Введение к работе
Актуальность темы. Основной функцией генного комплекса aohaete-scute (AS-c) является контроль формирования сенсорных органов периферической нервной системы личинок и имаго. Гены aohaete-soute, в частности, определяют развитие тетиночного узора на голове и теле дрозофилы, который характеризуется двумя основными свойствами - постоянством числа и позиций 20 составляющих его щетинок. Мутации этих генов проявляются в утрате некоторых или большинства щетинок набора и имеют неполную пенетрантность.
Сенсационные результаты А.С.Свребровского, Н.П.Дубинина и их коллег, полученные при изучении свойств аллелей aohaete-eoute, в тридцатые годы произвели переворот в генетическом мировоззрении, заставив пересмотреть представления о гене как единице мутации, рекомбинации и функции* Руководствуясь сформулированной ими концепцией ступенчатого аллеломорфизма и базируясь на бинарной градации при оценке признака (пенетрант-ности по редукции щетинок), авторы путем сопоставления фенотипов гомозигот и компаундов получили некий линейный порядок индексов щетинок, которые редуцировались у носителей соответствующих мутантних генотипов. Этот порядок интерпретировался как проекция внутренней структуры локуса, т.е. как его генетическая карта (Серебровский,1928; Дубинин,1932; 1933; 1966).
Однако очевидная произвольность выбора порога для перехода от количественной оценки фенотипа (пенетрантности) к качественной бинарной (редукция-отсутствие редукции), равно как и зависимость самих фенатшичвских проявлений от привходящих факторов - температуры, дозы гена soute, генетического фона и др., - приводили к неоднозначности результатов картирования. В свою очередь, неустойчивость получаемого порядка индексов подрывала логическую основу его трактовки в рамках развиваемой концепции. Был выдвинут целый ряд аргументированных альтернативных вариантов интерпретации сделанных построений (Ро-кицкий, 1931; Sturtevant, Sohultz,, 1931; Muller et al., 1935). В результате вопрос, являются ли карты локуса Серебро-вского-Дубинина истинными генетическими картами или отражают некие иные свойства системы, остался открытым.
Предлагаемый подход к решению принципиального вопроса о возможности исследования генетической организации локуса
soute по картам фенотипических проявлений мутаций ориентирован на использование строгих методов картирования и основан на простой логической посылке: если карты отражают организацию локуса, то в их структуре должны найтись элементы, устойчивые к факторам, модифицирующим фенотип, поскольку характер дефектов в локусе остается при этом неизменным. В качестве таких факторов рассмотрены температура культивирования мутантов, доза гена soute и направление скрещиваний.
До сегодняшнего дня в полной мере не исследованы и механизмы генетического контроля над числом щетинок. Еще в шестидесятые годы по результатам селекционных экспериментов система aohaete-soute была квалифицирована как полигенная - с олиго-геном aohaete-soute и набором генов-модификаторов (Muller, Fraser, 1968; Rendel, 1976). Однако продвинуться далее констатации этого факта и дать описание системы, включащее информацию о числе и локализации составлякщих ее полигенов, не удалось. Подобная ситуация являлась достаточно типичной для самых разных полигенных систем и отражала общее состояние проблемы генетической детерминации количественных признаков, когда возможности традиционных методов ее изучения были исчерпаны, а новые подходы еще не разработаны. С открытием мобильных элементов генома появилась принципиальная возможность локализации полигенов, основанная на использовании маркерных свойств мобильных элементов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в комплексном исследовании системы aohaete-soute как модельной полигенной системы контроля реализации количественного признака, включающем изучение генетической топографии локуса soute и картирование входящих в систему полигенов. Сформулированная цель работы и предлагаемые экспериментальные подхода подразумевали решение следующих задач:
1. Проанализировать фенотипические проявления аллелей
Bcute в гомозиготах и компаундах при разных температурах.
-
Построить по этим данным карты мутационных проявлений, используя адекватные методы классификации генотипов.
-
Провести сравнение карт, исследовать их устойчивость к изменению температуры, дозы гена, направлению скрещиваний. Выделить в структуре карт инвариантные к изменению перечис-
ленных факторов компоненты, если таковые окажутся.
4. Получить серию новых линий мутантов, сочетающих утрату
небольшого числа щетинок с широким диапазоном пэнетрэнтности.
5. Выяснить закономерности совокупного распределения моби
льных элементов шести семейств в геномах этих линий..._
6- На основе сравнительного анализа полученных распределений установить зависимость между уровнем редукции и локализацией мобильных элементов.
7. Исследовать источники гетерогенности по локализации мобильных элементов з ряду изогенных линий. Оценить спектр и частоти происходящих при изогенияации транспозиций мобильных элементов.
s„ Базируясь на полученных результатах я учитывая литературные данные, дать описание исследуемой системы. Научная новизна. Впервые исследовано влияние температуры, дозы гена, направления скрещиваний на фенотипичвские характеристики мутаций и на построенные на их основе карты мутационных проявлений гена soute. Продемонстрировано наличие в линейной структуре карт блоков индексов мутантов и отвечающих им блоков индексов щетинок, инвариантных к изменению перечисленных факторов. Устойчивость выявленных блоков позволяет однозначно интерпретировать их последовательность как истинную генетическую карту локуса. Существенно позднее полученные данные молекулярного клонирования района (Oarrwnoliiro et al., 1982; Gomez-Skarmeta et al., 1995) полностью подтвердили предложенную интерпретацию, что свидетельствует об адекватности и высокой эффективности примененного нами метода генетического анализа топографии локуса.
