf2). Оказалось, что в отличие от
остальных членов семейства TBP белок TRF2 не способен связываться на ДНК с
последовательностью ТАТА-бокса, но способен контролировать работу генов, у которых в
промоторе отсутствует этот элемент, то есть, он является альтернативными по отношению к TBP
фактором базовой транскрипции. Возможность управлять работой генов, отличных от тех, за
которые «отвечает» TBP, создат предпосылки для эволюционных процессов, позволяющих TRF2 организовать свою «операционную систему». Насколько эволюционно консервативны функции этого фактора, и как специфичны его гены-мишени – это вопросы, на которые можно ответить в ходе генетических экспериментов, используя мощные возможности модельного организма D. melanogaster. Однако генетических скринингов, позволяющих выявлять межгенные взаимодействия с участием гена Trf2 in vivo, не проводилось в силу отсутствия его жизнеспособных мутаций у модельных организмов. Тем не менее, у дрозофилы на фоне инсерционного мутагенеза нами была открыта мутация, названная leg-arista-wing complex (lawcp1), обладающая плейотропным фенотипическим эффектом (Симонова и др., 1992). Эта мутация оказалась единственной жизнеспособной мутацией вблизи гена Trf2, открытого позднее (Rabenstein, et.al, 1999). Мы решили использовать генетическую систему локуса lawc-Trf2 в качестве модели для исследования роли базового фактора TRF2 в регуляции координированного развития органов и тканей, сложившегося в ходе эволюционного процесса.
Целью работы явилось создание модельной генетической системы для исследования механизмов регуляции координированного развития органов и тканей фактором базовой транскрипции TRF2 у Drosophila melanogaster.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования.
1. Охарактеризовать новый транс-регуляторный ген.
A. Картировать и клонировать район мутации lawcp1, провести анализ временной
транскрипции гена.
Б. Провести генетический скрининг по выявлению цитологических районов, чувствительных к пониженному уровню экспрессии Trf2.
B. Осуществить поиск локусов, имеющих общую с геном Trf2 функциональную нагрузку.
Г. Разработать метод направленной дестабилизации района lawc-мутации с целью
получения новых аллельных вариантов гена Trf2, нарушающих экспрессию его изоформ.
2. Исследовать роль нового гена в структурной организации хромосом герминативных и
соматических клеток.
A. Исследовать влияние lawc-мутаций на эффект положения гена.
Б. Определить частоту и исследовать причину нерасхождения хромосом у lawc-мутантов в репродуктивных клетках.
B. Исследовать морфологию политенных хромосом личинок дрозофил с пониженной
экспрессией TRF2 в слюнных желзах.
3. Исследовать координирующую функцию нового гена в эмбриогенезе D. melanogaster.
А. Исследовать материнский эффект lawc-мутаций на развитие зародыша.
Б. Исследовать последствия нарушения зиготической экспрессии Trf2 в эмбриогенезе.
4. Исследовать координирующую функцию нового гена в оогенезе D. melanogaster.
A. Получить гомозиготные по летальным lawc-мутациям клоны клеток в репродуктивной
системе самок и исследовать последствия нарушенной экспрессии Trf2.
Б. Исследовать локализацию ооцит-специфических белков у стерильных lawc-мутантов.
B. Исследовать организацию структур цитоскелета в герминативных и соматических
клетках репродуктивных органов у стерильных lawc-мутантов.
5. Исследовать паттерн экспрессии Trf2.
Научная новизна и практическая значимость. Настоящая работа вносит существенный вклад в современное представление о функциях в онтогенезе и эволюционном значении консервативного фактора базовой транскрипции TRF2. Впервые было показано, что открытая нами мутация дрозофилы leg-arista-wing complex (lawcp1) вызывает снижение уровня экспрессии фактора транскрипции, который гомологичен белку TRF2 (TBP related factor 2) человека. Впервые проведн генетический скрининг различных областей генома с целью выявления межгенных взаимодействий Trf2 с другими генами и геномными районами. В результате генетического картирования были выявлены 26 цитологических зон, делеции которых вызывают либо гибель особей, либо модификацию мутантного lawc-фенотипа, вызванного пониженной экспрессией белка TRF2. Эти зоны можно использовать в дальнейшем для выявления как новых генов-мишений белка TRF2, так и его позитивных или негативных регуляторов. Впервые показан эволюционный консерватизм структурной функции фактора транскрипции TRF2, необходимой для конденсации хроматина, формирования хромоцентра и правильной сегрегации хромосом. Впервые показана роль эволюционно консервативного домена TRF2 в организации актина, входящего в состав специфических органелл, обеспечивающих самовоспроизведение стволовых клеток репродуктивного пути в оогенезе дрозофилы. Репродуктивную систему стерильных lawc-мутантов можно использовать для исследования механизмов самовоспроизведения стволовых клеток и их взаимосвязи с микроокружением - клеточной нишей. Определена координирующая функция этого фактора в эмбриогенезе: регуляция согласованного движения слов эпителиальных клеток во время морфогенетических событий дрозофилы, схожих с процессами формирования нервной трубки и ранозаживления у позвоночных животных. Мы рекомендуем использовать мутантных lawc-эмбрионов дрозофилы в качестве удобной модельной системы для изучения механизмов этих процессов. Впервые обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой домен полноразмерной изоформы TRF2 дрозофилы, отсутствующий у гомологичных белков позвоночных животных и человека, обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Однако функция этого домена весьма специфична, его экспрессия необходима для координации
процессов роста и слияния клеток трахейных ветвей, формирующих дыхательную систему зародыша. Впервые показано, что нарушение материнской функции этого гена дезорганизует синхронность первых делений дробления ядер эмбрионального синцития, в результате чего формируются эмбрионы с дезинтегрированными полярными структурами тела. Мы обнаружили, что материнский эффект гена Trf2 связан с формированием аномальных структур цитоскелета, обеспечивающих ооцит-специфичный транспорт. Конкретизирована гипотеза участия фактора базовой транскрипции TRF2 в эволюции билатерально-симметричных животных.
