Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Организация генома домашней курицы 12
1.1.1. Особенности молекулярной организации генома 12
1.1.2. Особенности кариотипа 13
1.2. Генетические карты хромосом 16
1.3. Физические карты хромосом 18
1.4. Гибридизация ДНК-ДНК in situ как метод прямого физического картирования 19
1.5. Картирование хромосом домашней курицы методом гибридизации ДНК-ДНК in situ 26
1.6. Картирование QTL, влияющих на качество яиц 28
1.7. Геномные библиотеки и их использование для позиционного клонирования 34
ГЛАВА 2. Материал и методы 39
2.1. Материал 39
2.2. Полимеразная цепная реакция 39
2.3. Скринирование геномных библиотек 40
2.3.1. Олигонуклетидное мечение ДНК-зондов 40
2.3.2. Гибридизация меченых ДНК-зондов с геномными клонами 41
2.3.3. Верификация аутентичности ВАС-клонов 41
2.4. Трансформация клеток Е. coli и выделение плазмидной ДНК 42
2.4.1. Трансформация клеток Е. coli 42
2.4.2. Выделение плазмидной ДНК 42
2.4.3. Очистка плазмидной ДНК 43
2.5. Приготовление препаратов митотических хромосом курицы 43
2.6. Мечение ДНК-зондов с помощью ник-трансляции 44
2.7. Преципитация ДЖ-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации 45
2.8. Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ 46
2.8.1. Гибридизация меченых ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом курицы 46
2.8.2. Детекция гибридизационных сигналов с использованием флуоресцентных красителей 47
2.8.3. Анализ результатов гибридизации 48
ГЛАВА 3. Результаты 50
ГЛАВА 4. Обсуждение 70
4.1. Выявление протяженных геномных клонов, содержащих микросателлитные последовательности ДНК, ограничивающие локусы QTL AW33 и ST53 70
4.2. Установление локализации QTL ST53 и QTL AW33 72
4.3. Выявление критического интервала для ST53 73
4.4. Выявление критического интервала для AW33 75
4.5. Гены-кандидаты для QTL ST53 76
4.6. Гены-кандидаты для QTL AW33 82
4.7. Перспективы и практическое применение результатов исследования QTLST53HAW33 99
Выводы 101
Практические предложения 102
Список литературы
- Организация генома домашней курицы
- Полимеразная цепная реакция
- Преципитация ДЖ-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации
- Выявление протяженных геномных клонов, содержащих микросателлитные последовательности ДНК, ограничивающие локусы QTL AW33 и ST53
Введение к работе
Актуальность проблемы. Большинство хозяйственно ценных признаков домашних животных имеют сложный полигенный тип наследования и контролируются многими генами, расположенными в локусах QTL (quantitative trait loci). Изучение комплексной молекулярной архитектуры QTL представляет интерес с точки зрения общей генетики (Маскау, 2001). Позиционное клонирование QTL - это получение совокупности перекрывающихся протяженных геномных клонов (контига) района хромосомы, оказавшего наибольшее влияние на количественные признаки.
В настоящее время известно несколько случаев успешного позиционного клонирования QTL у человека и мыши (Bodnar et al., 2002; Zhang, Krahe, 2002; Pershouse et al., 2000) и один у крупного рогатого скота (Grisart et al., 2002). В последнем исследовании был клонирован район величиной 3 сМ, обладающий наибольшим влиянием на жирность молока. В указанном исследовании был выявлен «ген-кандидат» для этого признака - DGAT1, показаны различия в его нуклеотидной последовательности у особей с различающимся фенотипом (Grisart et al., 2002).
Несмотря на то, что у домашней курицы пока не известно случаев успешного позиционного клонирования QTL, такие работы финансируются рядом государственных проектов и проводятся в нескольких ведущих лабораториях Европы и США (). Существующие в настоящее время генетические карты домашней курицы сравнительно плотно насыщены молекулярными маркерами () и могут быть использованы в качестве инструмента для позиционного клонирования.
