Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Гаплотипический анализ мутаций гена GJB2: эффект основателя как основной механизм возникновения АРГ 1А типа 12
1.2. Мутация сайта сплайсинга с.-23+1G A гена GJB2 – основная генетическая причина возникновения АРГ 1А типа в Якутии 22
1.3. Гипотеза селективного преимущества гетерозиготных носителей мутаций гена GJB2 27
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Выборка исследования 38
2.2. Методы молекулярно-генетического анализа 39
2.3. Статистические методы 43
2.4. Филогенетический анализ 45
2.5. Методы биоинформационного анализа 45
2.6. Методы ультразвукового исследования толщины эпидермиса и анкетирование по Бристольской шкале стула 49
2.7. Этический контроль 51
Глава 3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Доказательства эффекта основателя по мутации c.-23+1G A гена GJB2 52
3.1.1. Реконструкция c.-23+1G A-гаплотипов по данным SNP-маркеров в популяции якутов 52
3.1.2. Реконструкция гаплотипа основателя с мутацией c.-23+1G A, по данным 9 SNP-маркеров в шести популяциях Евразии 58
3.2. Центр происхождения и пути миграции носителей мутации с.-23+1G A гена GJB2 по данным 730 000 SNP-маркеров 62
3.3. Селективное преимущество гетерозиготных носителей мутации с.-23+1G A гена GJB2 в Якутии 73
3.3.1. Сравнительный анализ толщины эпидермиса у индивидуумов с различными GJB2-генотипами по мутации с.-23+1G A 73
3.3.2. Резистентность гетерозиготных носителей мутаций с.-23+1G A гена GJB2 к диарее 78
Заключение 83
Выводы 89
Список литературы 90
Приложение А Реконструкция гаплотипов-основателей семи этно-специфических мутаций гена GJB2 120
Приложение Б Описание пяти исследуемых выборок 127
Приложение В Частота мутации c.-23+1G A среди всех мутаций гена GJB2 в популяциях мира 129
- Гаплотипический анализ мутаций гена GJB2: эффект основателя как основной механизм возникновения АРГ 1А типа
- Гипотеза селективного преимущества гетерозиготных носителей мутаций гена GJB2
- Реконструкция c.-23+1G A-гаплотипов по данным SNP-маркеров в популяции якутов
- Резистентность гетерозиготных носителей мутаций с.-23+1G A гена GJB2 к диарее
Гаплотипический анализ мутаций гена GJB2: эффект основателя как основной механизм возникновения АРГ 1А типа
Ген GJB2 (MIM #121011) кодирует трансмембранный белок межщелевых контактов коннексин 26 (Cx26). Данный белок участвует в формировании щелевых каналов и является основным регулятором гомеостаза ионов K+ в клетках внутреннего уха [Dror et al., 2009]. При мутациях гена GJB2 происходит нарушение формирования щелевых каналов, формируемых белком коннексин 26 и в отсутствие рециркуляции ионов K+ волосковые клетки не способны генерировать биоэлектрический потенциал ответа на звук [Lefebvre et al., 2000], что приводит к аутосомно-рецессивной глухоте 1A типа (DFNB1A) (OMIM # 220290) [Kelsell et al., 1997]. В настоящее время в гене GJB2 описано свыше 400 различных аллельных вариантов (The Human Gene Mutation Database) [Stenson et al., 2014], которые являются наиболее распространенными причинами врожденной потери слуха во всем мире.