Таким образом, получен ряд принципиальных результатов, которые расширяют и углубляют представления о молекулярно-генетических механизмах и роли базовых факторов транскрипции в онтогенезе.
Основные положения, выносимые на защиту
Мутация leg-arista-wing complex нарушает экспрессию фактора базовой транскрипции TBP related factor 2 (TRF2).
TRF2 необходим для формирования прицентромерного гетерохроматина, организующего хромоцентр и координирующего сегрегацию хромосом, как в герминативных, так и в соматических клетках.
TRF2 необходим для координированного движения эпителиальных клеток при формировании вентральной борозды и спинного закрытия в эмбриогенезе D. melanogaster.
TRF2 необходим для самовоспроизведения и дифференцировки стволовых соматических и герминативных клеток репродуктивной системы самок D. melanogaster.
Материнский эффект Trf2 вызван нарушениями актин-содержащих структур, отвечающих за ооцит-специфический транспорт (фьюсомы, спектросомы, кольцевые каналы).
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные в ходе работы данные были опубликованы в учебниках «Введение в генетику развития» (Л.И. Корочкин, М.: Наука, 1999) и «Биология индивидуального развития» (Л.И. Корочкин, М.: Изд-во МГУ, 2002). Новые клонированные последовательности кДНК исследуемого локуса опубликованы на Интернет-ресурсах. Результаты работы используются в курсах лекций по генетике онтогенеза для студентов Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и аспирантов академических институтов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 36th, 38th, 39th, 40th, 41st, 42nd, 44th, 46th, 47th, 49th, 50th, 51st, 54th Annual Drosophila research Conference (Atlanta 1995; Chicago 1997, 2003, 2009; Washington 1998, 2001, 2010, 2013; Sietle 1999; Pittsburgh 2000;
San Diego 2005, 2008; Houston 2006), 4th Russia-Sweden Symposium on "New research in neurobiology" (Moscow, 1996), International Summer School on "Mechanisms in Eukaryotic gene regulation" (Spetses, Greece. 1996), The First Annual General Meeting of European Behavioral and Neural Genetics Society (Orlean, France. 1997), 15th, 16th, 23rd European Drosophila Research Conference (Varna, Bulgaria. 1997; Zurich, Switzerland. 1999; Barselona, Spain. 2013), International Symposium on X chromosome Inactivation in Mammals (Novosibirsk, Russia. 1999), International Symposium dedicated to Academician Ivan Pavlov`s "Mechanisms of Adaptive Behavior" (St. Petersburg, Russia. 1999), The Second International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, Russia. 2000), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Минск (Белорусия), 2001), International conference “Molecular genetics of eucariotes” (Moscow, Russia. 2003), XIV Школе «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород. 2005), Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва. 2006), ХVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург. 2010), Конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва. 2011, 2012) и др.
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований, представлении и обсуждении результатов на конференциях, подготовке публикаций. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 79 печатных работ, из них 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в научных сборниках, 6 публикаций на интернет ресурсах и 49 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 271 странице, содержит 90 рисунков, 26 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 279 цитируемых источника и двух приложений.