Геномные библиотеки высокой плотности (гридированные геномные библиотеки) позволяют получать протяженные фрагменты ДЬЖ, содержащие интересующую исследователей последовательность, и широко используются для анализа генома с использованием различных подходов (Buitkamp et al., 1998).
Представленная работа посвящена позиционному клонированию двух районов хромосомы 4 домашней курицы, содержащих QTL толщины скорлупы на 53 неделе жизни (ST53) и массы белка в яйце на 33 неделе (AW33). Указанные признаки различаются у двух линий кур (польская зеленоногая и род-айленд) на 3.3% и 7.5%, соответственно.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является позиционное клонирование двух локусов количественных признаков домашней курицы - масса белка в яйце на 33-й неделе жизни курицы-несушки (AW33) и толщина скорлупы яйца на 53-й неделе жизни курицы-несушки (ST53).
Поставлены следующие задачи: получение протяженных геномных клонов границ локусов количествен- ных признаков масса белка в яйце на 33-й неделе жизни курицы-несушки (AW33) и толщина скорлупы яйца на 53-й неделе жизни курицы-несушки (ST53); установление локализации ВАС-клонов, содержащих последовательно- сти микросателлитов MCW0170, MCW0114 и ADL0241, на митотиче-ских хромосомах домашней курицы методом FISH; установление положения последовательностей полученных ВАС-клонов в составе чернового варианта полного сиквенса генома домашней курицы; получение всех доступных нуклеотидных последовательностей и дан- ных их расшифровки, пространственно связанных с выявленными ВАС-клонами; создание списка генов, являющихся позиционными кандидатами для QTL AW33 и ST53.
Научная новизна работы. Продемонстрирована эффективность использования гридированных геномных библиотек для позиционного клонирования локусов количественных признаков птиц. Путем позиционного клонирования локусов количественных признаков толщины скорлупы на 53-й неделе жизни (ST53) и массы белка в яйце на 33-й неделе (AW33) выявлено 15 протяженных геномных клонов, содержащих микросателлитные последовательности ДНК, ограничивающие локусы количественных признаков AW33 и ST53 и установлена их локализация в районах GGA4q21-22 и GGA4ql 1-12, соответственно. Выявлены интервалы полного сиквенса генома GGA4 65.565.518 - 68.451.718 (38 генов) и GGA4 16.643.314 - 17.834.699 (16 генов), являющиеся критическими для AW33 и ST53, соответственно.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом курицы и сравнительным картам человека, мыши и курицы () и банка данных нуклеотидных последовательностей () в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре генетики и селек- ции Санкт-Петербургского государственного университета в рамках магистерской программы «Эволюционная цитогенетика».
Апробация работы. Материалы работы были представлены на конференции «Актуальные проблемы генетики» Московского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2003), III Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), а также за рубежом на X Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2002); 4-й Европейской цитогенетической конференции (Болонья, Италия, 2004); 16-й Европейской конференции по цитогенетике животных и генному картированию (Жойе ен Жосас, Франция, 2004); XII Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2004; XIII Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2005). Результаты периодически докладывались на семинарах отдела молекулярной генетики и биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).
Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации были опубликованы в научных журналах "Animal Genetics", "Chromosome Research", "Hereditas". Всего по теме работы опубликовано 16 печатных работ, из них 7 статей и 9 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 15 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литературы насчитывает 22 русских и 158 иностранных названий.
Организация генома домашней курицы
Многими исследователями отмечается, что среди позвоночных животных класс Aves отличается наибольшей консервативностью величины геномов: для изученных в этом отношении видов птиц содержание ДНК на клеточное ядро варьирует от 2.5 до 3.0 пг. Гаплоидный геном птиц в среднем состоит из 1.2x109 п.н., что в 2.75 раза меньше, чем у млекопитающих. Сравнительно низкое содержание ДНК в геномах птиц объясняют «необходимостью полета», а высокий эволюционный консерватизм этого показателя - монофи-летическим происхождением класса Aves (Kadi et al., 1993).