Мутация с.35delG. Показано, что некоторые мутации в гене GJB2 имеют этногеографическую специфичность и вносят значительный вклад в этиологию потери слуха в различных популяциях мира. Так, например, мутация с.35delG представляет собой делецию одного (G) из шести гуанинов (GGGGGG) во втором экзоне гена GJB2, что приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи белка коннексина 26 (p.Gly12Valfs 2). Среди всех мутантных хромосом гена GJB2 аллельная частота мутации с.35delG в Европе составляет от 71,1% до 100%, на Ближнем Востоке, от 68,6% - 93,8%, в Северной Африке от 50% - 84,2%, в Северной и Южной Америке от 51,3% - 100% и в Австралии около 38%, соответственно [Tsukada et al., 2015]. Однако, с.35delG крайне редко встречается в Южной (Индия, Пакистан, Бангладеш), Юго-Восточной (Таиланд, Малайзия, Индонезия) и Восточной Азии (Япония, Китай, Южная Корея) [Abe et al., 2000; Tsukada et al., 2015]. Ранее, были высказаны предположения о том, что c.35delG является частой мутацией гена GJB2, поскольку может возникать de novo в результате «горячей точки разрыва». При таком сценарии допускалось, что ДНК-полимераза может «ошибаться» и «проскальзывать», проходя через трек из 6 расположенных подряд гуанинов (GGGGGG) [Morell et al., 1998; Carrasquillo et al., 1997; Denoyelle et al., 1997]. В пользу этой гипотезы свидетельствовали ранние исследования Morell et al., выполненные с использованием трех STR-маркеров (D13S141 – D13S175 – D13S250) в популяции евреев Ашкенази [Morell et al., 1998]. В этом исследовании было показано, что мутация с.35delG гена GJB2 ассоциирована с различными гаплотипами (3-4-1 и 2-4-1) (Приложение А) и сделано предположение, о том, что, она может возникать de novo на различных по происхождению хромосомах [Morell et al., 1998]. Однако расстояние между маркерами было достаточно протяженным, около 2 сМ. Причем, низкая частота встречаемости мутации с.35delG в популяциях Азии [Abe et al., 2000], противоречили гипотезе «горячей точки» [Van Laer et al., 2001]. В 2001 году Van Laer et al. впервые сообщили о том, что обнаружили доказательства того, что высокая частота встречаемости мутации c.35delG гена GJB2 в европейских по происхождению популяциях человека является результатом общего эффекта основателя, а не «горячей точки разрыва» [Van Laer et al., 2001]. В этом исследовании авторы использовали панель из 6-ти SNP-маркеров (rs3751385, rs5030700, rs5030701, rs5030702, rs2031282 и rs74793), фланкирующих область мутации с.35delG на более коротком хромосомном расстоянии ( 70 Kb), что позволило обнаружить предковый гаплотип, ассоциированный с мутантными c.35delG-хромосомами в популяциях Европы (Бельгия, Великобритания) и США (выходцы из Европы) [Van Laer et al., 2001]. Кроме того, авторы определили приблизительный «возраст» начала дивергенции мутантных хромосом, равный 10 000 лет [Van Laer et al., 2001]. Поскольку мутация с.35delG впервые возникла достаточно давно, не удивительно, что мутантные с.35delG-гаплотипы во многих популяциях мира являются достаточно дивергированными, а единая область сохранного гаплотипа основателя может наблюдаться в очень небольшом хромосомном интервале. Возраст мутации также объясняет ее повсеместное распространение в Европе, Средиземноморье и Соединенных Штатах Америки [Van Laer et al., 2001]. Вероятно, впервые мутация с.35delG возникла в регионе Ближнего Востока и только затем, с неолитической волной миграции Homo sapiens распространилась по всей Европе двумя наиболее вероятными маршрутами – северным и южным. Южный путь следовал по побережью Средиземного моря до Италии и Испании, а северный - вел вдоль долин рек Дунай и Рейн, в Скандинавию. Мутация с.35delG была в дальнейшем привнесена в Северную, Центральную и Южную Америку вместе с европейскими колонистами и последующей эмиграцией европейского населения в Новый Свет [Van Laer et al., 2001].
В дальнейших исследованиях мутантных с.35delG-гаплотипов в популяциях Палестины и Израиля, проведенных на панели из двух STR-маркеров (D13S141 и D13S175) и трех SNP маркеров (-3558, 1946, 2034), также было показано общее происхождение мутации с.35delG в Палестине и Израиле [Shanin et al., 2002]. В 2003 году в популяциях Евреев Ашкенази, США, Италии и Бразилии, на панели из двух SNP-маркеров (1285, 1245) и двух STR-маркеров (D13S1316 и D13S175) было обнаружено, что все хромосомы, содержащие мутацию с.35delG, несут очень редкий гаплотип нехарактерный для нормальных хромосом (без мутации с.35delG) [Rothrock et al., 2003] (Приложение А). В связи с этим авторы пришли к выводу, что данная мутация могла, произойти в прошлом лишь единожды у предков современных европейцев [Rothrock et al., 2003], а ее высокая частота гетерозиготного носительства в отдельных популяциях Европы может объясняться селективным преимуществом гетерозигот по мутации с.35delG гена GJB2 [Rothrock et al., 2003].