Формирование вентральной борозды
Эмбрионы дрозофилы в раннем эмбриогенезе испытывают тканевую элонгацию (конвергентное удлинение): зародышевая полоска (ЗП), которая отвечает за формирование сегментированного строения личинки, удваивается в длину и соответственно этому сужается. Элонгирующая ткань натягивается наружными мембранами, а ЗП начинает перемешаться к заднему полюсу, огибает его и продолжает движение на дорсальной стороне в направлении переднего полюса. В конце элонгации задняя половина ЗП (абдоминальные сегменты А3-А9) оказывается на дорсальной стороне яйца, а передняя половина (грудные и абдоминальные сегменты Т1-А2) расположена на вентральной стороне. В результате презумптивные структуры задних отделов личинки на дорсальной стороне зародыша располагаются в непосредственной близости от будущих головных структур (рис. 4А). Вскоре ЗП начинает сокращаться, и это приводит к восстановлению ее исходной топологии (рис. 4Б). В конце этого процесса на дорсальной стороне эмбриона разрастается амниосероза, состоящая из полиплоидных клеток чешуйчатого эпителия, который покрывает желточный мешок.
Как и в эмбриогенезе других видов, у дрозофилы процесс конвергентного удлинения реализуется с помощью клеточной интеркаляции (Schoenwolf, Alvarez, 1989). Ирвин и Виша-ус (Irvine, Wieschaus, 1994) предположили, что интеркаляция эктодермальных клеток происходит благодаря адгезивным силам, которые должны различаться в соседних сегментах. Различия в силе адгезии между клетками чередующихся сегментов должны контролировать скорость интеркаляции. Фактически во время гаструляции клетки не деламинируют, не мигрируют сквозь ткань, а вместо этого перестраивают свои специфические контакты в ответ на установление кратковременного механизма упорядоченной коррекции межклеточных связей. Каким образом это происходит?
Известно, что ось удлинения эмбрионов дрозофилы устанавливается среди клеток однородного поля через стереотипические изменения формы поверхности группы клеток. Для полной элонгации во время осевого удлинения необходим не один, а множество раундов клеточной интеркаляции. Недавно было показано, что во время тканевой элонгации клетки ведут себя поляризовано, то есть на их поверхности асимметрично распределяются цитоске-летные и интегральные белки, контролирующие процесс поляризации клеток. На латеральной стороне в апикальной области мембраны эктодермальных клеток находятся молекулы DE-кадгеринов, участвующие в клеточной адгезии (Oda et al., 1998). Оказалось, что регуляция с помощью DE-кадгерина играет важную роль во время удлинения ЗП. Заллен и Вишаус (Zallen, Wieschaus, 2004) продемонстрировали, что полосатая экспрессия генов сегментации группы «правила парности» (pair-rule genes) является необходимым и достаточным условием для ориентации планарной полярности (о планарной полярности см. ниже). Первичной полярностью во время удлинения ЗП считается асимметричное распределение F-актина, за ним следует накопление Миозина II и Bazooka/Par-3 в различных комплементарных районах на поверхности клетки (рис. 5).
Последовательность событий слева направо. Накопление F-актина на стыке клеток вдоль передне-задней оси является первым свидетельством планарной поляризации клеток (слева). Далее в этой области накапливается Миозин II, который координирует сокращение прилегающих поверхностей клеток, способствуя формированию розеточных структур. F-актин и Миозин II колокализуются в районе верхушечного схождения клеток (центральная картинка). В дальнейшем розетка разбирается таким образом, что между клетками, которые прежде были пространственно разграничены вдоль дорсо-вентральной оси, устанавливаются контакты. На ранних этапах в районе новых контактов накапливается DE-кадгерин, который совпадает с формированиями кратковременных F-актиновых структур (справа). С небольшой задержкой в район вновь сформированных стыков рекрутируется Bazooka, который создат локальное различие в адгезивности клеток, что может играть решающую роль при разборке розеточной структуры.
Далее в районы новых межклеточных контактов, где впоследствии будет накапливаться Bazooka, должны рекрутироваться DE-кадгерин и Armadillo/-катенин. Локальная дестабилизация DE-кадгериновых адгезивных связей может вызвать локальную дестабилизацию поляризованного поведения клеток во время тканевой элонгации. Регуляторы такого феномена оставались неидентифицированными, пока в рамках изучения этой проблемы не было обнаружено, что на процесс удлинения ЗП влияет гормон серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-HT), который, являясь высокоактивным биогенным амином, ней-ротрансмиттером и нейромодулятором, может выступать в роли морфогенетического фактора во время раннего эмбриогенеза (Schaerlinger et al., 2007). Сначала появились сообщения, что у эмбрионов дрозофилы, мутантных по гену 5-НТ2Dro, кодирующему рецептор серотони-на (5-НТ), нарушаются процессы, связанные с морфогенетическим движением клеток во время гаструляции (Colas et al., 1995; Colas et al., 1999a). В этих работах было показано, что картина экспрессии серотонинового рецептора 5-НТ2Dr0 с одной стороны напоминает полосатый паттерн экспрессии генов «правила парности» в эктодермальных клетках, а с другой стороны совпадает с апикально-базальной локализацией Р-катенина дрозофилы Armadillo, который осуществляет связь цитоскелета клетки с молекулой DЕ-кадгерина. Далее было обнаружено, что серотониновый рецептор способен влиять на сигналы поляризованной адгезии, которые контролируют удлинение ЗП через клеточную интеркаляцию (Colas et al., 1999b). Затем выяснилось, что, раз DE-кадгерин и Armadillo/ Р-катенин рекрутируются в места новых контактов до «прихода» туда белка Bazooka, устанавливающего поляризацию, то 5-НТ-зависимая DE-кадгериновая адгезия, возможно, регулирует стабильность поведения поляризованных клеток во время тканевой элонгации.