Содержание уникальных последовательностей у изученных в этом отношении видов птиц (80-84%) по сравнению с млекопитающими (65-70%) является очень высоким (Oloffson, Bernardi, 1983; Stevens, 1986). При этом содержание сателлитной ДНК в геноме домашней курицы не превышает 3%, в то время как у млекопитающих число последовательностей, характеризующихся высокой повторяемостью в геноме, составляет около 35%) от всего генома (Oloffson, Bernardi, 1983). В 1972 году Браун и Джонс (Brown, Jones, 1972, цит. по: Shoffner, 1974) показали, что сателлитная ДНК локализуется в основном в микрохромосомах и в W-хромосоме домашней курицы и японского перепела. Микрохромосомы у Gallus gallus являются в основном ГЦ-обогащенными, хотя некоторые авторы отмечают, что в некоторых микрохромосомах центромерные районы АТ-обогащены (Fillon et al., 1998).
Использование АТ-специфических флуорохромов (акрихин-иприт, Хехст 33258, ДАПИ) не позволило выявить отчетливых блоков гетерохрома-тина курицы. Полученная неоднородная флуоресценция была недостаточно информативна для анализа Q-исчерченности хромосом.
Ряд исследований с использованием методов дифференциального окрашивания хромосом на большом количестве видов показал уникально высокий для позвоночных животных эволюционный консерватизм кариотипов представителей класса Aves (Takagi, Sasaki, 1974; Stock et al., 1974; Au et al., 1975; de Lucca, Chamma, 1977; de Boer, van Brink, 1982). У большинства ви дов птиц в кариотипе наблюдается 39-40 пар хромосом, из которых 6-8 пар выделяют как макрохромосомы (размером 3-8 мкм), остальные же являются трудноидентифицируемыми микрохромосомами (приблизительно 0.3-3 мкм) (Bitgood, Shoffner, 1990; Matzke et al., 1990). Но надо отметить, что деление хромосом на макро- и микрохромосомы имеет условный характер, т.к. у курицы, например, на стадии прометафазы все хромосомы по размеру образуют единый непрерывный ряд (Shoffner, 1974).
Долгое время существовали различные мнения относительно природы микрохромосом. В 50-х годах было высказано предположение, что это не истинные хромосомы, а фрагменты хромосом или структуры, возникающие заново в митозе и мейозе и являющиеся резервом хроматина, поэтому их даже называли «хромосомоиды» (Newcomer, 1957, цит по: Яковлев, 1976). Само понятие «микрохромосомы» введено Оно в 1961 году (Ohno, 1961, цит. по: Bitgood, Shoffner, 1990).
Впервые о количестве хромосом курицы было сообщено в 1906 году, когда Лайоз обнаружил 6 пар хромосом (Louez, 1906, цит. по: Яковлев, 1976). С того времени делались многочисленные попытки установить точное число хромосом у этого вида птиц. Однако значительная вариабельность числа хромосом в клетках, полученных даже от одной и той же особи, долгое время не позволяла с достаточной уверенностью сделать вывод о количестве хромосом у кур (Яковлев, Трофимова, 1977).
В настоящее время на основании данных физического картирования около 200 маркеров первого типа (кодирующих последовательностей ДНК) показано, что около двух третей генов находятся на микрохромосомах (Smith J. et al., 2000). Это явилось главным доказательством генетической активно сти микрохромосом. Так, микрохромосомы содержат ядрышкообразующий район, гены главного комплекса гистосовместимости (Dominguez-Steglich et al., 1990), ген фактора роста нервов (Dominguez-Steglich et al., 1990), онкогены и некоторые другие гены (Ponce de Leon, Burt, 1993).
У птиц, как и у других позвоночных, имеются короткие последовательности, характеризующиеся высоким содержанием ГЦ-пар - так называемые CpG-островки - короткие (около 1 т.п.н.) неметилированные блоки нуклео-тидов, располагающиеся у 5 концов большинства генов позвоночных (McQueen et al., 1996). При помощи гибридизации in situ было показано, что CpG-островки концентрируются в основном в микрохромосомах; в макрохромосомах их значительно меньше (почти в шесть раз), что, возможно, связано с более низкой концентрацией генов в этой группе хромосом (McQueen eta!., 1998).