В 2004 году был показан эффект основателя по мутации с.35delG в популяциях Анатолии (территория современной Турции), на основе единого мутантного гаплотипа (4-C-G-5 по маркерам D13S175, rs877098, SNP3, rs9552101, rs3751385, D13S141 и rs747931), а также была показана взаимосвязь с другими популяциями из стран США (белое население), Великобритании, Италии и Бельгии [Tekin et al., 2004]. Авторы пришли к выводу, что мутация с.35delG, по 15 видимому, возникла единожды на хромосоме с гаплотипом 4-C-G-5 [Tekin et al., 2004] (Приложение А).
В гаплотипическом исследовании Balci et al., 2005 проведенном в Турции по трем STR-маркерам (D13S141, D13S175, D13S143), были найдены 8 гаплотипов, характерных для мутации с.35delG (2-6-4; 2-5-4; 3-5-4; 3-5-2; 3-4-4; 2-5-1; 3-1-1; 1-5-4). Однако, наиболее частым являлся гаплотип 2-5-4, который встречался с частотой 24,4% среди всех мутантных гаплотипов, данный гаплотип так же был характерен для популяций Турции (не Черноморской части). В Черноморской части Турции данный гаплотип был на втором месте по частоте встречаемости среди хромосом без мутации [Balci et al., 2005].
В 2008 году в Марокко на основе анализа трех STR-маркеров (D13S141, D13S175 и D13S143) были обнаружены два мутантных гаплотипа (125-105-130 и 125-105-132) сцепленных с мутацией c.35delG, которые встречались с частотой 90,8% среди всех хромосом с мутацией с.35delG, тогда как на хромосомах без мутаций встречались лишь с частотой 2,65%. [Abidi et al., 2008]. Причем, один гаплотип 125-105-130 был характерен для 68% хромосом с изучаемой мутацией (Приложение А). У населения Марокко, мутация c.35delG так же имела общего основателя, возраст экспансии мутантного гаплотипа был определен как 135 поколений назад или примерно 2700 лет [Abidi et al., 2008].
В том же году на панели из 6-ти SNP-маркеров (rs3751385, rs5030700, rs5030701, rs5030702, rs2031282 и rs747931) и двух STR-маркеров (D13S175, D13S141)был доказан общий эффект основателя по мутации c.35delG в популяциях Греции при сравнении мутантного гаплотипа (TGGTGA-3-7) с популяциями Бельгии, Британии и США [Kokotas et al., 2008]. В этой работе был найден наиболее удаленный, но еще сцепленный с мутацией маркер (SNP6-rs747931), который использовался для более точного расчета возраста с.35delG гена GJB2, и который составил 14 000 лет [Kokotas et al., 2008]. В этой работе авторы так же указали на возможное селективное преимущество гетерозиготных носителей мутации с.35delG гена GJB2, которое могло бы объяснить повсеместное распространение и сохранение высокой частоты гетерозиготного носительства этой мутации [Kokotas et al., 2008]. В 2010 году этой же группой исследователей было высказано предположение о том, что мутация с.35delG гена GJB2 могла возникнуть на территории современной Греции, поскольку именно там встречается наибольшая частота мутации с.35delG [Kokotas et al., 2010].
Гипотеза селективного преимущества гетерозиготных носителей мутаций гена GJB2
Моногенные болезни наследуются в соответствии с законами классической генетики Грегора Менделя. Поэтому для моногенных болезней наиболее характерны определенные типы наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный и сцепленное с полом наследование. Это наиболее широкая группа наследственных заболеваний. В настоящее время описано около 4450 фенотипов с известным генетическим дефектом, подавляющее большинство которых встречается довольно редко. Генетическая эпидемиология накопила достаточно большой массив данных по частотам моногенных болезней в различных популяциях. Суммарная отягощенность наследственными болезнями в устойчивых сформировавшихся популяциях относительно низка и варьирует в небольших пределах – от 1,5 до 3,5 на 1000 [Степанов, 2010].