Исследование фенотипов кутикулы мутантных эмбрионов с нарушенной экспрессией рецептора серотонина, названых «ghost, призрак» и «double line, двойная линия», показало, что они вызваны различной силы дефектами удлинения ЗП, величина которой отрицательно коррелирует с концентрацией 5-НТ. Оказалось, что снижение концентрации 5-НТ сбавляет скорость передачи сигнала к началу поляризованной адгезии (Colas et al., 1999b). Похожие фенотипы кутикулы демонстрировали эмбрионы с недостаточной экспрессией генов, кодирующих ферменты, контролирующие биосинтез серотонина (Punch (Ри), Tryptophan hydroxylase (ТРН), DOPA decarboxylase (DDQ) (Colas et al., 1999b).
Таким образом, предположительная роль рецептора 5-HT2Dr0 в регуляции процесса удлинения ЗП состоит в синхронизации клеточной интеркаляции через трансдукцию экстраклеточного сигнала биогенного серотонина на цитоскелет клетки. В результате осуществляется как временной контроль, так и интенсивность (скорость) клеточной интеркаляции и удлинения ЗП. В качестве эффектора для рецептора 5-HT2Dr0 предположительно может выступать комплекс Rho/киназа Rho, т.к. рецептор 5-HT2Dr0 является ортологом рецепторов млекопитающих 5-НТ2А, в, с, которые вовлечены в контроль сокращения клеток гладкой мускулатуры с помощью Rho-зависимой регуляции киназы лгкой цепи миозина. К тому же оказалось, что Y-27632 (фармакологический ингибитор Rho-киназы и специфический регулятор Миозина II) способен прекращать клеточную интеркаляцию при микроинъекции его в эмбрионы дрозофилы (Schaerlinger et al., 2007).
Следующим этапом эмбриогенеза дрозофилы является сокращение ЗП. С развитием новых технологий удалось обнаружить интересные детали этого морфогенетического события. Например, с помощью цейтраферной киносъмки (time-lapse photography) было показано, что во время сокращения амниосероза и ЗП движутся согласованно, как единый пласт клеток (Schock, Perrimon, 2002). К тому же оказалось, что сокращение ЗП связано с формированием клетками амниосерозы ламеллиподий. Ламеллиподии распространяются в сторону апикального внеклеточного матрикса ЗП. Было показано, что в этом процессе участвуют белки внеклеточного матрикса ламинины (ламинин 1,2, кодируемый геном wing blister (Martin et al., 1999)) и взаимодействующие с ним трансмембранные белки интегрины (PS3, PS) (Schock, Perrimon, 2003). Их мутации нарушают сокращение ЗП, в результате чего погибшие эмбрионы имеют U-образный фенотип.
Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе
Основным и универсальным фактором базовой транскрипции является белок ТВР (TATA-box Binding Protein), связывающийся с ТАТА последовательностью, входящей в состав большинства промоторов (Sauer and Tjian, 1997). Совсем недавно у человека и дрозофилы были обнаружены ещ 2 гена, продукты которых имеют структурное сходство ДНК-связывающего домена и, как полагают, выполняют схожую функцию, проявляя при этом не 57 которую тканевую специфичность (центральная нервная и репродуктивная системы). Это гены TBP related factor 1 и 2 (Trf1 и Trf2) (Rabenstein et al., 1999).