Все вышеизложенное дает основания считать микрохромосомы настоящими хромосомами, отличающимися от макрохромосом лишь по размеру и характеру компактизации.
Полимеразная цепная реакция
Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на основании информации, содержащейся в базах данных, опубликованных в сети Интернет (http://www.nlm.ncbi.nih.gov) при помощи компьютерной программы PRJMER_INPUT_3 (http://www-genome.wi.mit.edu). Амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили с использованием амплификаторов «Евро-голд» и «Биометра». Условия амплификации ДНК подбирали эмпирически.
Скринирование библиотек проводили методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтре в соответствии с рекомендациями производителей, с использованием радиоактивных ДНК-зондов.
Олигонуклеотидное мечение ДНК-зондов для скринирования геномных библиотек проводили при помощи набора «Рандом-прайм» («Ферментас», Вильнюс, Литва) с использованием 2 Mbq a- P-dATP.
Компоненты смешивали в следующем составе: ДНК-матрица - 15-30 нг; раствор гексануклеотидов-праймеров (10 мкМ) - 2 мкл; бидистиллированная вода - до 30 мкл.
Смесь денатурировали нагреванием в термоблоке до 95 С в течение 3-5 минут и быстро охлаждали на льду. Затем добавляли: 1 Ох буфер для кленовского фрагмента ДНК-полимеразы - 5 мкл; смесь dNTPs (кроме dATP) (0.1 мМ) - 10 мкл; a-32P-dATP - 2 Mbq; кленовский фрагмент ДНК-полимеразы 1(10 ед/мкл) - 0.5 мкл; бидистиллированная вода - до 50 мкл.
Полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при 37 С, реакцию останавливали добавлением 1 мкл раствора ЭДТА (0.5 М).
Предгибридизацию реплик гридированных библиотек проводили инкубированием при 65 С в растворе Church Buffer (0.342 М Na2HP04, 0.158 М NaH2P04, 7% SDS, 1% BSA, pH 7.2) в течение 1 часа. Затем в раствор добавляли по 25 мкл меченого ДНК-зонда на библиотеку и инкубировали при той же температуре в течение 16 часов.
Отмывки проводили по следующей схеме: 2xSSC, 0.1 % SDS при температуре 65 С в течение 7 минут; 2xSSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут; 0.5xSSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут; O.lxSSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут. Затем фильтры заворачивали в полиэтиленовую пленку Sarah Wrap и помещали в кассеты.
Анализ результатов гибридизации проводили методом авторадиографии на рентгеновской пленке Kodak или прямым сканированием на приборе FX-Scan. Полученные изображения обрабатывали при помощи пакета компьютерных программ Quantity-One.
Проверку клонов на предмет наличия искомой последовательности проводили путем прямого секвенирования фрагментов ДНК при помощи се-квенатора ABI-377 (Perkin Elmer) и набора Big-Dye-Mix (Perkin-Elmer) или при помощи ПЦР. В последнем случае признаком подтверждения считали получение амплифицированного фрагмента ДНК ожидаемой длины. мкл ДНК добавляли к 200 мкл компетентной культуры штамма НВ кишечной палочки Escherichia coli. Смесь инкубировали на льду в течении 30 минут. Затем проводили термическую обработку (тепловой шок) на водяной бане в течении 40 секунд при 42 С. После чего смесь помещали на лед и сразу добавляли 1 мл жидкой LB среды (бактотриптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлорид натрия - 10 г, дистиллированная вода до 1 л) без антибиотика. Затем смесь инкубировали 1 час при 37 С. После чего смесь осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант сливали, оставляя около 100 мкл над осадком. Осадок ресуспендировали и высевали на чашки Петри с твердой средой LB с хлорамфениколом (30-50 мг антибиотика на литр среды LB). Бактерии выращивали в суховоздушном термостате при 37 С в течение 16-18 часов.
Преципитация ДЖ-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации
Преципитацию ДНК-зондов проводили путем переосаждения этанолом в присутствии конкурирующей ДНК в целях супрессии неспецифической гибридизации.