В системе дисгенных скрещиваний получена серия новых аллелей soute, не имеющих аналогов среди "классических" мутаций. Сравнительный анализ мутантов в гомозиготах и компаундах при разных температурах культивирования линий позволил разбить их на шесть комплементационных групп. Мутанты первых пяти групп различаются качественно - наборами редуцированных щетинок, тогда как мутанты шестой группы различаются лишь пенетрантно-стью по редукции единственной пары гумеральных щетинок. Выявленные особенности проявлений' дают основание предполагать не только генетические изменения в структуре олигогена soute, но
и модулирующее влияние полигенных составляющих системы детерминации щетиночного узора.
Для локализации полигенов впервые использован принципиально новый подход, заключающийся в сравнительном анализе совместного распределения мобильных элементов шести семейств. Сопоставление рисунков совокупных распределений v, oopia, gyp-By, B104, Dm4i2, МДГ1 в сериях изогенных линий с различной пенетрантностыо позволило указать корреляцию меаду уровнем редукции и локализацией мобильных элементов. Специфичные для разных уровней пенетрантности наборы сайтов локализации мобильных элементов не связаны с происхождением изогенных линий, что определенно указывает на эти сайты как на позиции гипотетических полигенов, связанных с установлением уровня пенетрантности. Таким образом, впервые картированы некоторые полигены, входящие в систему контроля детерминации количественного признака.
Впервые оценено влияние изогенизирукшх скрещиваний на рисунок мобильных элементов в дочерних линиях. В результате исследования спектра распределений мобильных элементов шести семейств в нисходящем ряду изогенных линий выявлен полиморфизм по сайтам инсерций. Показано, что позиционное разнообразие обеспечивается спонтанными транспозициями элементов в родительских линиях, а также рекомбинациями с балансерными хромосомами и перемещениями элементов в процессе изогенизации, частота которых при этом значительно возрастает. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы дают качественно новую информацию о системе реализашш конкретного количественного признака. В то же время сходство систем полигенного контроля детерминации для многих количественных признаков в отношении их организации и функционирования, которые обеспечиваются сходством составляющих их единиц и универсальностью механизмов сегрегации, рекомбинации, экспрессии, мутирования входящих в них генов, позволяют предполагать, что закономерности, выявленные для системы, achaete-eoute, носят общий характер и могут быть экстраполированы на другие системы и объекты, расширяя тем самым представление об общих закономерностях их организации и функционирования.
Факт доказанной активации перемещений мобильных элементов
и наличия "рекомбинаций с хромосомами-балансерами в процессе изогбнизирущих скрещиваний позволяет дать практические рекомендации проводить паспортизацию всех линий, участвующих, з таких скрещиваниях, на предает распределения мобильных элементов, чтобы избежать смещения оценок степени полиморфизма в исходных линиях и ошибок при расчете частот перемещений в мекшнейных скрещиваниях подобного типа.
При идентификации полигенных локусов с помощью мобильных элементов следует использовать сравнительный анализ совокупных распределений нескольких мобильных элементов, что повышает разрешащую способность эксперимента и прогностическую ценность результатов.
Результаты работы используются при чтении курсов лекций в Новосибирском Государственном университете. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались или представлялись на II, III, IV и VI Всесоюзных съездах ВОГиС (Москва, 1972; Ленинград, 1977; Кишенев, 1982; Москва, 1987), II Школе ВОГиС по генетике дрозофилы (Канев, 1977), XIV Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), V, VI и VII Всесоюзных Симпозиумах "Молекулярные мохапиг.:я; гетгетэтэскнх процессов" (Москва, 1983, 1937, 1990), vi Всесоюзном совещании по проблемам генетики и биологии дрозофилы (Одесса, 1989), Международной конференции "Modelling and computer methods in molecular biology and genetics11 (Novosibirsk, 1990), на отчетных сессиях ІЩиГ 1990'и 199бг.г.
Материалы диссертации представлены б 34 публикациях. Работа выполнялась в лабораториях популяционной генетики и молекулярной эволюции КЦиГ СО РАН при частичкой финансовой поддержке ГНТПР "Приоритетные направления генетики".
Результаты получены автором лично шн в совместных исследованиях с .ПШТПЖкоро], В.А.Ратнером, С.Н.Родиным, Т.А.Бухариной (Кожемякиной), С.А.Забановым, Ю.Н.Ивановым, участие которых отражено в цитированных публикациях. Всем названным коллегам автор искренне признателен. Особую благодарность автор выражает В.А.Ратнеру - инициатору исследования генетический топографии локуса soute -, под чьим руководством была выполнена кандидатская диссертация, материалы которой частично использованы при написании первой главы.
Объем и структура работы, диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста (без списка литературы), состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и приложения. Текст иллюстрирован 47 таблицами, 2 схемами и 7 рисунками. Библиография - 384 работы, в том числе 94 на русском языке.