Введение к работе
Актуальность темы '
Геномы всех организмов, в том числе и энтеробактерий,
крайне консервативны с точки зрения локализации, состава и
количества генов на хромосоме. Это является ^необходимым
условием поддержания видов. Наглядным примером может
служить штамм W3110 Escherichia coli, который содержит
инверсию участка хромосомы длиной около 18 минут генетической
карты. Эта перестройка произошла между двумя оперонами
рибосомной РНК, rrnD и ттпЕ, и впервые была обнаружена более
30 лет назад. г -
С другой стороны известно, что непременным условием эволюции является изменчивость. В связи с этим, у бактерий хромосомные мутации происходят с довольно высокой частотой. Основную роль в их возникновении играет неравный кроссинговер между различными гомологичными последовательностями, которые присутствуют в бактериальном геноме. Примером таких протяженных повторов являются опероны рибосомной РНК, которые присутствуют в количестве 7 копий на геном Е. coli, rhs-локусы. Важную роль в образовании хромосомных перестроек играют также мобильные генетические элементы: транспозоны и IS-элементы. Сайт-спецнфнческая рекомбинация с их участием приводит it образованию различных хромосомных перестроек: делений, инверсий, дупликаций, транслокаций.
Для изучения механизмов генетических процессов, приводящих к изменению макроструктуры генома, важное значение имеет разработка селективных систем отбора мутантов, содержащих хромосомные перестройки. Такой удобной системой оказался метод селекции, раработанный на модели гена udp, контролирующего синтез фермента уридинфосфорилазы (УФ-зы) E.coli (Mironov, Sukhodolets 1979, Миронов 1982).
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в изучении роли транслозона TafO в обраэоваюши различных хромосомных перестроек у мутантов втгаммов E.coli DZ100 и DZ200 с конститутивной экспрессией гена шір. В задачи исследования входило:
-
Получить представительную коллекцию мутантов с повышенной . экспрессией гена udp, возникшеіі в результате различных хромосомных перестроек.
-
Осуществить физическое картирование генома у, полученных мутантов с помощью обычного электрофореза, а также электрофореза в пульсирующем электрическом поле (ПЭФ).
-
Установить точную локализацию хромосомных перестроек с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
-
Определить нуклеотидную последовательность в районе стыков перестроек для выяснения роли транспозона Ти 10 в образовании перестроек.
Научная новизна и значимость работы
С помощью эффективного метода отбора получена коллекция мутантов с повышенной экспрессией гена udp, несущих уникальные хромосомные перестройки, индуцированные транспозоном Тп/0.
Осуществлено физическое картирование полученных хромосомных перестроек и предложены схемы вероятных рекомбішацирнньгх событий, лежащих в основе этих геномных. мутаций.
Выявлена ключевая роль транспозона Тп/0 в образовании инверсий, дупликаций и делещш у полученных мутантов.
Показано, что мутация в гене метилазы dam повышает частоту хромосомных перестроек.
Обнаружена мутация в гене, кодирующем транспозазу Тп10, которая приводит к изменению специфичности фермента.
Структура и объем диссертации