К смеси после ник-трансляции добавляли: ДНК сельди (конкурирующая ДНК) 1 мкг/мл - 8 мкл; ЗМ ацетат натрия - 8 мкл; 96% этиловый спирт - 300 мкл.
Смесь помещали на один час в морозильную камеру на -20 С. После чего осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут. Затем супернатант сливали, к осадку добавляли 300 мкл 70% этилового спирта и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант сливали, а осадок высушивали на воздухе и растворяли в 40 мкл гибридиза-ционной смеси (50% формамида, 10% декстрантсульфата, 2xSSC).
Гибридизацию ДНК-ДНК in situ проводили по методике Герхардта (Gerhardt et al., 1981) с некоторыми модификациями (Сазанов и др., 1992).
Препараты митотических хромосом обрабатывали раствором рибонуклеази 0.1 мкг/мкл, из расчета 80 мкл раствора под каждое покровное стекло, в течении одного часа при комнатной температуре.
Затем препараты отмывали в трех сменах 2xSSC (рН 6.8-7.0) по 5 минут в каждой, обезвоживали проведением через серию спиртов возрастающей концентрации (70, 80, 96) по 2 минуты в каждом, и высушивали на воздухе.
Денатурацию ДНК митотических хромосом проводили инкубированием в растворе, состоящем из 70% формамида и 30%) 2xSSC в течении 2 минут при температуре 75 С. Затем препараты быстро охлаждали проведением через серию спиртов возрастающей концентрации по 5 минут в каждом и высушивали на воздухе.
Денатурацию меченых ДНК-зондов проводили путем их нагревания в течении 10 минут при температуре 70 С. Зонды находились в гибридизаци-онной смеси следующего состава: ДНК-зонд - 40 мкл; ДНК спермы сельди - 1 мкл; 10% декстрансульфат - 100 мг; 50% формамид - 500 мкл; 2XSSC-100MWI; вода дистиллированная - 400 мкл.
Далее гибридизационную смесь охлаждали и наносили на препараты митотических хромосом по 40 мкл под одно покровное стекло. Препараты помещали в чашки Петри и инкубировали в сухо-воздушном термостате 18 часов при температуре 37 С.
Препараты отмывали в трех сменах 2xSSC по 5 минут в каждой при температуре 37 С. Затем проводили еще три отмывки в 2xSSC при комнатной температуре по 5 минут, и три отмывки в O.lxSSC по 5 минут.
На невысушенные препараты наносили 3% раствор BSA в 4Т (99% 4xSSC и 1% Tween20) по 80 мкл под покровное стекло и инкубировали 30 минут при температуре 37 С. Затем препараты отмывали в трех сменах 4Т при температуре 37 С по 5 минут в каждой и приступали к процедуре детекции сигнала.
Детекцию сигнала проводили при помощи авидин-FITC флуоресцентной системы детекции по общепринятой методике (Florijn et al., 1995) с некоторыми модификациями.
При использовании одноцветного варианта FISH на препараты наносили раствор коньюгата авидин-FITC фирмы "Sigma" 5 мкг/мл по 20 мкл под покровное стекло (маточный раствор авидин-FITC 1 мг/мл разводили 1% раствором блокирующего реагента в 0.1% Tween20 в 4xSSC) и инкубировали в течение 30 минут при 37 С. Отмывали препараты в трех сменах 0.1% Tween20 в 4xSSC по 5 минут при 37 С. Следующим этапом было нанесение раствора антител к авидин-FITC фирмы "Sigma" 5 мкг/мл по 20 мкл под покровное стекло (маточный раствор антител к авидин-FITC 1.5 мг/мл разводили 1% раствором блокирующего реагента в 0.1% Tween20 в 4xSSC) и инкубирование ее в течение 30 минут при 37 С. Препараты отмывали также, как и в случае авидин-FITC. Проводили вторичную обработку препаратов авидин-FITC при тех же условиях. Препараты отмывали в трех сменах 0.1% Tween20 в 4xSSC по 5 минут при 37 С. После чего препараты окрашивали раствором пропидиум иодида (или ДАПИ) в антифейде Vectashield фирмы "Vector". Краситель наносили по 40 мкл под одно покровное стекло.