Главными факторами популяционной динамики, формирующими картину популяционных различий в отягощенности наследственных болезней, являются дрейф генов и эффект основателя [Гинтер, 2006]. Роль естественного отбора в дифференциации популяций по генам наследственных болезней в целом невелика, поскольку мутации, приводящие к наследственным болезням, снижают приспособленность больных независимо от их этнического или географического происхождения. Однако из этого правила есть весьма примечательные исключения. Самое известное из них – высокая частота гетерозигот по серповидно клеточной анемии и -талассемии в субтропических и тропических регионах, в частности в Средиземноморье. Районы высокой частоты указанных эритроцитарных болезней и малярии практически перекрываются [Jobling et al., 2004]. Доказано, что гетерозиготные носители мутантных аллелей этих генов имеют селективное преимущество, связанное с лучшей устойчивостью к малярии, и высокая частота гетерозигот поддерживается балансирующим отбором [Степанов, 2010].
Еще одна частая наследственная болезнь – муковисцидоз (кистозный фиброз) с высокой частотой встречается у европейцев и гораздо реже в других географических регионах. Широкое распространение основной мутации по всей Европе и ее редкость в других частях Света означают, что эта мутация возникла достаточно давно, приблизительно после расселения современного человека из Африки. Прямые оценки возраста этой мутации разными способами свидетельствуют, об относительно недавнем – около 10 тысяч лет назад – ее происхождении [Slatkin et al., 2001; Wiuf et al, 2001]. Вероятной причиной широкого распространения мутации в Европе, как и эритроцитарных болезней, представляется селективное преимущество гетерозигот, связанное с меньшей предрасположенностью к обезвоживанию при холере и тифе, которые свирепствовали в Европе относительно недавно [Степанов, 2010]. Для других распространенных наследственных болезней стабилизирующие механизмы частот патологических аллелей, в популяции можно только предполагать.
Наиболее часто среди новорожденных регистрируются врожденные нарушения слуха (1 на 1000 новорожденных) [Marazita et al., 1993]. Около 50-80% случаев врожденных форм глухоты являются наследственными, и передаются по аутосомно-рецессивному типу [Mehl and Thompson, 2002]. Основной причиной аутосомно-рецессивных форм глухоты в различных популяциях человека являются мутации гена GJB2, в настоящее время их известно более 300 [The Human Gene Mutation Database – http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php]. Наиболее частая мутация с.35deIG составляет до 70% аллелей, обнаруженных у пациентов в Европе и Северной Америке, частота гетерозиготного носительства в среднем составляет от - 1/30 в районе Средиземного моря, до - 1/70 в Северной Европе [Gasparini et al., 2000]. Уникальные патогенные мутации гена GJB2 были зарегистрированы в Восточной Азии - c.235delC [Yan et al., 2003], в Индии – p.Trp24X [Mani et al., 2003], у евреев ашкенази – c.167delT [Morell et al., 1998] и северной Африке – p.Arg143Trp [Brobby et al., 1998]. Высокие частоты GJB2 мутации во многих этнических группах свидетельствуют о том, что гетерозиготные носители могут обладать некоторым преимуществом. Почему GJB2-носители, встречаются так часто?
В настоящее время известно, что носители мутации p.Arg143Trp, в некоторых африканских странах (Гана), демонстрируют утолщенный слой эпидермиса, по сравнению с носителями аллелей дикого типа, что возможно связано с более выраженной барьерной функцией кожи (у носителей патологических аллелей) от патогенов и укусов насекомых в тропическом и субтропическом климате [Meyer et al., 2002]. Данные полученные из биопсии кожи показали, что гетерозиготы по мутации p.Arg143Trp имеют более толстый эпидермис, чем гомозиготы по норме (Wt) [Meyer et al., 2002]. Более того, показана высокая жизнеспособность клеток HeLa, которые экспрессируют мутантный белок Cx26 (p.Arg143Trp), по сравнению с клетками которые экспрессируют нормальный белок Cx26 (Wt) [Common et al., 2004]. В органотипической модели кожи и в гистологических срезах также подтверждены данные о более толстом слое эпидермиса в мутантных клетках (рисунок 1).