Ген Trf2 кодирует альтернативный TBP фактор базовой транскрипции TRF2. Поскольку TRF2 был выделен из различных организмов (человека, мыши, дрозофилы, крысы и нематоды), этот фактор имеет несколько названий: TBP related factor (TRF2), TBP-like protein (TLP), TBP-like factor (TLF). Первичная структура этого белка варьирует у различных видов, но все они содержат консервативный домен, состоящий из двух повторов, который является общим для белков – представителей семейства TBP-подобных факторов. У TRF2 дрозофилы этот домен имеет 39% идентичных аминокислот с доменом ТВР. Однако, несмотря на то, что ДНК-связывающий домен у всего семейства TBP-подобных факторов высококонсервативен (около 50% идентичности), детальное сравнение последовательностей ТВР и TRF2 показало, что ключевые аминокислоты, необходимые для взаимодействия ТВР с ТАТА-боксом, у TRF2 заменены на другие (Hochheimer and Tijan, 2003). Эти данные подтверждаются и тем фактом, что рекомбинантный TRF2 не связывает канонический ТАТА-бокс. Хотя у TRF2 дрозофилы основной домен гомологии с ТВР только на 39% идентичен, основания, ответственные за связывание с общими транскрипционными факторами TFIIA и TFIIB, гомологичны на 60% и 75% соответственно. Таким образом, вероятно, TRF2 может взаимодействовать с этими компонентами преинициаторного комплекса и принимать участие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.
В отличие от TBP, TRF2 входит в состав высокомолекулярного комплекса (500 кДа) и следовательно, может быть ассоциирован с набором белков, которые отличаются от ТВР- и TRF1-ассоциированных факторов. Были идентифицированы TRF2-содержащие комплексы дрозофилы, в состав которых входят компоненты хроматин-ремодулирующего комплекса NURF (nucleosome remodelling factor), белка DREF (DNA replication-related element (DRE)-binding factor), а также другие белки, которые могут взаимодействовать с хроматином (Hoch-heimer еt al., 2002). Биохимический анализ TRF2-содержащего комплекса выявил TRF2-специфичные промоторы. Оказалось, что DREF, взаимодействующий с промоторным проксимальным элементом ДНК-DRE и вовлеченный в регуляцию клеточного цикла и клеточную пролиферацию генов, связывается с TRF2.
Исследования in vitro показали, что DREF-содержащий TRF2-комплекс участвует в распознавании промотора гена PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Ген PCNA содержит два тандемно расположенных повтора, которые разделены участком размером 63 пн. DREF/TRF2-комплекс селективно инициирует транскрипцию со второго промотора, который содержит DREF-связывающий сайт (DRE), в то время как транскрипция с первого промотора инициируется комплексом TFIID, содержащим ТВР. Анализ экспрессии генов выявил не 58 сколько дополнительных генов-мишений TRF2, вовлеченных в репликацию ДНК и клеточную пролиферацию, которые содержат элемент DRE (Hochheimer еt al., 2002). Компьютерный анализ промоторных элементов в геноме дрозофилы определил DRE-элемент как один из консервативных промоторных участков. Более того, по имеющимся данным гены, содержащие DRE, вовлечены в контроль развития глаз, в частности, в переход от пролиферации к клеточной дифференцировке. Поэтому предположили, что TRF2 может функционировать как промотор-селективный фактор, отвечающий за регулируемую транскрипцию определенного набора генов у дрозофилы.
В настоящее время имеется немного информации о роли TRF2 в развитии дрозофилы. Сравнение последовательностей основного домена представителей TLF-семейства показало, что они менее консервативны в эволюции (40-45% идентичности среди видов метазоа), чем основной домен TBP (около 80% идентичности у дрожжей и человека). Поэтому сделали вывод о том, что если у различных видов ТВР выполняет одну и ту же функцию, то TLF могут принимать участие в различных регуляторных путях у эволюционно отдаленных видов (Danonel et al., 2000). Исследования физиологических функций TLF у Caenorhabditis elegans, Xe-nopus laevis и Danio rerio продемонстрировали, что TLF необходим на ранних стадиях эмбриогенеза (Teichmann et al., 1999; Dantonel et al., 2000), т.е. необходим для контроля генов, экспрессирующихся на стадии зиготы. С другой стороны, инактивация гена tlf мышей методом РНК-интерференции продемонстрировала, что TLF не нужен в эмбриогенезе, но необходим для сперматогенеза (Zhang et al., 2001). Кроме того, оказалось, что TLF является негативным регулятором клеточного роста. TLF присутствует главным образом в цитоплазме и проникает в ядро в фазе G2. Предполагают, что TLF представляет собой фактор, участвующий в регуляции клеточного цикла и при ответе на стресс (Shimada et al., 2003).
У позвоночных животных (от рыб до человека) в отличие от дрозофилы и низших эу-кариот присутствует еще один член семейства ТВР-подобных факторов - белок TRF3/TBP2. Было показано, что в отличие от TRF2 у позвоночных TRF3 экспрессируется узкоспецифично: в ооцитах и на ранней эмбриональной стадии (Gazdag et al., 2007).