Выявление протяженных геномных клонов, содержащих микросателлитные последовательности ДНК, ограничивающие локусы QTL AW33 и ST53
Примененное в настоящей работе скринирование ВАС-библиотек показало их адекватность задачам геномного картирования - было выявлено множество протяженных геномных клонов, содержащих искомые последовательности, что было подтверждено методом блот-гибридизации по Саузерну или секвенированием. Этот же метод ранее с успехом был применен для позиционного клонирования QTL, определяющего такую хозяйственно важную количественную характеристику, как жирность молока у крупного рогатого скота (Grisart et al., 2002). Чтобы клонировать гены, ответственные за наблюдаемый эффект QTL, авторами был сконструирован ВАС-контиг, охватывающий интервал BULGE 13-BULGE09, содержащий этот QTL. Это было выполнено посредством скринирования ВАС-библиотеки коровы (Warren et al., 2000) путем гибридизации на фильтре с микросателлитными маркерами, имеющимися в проксимальном участке BTA14q, так же как человеческие клоны кДНК, которые, как известно, картируются на ортологичном хромосомном районе человека, а именно HSA8q23el (Riquet et al., 1999). В этой же работе был определен ген - позиционный кандидат для QTL жирности молока.
Был найден ген, кодирующий белок с ацилКоА: диацилглицерол-ацилтрансферазной (DGAT1 - ЕС 2.3.1.20) активностью (Cases et al., 1998). Было показано, что он, при его выбивании, полностью ингибирует лактацию у мыши (Smith et al., 2000). Этот ген был первоначально картирован на HSA8qter посредством FISH-анализа (Cases et al., 1998), а в настоящее время известно, что он находится в положении 143.8 т.п.н. на геномной последовательности HSA8q24.3 (Lander et al., 2001). Авторы скринировали находящуюся в публичном доступе базу данных с опубликованными последовательностями DGAT1 кДНК мыши и человека и определили три выступающих свободных конца последовательности (ESTs) у коровы (AW446908, AW446985, AW652329), которые совместно покрывают приблизительно две трети этого гена коровы. Посредством сравнения геномных последовательностей человеческого DGAT1 с последовательностями кДНК человека и коровы, можно определить соответствующие интрон-экзонные границы и создать ПЦР-праймеры, которые могли бы амплифицировать часть гена DGAT1 коровы из геномной ДНК. Был скринирован контиг с этим STS и показано, что ген DGAT1 коровы содержался в подмножестве сконструированных ВАС, что дает точное положение гена DGAT1 в интервале BULGE 13-BULGE09. Эти результаты показывают, что положение DGAT1 на карте в точности совпадает с наиболее вероятной позицией QTL 14-й хромосомы, как это было определено с помощью анализа связи и анализа неравновесия связи (LD). Принимая во внимание, что этот QTL главным образом влияет на жирность молока, что 98% молочных жиров являются триглицеридами, что DGAT1 катализирует финальную ступень синтеза триглицеридов, а также принимая во внимание то влияние, которое выбивание DGAT1 оказывает на лактацию, авторы рассматривают этот ген как очень вероятный позиционный кандидат для соответствующего QTL.
Таким образом, гридированные геномные библиотеки протяженных ДНК-клонов (основанные на искусственных хромосомах бактерий), хорошо зарекомендовавшие себя на млекопитающих, с успехом могут быть применены и для анализа генома и, возможно, позиционного клонирования локусов количественных признаков и у представителей класса Aves.
В нашей работе использованы гридированные ВАС-библиотеки курицы (средний размер вставки около 150 т.п.н. и 152 т.п.н., представлен эквивалент 5.2 и 5.3 генома, соответственно).
Получение 15-ти протяженных геномных клонов, содержащих нуклео-тидные последовательности границ QTL AW33 и ST53, и их физическое картирование на хромосоме 4 домашней курицы позволило провести привязку данных гибридологического анализа к контигам, объединяющим известные секвенированные ВАС-клоны. Благодаря этому нам удалось выявить границы QTL в терминах полного сиквенса генома домашней курицы - пар нук-леотидов (п.н.).