В исследованиях in vitro было показано, что HeLa клетки с мутантным геном Сх26 не распространяют клеточную инвазию Shigella flexneri, в отличие от Сх26 клеток с нормальным генотипом (Wt). Кишечный патогенный возбудитель Shigella flexneri может открывать хемиканалы Сх26, отвечающий за выход АТФ [Tran Van Nhieu et al., 2003], что свидетельствует, о том, что Cx26 может играть определенную роль в бактериальной клеточной инвазии (рисунок 2).
В целом, эти исследования показывают, что нефункциональные каналы Cx26 из-за GJB2 мутаций наделяются полезными свойствами в эпидермисе кожи и возможно клетки экспрессирующие мутантный Сх26 в эпителии приводят к улучшению защиты эпидермиса, ускоренного заживления ран и защиты от инфекции.
В 2009 году были опубликованы результаты ультразвукового исследования толщины эпидермиса у гетерозиготных носителей мутации c.35delG в Испании, где также были подтверждены данные о более толстом слое кожного эпителия у носителей c.35delG на юге Европы [de Adamo et al., 2009]. Эпидермис был значительно толще у лиц гетерозиготных и гомозиготных по с.35delG, чем у тех, у кого был нормальный GJB2-генотип. Средняя толщина центральной части лба (0,47 мм +-0,04) была идентифицирована как лучшее место [Gniadecka et al., 1994], т.к. средняя линия лба обычно не зависит от физических упражнений, вызванных интенсивной работой и/или спортивными мероприятиями, которые могли бы увеличить толщину (рисунок 3).
Данные об утолщении эпидермиса у носителей c.35delG находятся в согласии с предыдущими наблюдениями, полученными в естественных условиях и в лаборатории для аллеля R134W GJB2 [Meyer et al., 2002; Man et al., 2007] и, таким образом, поддерживают гипотезу, что фенотип кожи может уравновесить эволюционный недостаток вызванной глухотой.
Полученные ранее сведения об экстремально высокой распространенности мутации сайта сплайсинга гена GJB2 в Восточной Сибири [Barashkov et al., 2011], нельзя объяснить с точки зрения барьерной функции кожи от укусов насекомых [Man et al., 2007], что свидетельствует об ином механизме генетической адаптации носителей патологических аллелей гена GJB2 в Северных широтах. Учитывая, что и на Севере толщина эпителия, также может иметь функциональное значение (скорее из-за вовлеченности в этот процесс эпителиальной ткани слизистой оболочки органов пищеварения) можно предположить, что носители мутаций гена GJB2 более устойчивы к бактериальной инвазии в желудочной и кишечной тканях, что уменьшает шансы инфицирования и развития желудочно-кишечных заболеваний, являющихся основными причинами младенческой и детской смертности в мире. Косвенно, данное умозаключение подтверждается сведениями об относительно низкой младенческой смертности в Якутии, что объясняет парадокс экспоненциального роста численности коренной популяции якутов в экстремальных климатогеографических условиях Крайнего Севера [Тырылгин, 2008].
В пользу гипотезы о действии стабилизирующего отбора среди коренного населения Восточной Сибири, свидетельствуют демографические показатели роста численности популяции якутов в относительно недавнее историческое время. Так, за последние 200 лет популяция якутов увеличилась в численности более чем в 7,7 раз, а Республика Саха (Якутия) в настоящее время относится к одному из регионов России, где сохранился естественный прирост населения [Тырылгин, 2008].