До последнего времени границы локализации гена Trf2 у дрозофилы не были до конца установлены. В первую очередь эти трудности были обусловлены отсутствием достаточного набора удобных мутаций в области гена Trf2. Открытие, описанной в настоящей работе, инcерционной мутации lawcp1, локализованной в 15 т.п.н. от открытой рамки считывания Trf2, сыграло важную роль в установлении границ этого гена, в частности, района начала его транскрипции (5 область). В результате оказалось, что помимо изначально описанного TRF2 полипептида (75 кДа) (Rabenstein et al., 1999), ген Trf2 кодирует более длинный белок размером 175 кДа, который содержит дополнительные 1065 N-концевых аминокислоты (рис. 18). Было показано, что изоформы белка TRF2 имеют одинаковые сайты связывания на политен-ных хромосомах и одинаковый паттерн экспрессии, поэтому авторы сделали вывод об их схожей функции (Kopytova et al., 2006).
В настоящее время известно, что ген Trf2 имеет десять экзонов, кодирующих открытую рамку считывания, которая начинается с четвертого экзона (рис. 18А). В 5 - концевой области гена содержатся два больших интрона: 7.6 т.п.н. и 4.7 т.п.н. (Kopytova et al., 2006).
Белок размером 175 кДа содержит два структурных мотива coiled-coil (рис. 18Б), которые отсутствуют в описанном ранее белке. Coiled-coil мотив найден в различных белках, в частности, в транскрипционных факторах. Этот мотив представляет собой гептадный повтор аминокислот, уложенных в -спираль таким образом, что гидрофобные остатки выстраиваются на одной стороне спирали, формируя участок, который может принимать участие как в димеризации белка, так и в белок-белковых взаимодействиях (Kohn et al., 1997). -h-0 3
Исследование рецепторной чувствительности у мутантов lawcp1
Определение ТЧП признака формирования гомеозисной трансформации аристы у мух lawcp1 проводили отдельно у самок и самцов. Для самок был поставлен независимый дополнительный повтор эксперимента с временным интервалом в 6 месяцев в связи с неординарными результатами, полученными в процессе обработки первоначальных данных, а также потому, что наша мутация впервые исследуется в этом направлении. Результаты представлены на рис. 24 – 25. Рассмотрим сначала данные о трансформации аристы в выборках, взятых после температурного сдвига с 17оС на 28оС. Результаты эксперимента показали, что эти выборки не различались по выраженности гомеозисного признака, как среди самцов, так и среди самок, практически не показывая зависимости от изменения температуры культивирования (рис. 24 – 25, кривые 2). Однако, данные, полученные при реципрокном сдвиге температуры (с 28оС на 17оС), явились более информативными. Рассмотрим сначала результаты о трансформации аристы среди самцов (рис. 24 А, кривая 1). Можно выделить два больших интервала, в которых выборки не различались по степени трансформации аристы: 512 – 320 и 192 – 0 ч развития до вылета имаго. Поскольку изменения температуры культивирования в эти периоды развития не влияли на проявление гомеозисной трансформации, то эти интервалы не являются температурочувствительными. Смена температурного режима культивирования в промежутке 320 – 192 ч приводит к изменению формирования гомеозисных структур в зависимости от температуры. Это позволило нам выделить е как ТЧП мутации lawcp1 в отношении е гомеозисного эффекта у самцов. Мутантный фенотип был лучше выражен при 28оС, что говорит о «теплочувствительности» исследуемого признака.
Рассмотрим теперь данные о трансформации аристы среди самок (см. рис. 24 Б-В, кривые 1). Профиль этих кривых имеет необычную форму, однако можно выделить сходные для обоих графиков зоны, позволяющие предположить не случайный характер расположения точек, т.е. достоверность результатов, полученных при анализе самок из данных выборок. Во-первых, это зона 320 – 256 ч до вылета имаго, где в обоих случаях наблюдается резкое понижение экспрессивности трансформации аристы, отражнное на графиках, во-вторых, резкое повышение экспрессивности на отрезке 256 – 192 ч, также имеющее место в двух случаях.
Итак, обработка личинок теплом на стадии второй половины III личиночного возраста способствует ослаблению экспрессивности мутантного фенотипа аристы. Однако если дать возможность особям продолжать развиваться в исходных условиях (17оС) и сменить температуру развития на стадии ранней куколки, то выраженность признака от температуры уже не зависит. Таким образом, зоной температурной чувствительности у самок является вторая половина III личиночного возраста – предкуколка по шкале индивидуального развития, определяя «холодочувствительный» тип чувствительности к температуре на данном временном интервале, так как мутантный фенотип лучше выражен при 17оС.
Таким образом, ТЧП мутации lawcp1 по признаку трансформации аристы проявляет половой деморфизм. У особей обоих полов он локализуется во второй половине III личиночного возраста – предкуколка по шкале индивидуального развития, однако тип чувствительности к температуре у самцов определяется как «теплочувствительный», а у самок - «холо-дочувствительный».
У гомеозисных мутантов, демонстрирующих трансформацию антенны в ножные структуры (гены spineless (ss), Antennapedia (Antp)), ТЧП отражает такой период развития, когда происходит «окончательная» детерминация клеток к гомеозисному или нормальному пути развития, после которого вариация внешнего фактора уже не приводит к изменению фенотипа клетки (Kauffman et al., 1980). ТЧП формирования гомеозисной трансформации аристы у мутантов lawcp1 на определнном этапе совпадает с локализацией ТЧП формирования гомеозисных придатков у особей с мутациями Antp50 и ssa40a (вторая половина третьего личиночного возраста) (Константинова и др., 1983). Однако наличие ТЧП на стадии предку-колки говорит о том, что, возможно, мутация lawcp1 сдвигает процесс сегментации антенны, в норме завершнный уже к моменту формирования пупария, на период образования ножных сегментов (предкуколка).
Нужно отметить, что мутация lawcp1 по степени трансформации аристы и по форме деформации тарзуса очень напоминает мутацию ssa40a (Kuzin et al., 1997). Считается, что продукты гена ss влияют на формирование дистальных сегментов антенны и тарзуса и имеют прямое отношение к пролиферации клеток антенного и ножных имагинальных дисков (Кузин и др., 1991). Соответствие ТЧП этих мутаций приводит к мысли о возможно совместном участии продуктов этих генов в процессе пролиферации клеток антенного имагинального диска. Отметим, однако, что трансформация аристы у мутантов lawcp1 в отличие от ssa40a проявляет половой диморфизм. Это явление связывают с влиянием либо дозы гена, либо с физиологическими различиями между самками и самцами.
ТЧП частоты формирования деформированных ног. Среднее значение частоты встречаемости дефектных ног определяли из расчта на особь. Учт вели отдельно у самок и самцов. Для самок эксперимент ставился дважды в связи с неординарными результатами, полученными в процессе обработки первоначальных данных. Результаты анализа представлены на рисунке 25. Рассматривая данные о частоте формирования деформированных ног в выборках, взятых после сдвига температур с 28оС на 17оС (кривые 1), мы видим, что они не различаются как среди самцов, так и среди самок. Достаточно информативными являются лишь кривые 2, отражающие данные, полученные при реципрокном сдвиге температуры (с 17оС на 28оС). -+ Конечности (самцы)
Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка TRF2
Принцип скрининга заключается в выявлении локусов, нарушение экспрессии которых специфически модифицируют определнный мутантный фенотип. При таком подходе используют восприимчивый генетический фон, который слабо выражен, но легко заметен (например, «грубоватые» глаза, небольшая вырезка крыловой пластинки). Поиск мутаций на слабовыраженном генетическом фоне позволяет обнаружить транс-действующие регуля-торные факторы, например, гены-энхансеры, если мутация усиливает фенотипическое проявление, либо гены-супрессоры, если происходит ослабление фенотипа.
Делеционное картирование - масштабный, но не точный способ поиска межгенных взаимодействий. Строго говоря, это один из старых методов, получивших новое развитие в рамках проектов по картированию генома дрозофилы. Из множества делеций составляется так называемый Deficiency Kit – минимальное количество делеций, затрагивающих наибольшую часть генома Drosophila melanogaster. В этой работе мы использовали Bloomington Deficiency Kits (DF2 и DF3), по последним данным его полный набор составляют 238 линий, что соответствует от 85 до 91% полос на карте политенных хромосом.
В последнее время создана система делеционного картирования с гораздо большим разрешением, так называемые Exelixis Deficiencies (Parks et al., 2004). Геном дрозофилы насыщался инсерциями трансгенных конструкций на основе Р-элемента, включавших последовательности сайт-специфичной рекомбинации. С помощью рекомбиниции между такими конструкциями можно получать делеции с четко устанавливаемыми границами (Thibault et al, 2004). Линии имеют изогенное происхождение и перекрывают чуть более 50% генома. Районы, по которым в принципе невозможно получить делеции из-за летальности гетерозиготных особей (гаплонедотаточности), минимизируются тщательным подбором изначально полученных инсерций.
Слабый фенотип lawcp1послужил отличным фоном для поиска генов, мутации которых либо приводят к восстановлению утраченных признаков фенотипа lawc, либо становятся гаплонедостаточными леталями в комбинации с аллелем lawcp1.
Поиск взаимодействий осуществлялся только по аутосомам (2 и 3 хромосомы). Описания использованных при делеционном картировании линий собраны в Приложении 1; т.к. в Bloomington Stock Center используется скользящая нумерация, то мы сочли нужным полностью привести генотипы существовавших на момент постановки эксперимента линий. Анализировались самцы lawcp1/Y; Df/+, несущие в гетерозиготе делеции (подопытный класс). Альтернативный класс самцов lawcp1/Y; Balancer/+, (контроль) был представлен особями, не несущими делеций. Он идентифицировался по стандартным маркерным мутациям, характерным для аутосомных хромосом-балансеров. Сами по себе делеции в гетерозиготе не вызывают гибели особей или сильных фенотипических нарушений. Однако если на фоне lawcp1 в линии будут возникать морфологические аномалии или отклонения от стандартного расщепления, то можно говорить о существовании межгенных взаимодействий. Следует отметить, что мы не претендуем на обнаружение всех генов, задействованных в биохимически связанных процессах – это невозможно в силу ограниченности метода. Какие-то взаимодействия в принципе невозможно проследить, наблюдая мутации в гетерозиготном состоянии (применительно к нашим экспериментам, это означает, что отсутствие взаимодействий не указывает на их отсутствие в живом организме).
Исходно мы выявили 14 линий с делециями, которые в гетерозиготном состоянии вызывали гибель слабых lawc-мутантов: [21A1; 21B7-8], [24C2-8; 25C8-9], [36E4; 38A6-7], [38A6-B1; 40A3-B1], [46D7-9; 47F15-16], [48F4; 49A11], [49C1-4; 50C23-D2], [55A; 55F], [64C; 65C11], [66D6; 66E1-2], [67A2-5; 67D7-9], [75B8; 75F1], [86E2; 87C6-7], [91F1-2; 92D3-6]. Обнаружив взаимодействие слабой мутации с делецией из Deficiency Kit, для уточнения «летальных» цитологических зон мы использовали небольшие делеции. Для этого в скрещиваниях было задействовано ещ 77 линий. В результате было обнаружено, что в 9 дополнительных линиях содержатся гаплонедостаточные цитологические зоны, делеции которых в гетерозиготном состоянии вызывают гибель слабых lawc-мутантов. Их мы использовали для уточнения границ «летальных» зон. Ещ 25 линий несли доминантные модификаторы слабой мутации lawcp1. В некоторых случаях «летальные» зоны почти полностью перекрывались более мелкими делециями с более слабым воздействием на фенотип мутантов. Очевидно, эти цитологические районы содержат сразу несколько локусов, вызывающих доминантное ком-мулятивное воздействие на lawcp1. Возможно также, что в этих районах локализуются су-прессоры, нейтрализующие влияние сильных lawcp1-модификаторов. Для всех случаев были поставлены контрольные эксперименты с линией, содержащей реверсию lawcR30. Гибели особей не наблюдалось, поэтому все обнаруженные взаимодействия вызваны мутацией law с?1. Более того, жизнеспособность особей восстанавливалась на фоне мис-экспрессии изоформ белка TRF2, что доказывает участие этого белка в выявленных взаимодействиях.
Мы отметили локализацию этих делеций на цитологической карте аутосомных хромосом дрозофилы. Результаты представлены на рисунке 50. Прямой толстой линией изображены участки цитологической карты, цифрами сверху обозначены соответствующие секции, а буквами ниже их подсекции. Расположенные ниже отрезки соответствуют данным о размерах исследованных делеций, неточно картированные границы делеций отмечены пунктирной линией. За символом # над каждым отрезком следует номер линии из Bloomington Stock Center. Под обозначением делеции знак обозначает жизнеспособность при совмещении с мутацией lawc, - гибель, в случае сильных нарушений приведен их фенотип. Если линия не обозначена на карте, значит, взаимодействия не обнаружены, самцы с делецией и мутацией lawc?1 выживают и не имеют видимых нарушений. Цитологические области [22В2-3; 24А1], [28С; 29В11], [44F10; 46А1], [51В7; 51D2], [52F5; 54В17], [56F16; 57ВЗ], [62А9; 64А11], [69ВЗ; 71С1], [79Е9; 83В] не тестировались в силу отсутствия доступных делеций этих районов.
Проанализировав результаты делеционного картирования, мы выявили 22 более мелких цитологических района, где расположены различной силы доминантные энхансеры фенотипа lawc?1, из них 12 вызывали гибель особей, остальные усиливали фенотипическое проявление мутантов. Также было выявлено 4 района, содержащие вероятные супрессоры, компенсирующие эффекты энхансеров lawc?1 (табл. 10, рис. 51).
Разумеется, ген Trfi не может «взаимодействовать» с протяженным участком хромосом длиной в несколько секций. Речь идет о взаимодействии продуктов двух или более генов, и поиск отдельных генов логично стал нашей следующей задачей. Был проведен скрининг генов, попадающих в картированные области летальных взаимодействий, в базе данных http://flybase.bio.indiana.edu.
Среди известных генов, локализованных в этих районах много факторов как базовой, так и специфической транскрипции, а также генов, участвующих в компактизации хроматина и правильном расхождении хромосом при митозе и мейозе. Мы сочли наглядным вынести эти данные в таблицу 11.