Реконструкция c.-23+1G A-гаплотипов по данным SNP-маркеров в популяции якутов
Для анализа гаплотипического разнообразия по мутации сайта сплайсинга c.-23+1G A гена GJB2 в популяции якутов, нами был проведен гаплотипический анализ 14-ти SNP-маркеров (rs3794370, rs7984806, rs1932429, rs5030702, rs7987144, rs7994748, rs4769974, rs2274084, rs2274083, rs3751385, rs11841024, rs2313477, rs4272877 и rs747931), фланкирующих участок гена GJB2 на расстоянии 3 Mb. Выборка глухих пациентов была представлена 111 индивидами из популяции якутов с мутацией c.-23+1G A гена GJB2 в гомозиготном состоянии. В качестве контрольной группы были исследованы 103 индивида из популяции якутов, не предъявляющие жалоб на снижение слуха и не имеющих данную мутацию. Сравнение аллельного разнообразия между хромосомами с мутацией c.-23+1G A гена GJB2 и хромосомами без данной мутации в популяции якутов показал, что для 8-ми из 14-ти исследованных SNP-маркеров (rs5030702, rs7994748, rs2274084, rs2274083, rs3751385, rs2313477, rs4272877и rs747931) были получены достоверные отличия встречаемости мажорных аллелей в опытной группе по сравнению с контрольной группой (p 0,05). Для одного наиболее удаленного SNP-маркера - rs3794370 (3 Mb) достоверных отличий в опытной группе по сравнению с контрольной группой не было найдено (p 0,05). Пять SNP-маркеров (rs7984806, rs1932429, rs7987144, rs4769974 и rs11841024) были неинформативны (рисунок 10).
Стоит отметить, что в группе больных аутосомно-рецессивной глухотой 1А типа, обусловленной мутацией сайта сплайсинга c.-23+1G A, мы не наблюдали значительного изменения частот аллелей. Только в одном случае, с SNP-маркером rs3794370, который встречался с частотой 55%, мы наблюдали изменение частот аллелей, что может объясняться его физической удаленностью от мутации c.-23+1G A (3 Mb).
Архитектура неравновесия по сцеплению (LD) в двух исследуемых выборках якутов с мутацией c.-23+1G A гена GJB2 и без данной мутации представлена на рисунке 11. В опытной группе был идентифицирован только один блок LD, протяженностью 65 kb. В контрольной группе, были идентифицированы два коротких блока LD, протяжённостью от 2 kb до 4 kb. Полученные данные подтверждают наличие различий в структуре LD между опытной и контрольной группой. Полученные данные об относительно низком генетическом разнообразии мутантных хромосом согласуются с гипотезой эффекта основателя в распространении мутации с.-23+1G A гена GJB2 в популяции якутов.
Для дальнейшего анализа реконструкций гаплотипов мы исключили 6 SNP-маркеров, поскольку пять SNP-маркеров (rs7984806, rs1932429, rs7987144, rs4769974 и rs11841024) оказались не информативны, а один SNP-маркер (rs3794370) не был сцеплен с исследуемой мутацией. Для реконструкции частоты гаплотипов, между хромосомами с мутацией c.-23+1G A гена GJB2 и хромосомами без исследуемой мутации, нами был использован EM-алгоритм.
В исследуемых выборках обнаружены 13 различных гаплотипов из 169 теоретически возможных. Гаплотип №1 (AACACGTT) достоверно чаще встречался на хромосомах без мутации c.-23+1G A, а гаплотип №2 (AACACGTC) достоверно чаще встречался на хромосомах с мутацией (таблица 5). Из всех исследованных гаплотипов, наиболее вероятным предковым гаплотипом по мутации c.-23+1G A гена GJB2 является гаплотип №2.
Для сравнительного анализа наиболее ближайших популяций по структуре к гаплотипу №2 (AACACGTC), были привлечены данные из открытой базы данных “1000 геномов”. Нами был использован анализ f2-коэффициента гомологичности по структуре гаплотипа №2 (AACACGTC) (рисунок 12).
Данный анализ показал, что наиболее отдаленные по структуре исследуемых 8 SNP-маркеров (rs5030702, rs7994748, rs2274084, rs2274083, rs3751385, rs2313477, rs4272877и rs747931) являются все исследуемые популяции Африки (ASW, ACB, ESN, LWK, GWD, MSL, YRI), остальные популяции не показали статистически достоверных отличий (рисунок 12). Вероятнее всего гаплотипическое единообразие данного локуса DFNB1 возникло в популяциях человека задолго до формирования многих современных этнических групп Сибири, но по-видимому это произошло уже вне африканского континента.
Резистентность гетерозиготных носителей мутаций с.-23+1G A гена GJB2 к диарее
Селективное преимущество носителей мутации с.-23+1G A в условиях субарктического климата, возможно объяснить тем, что гетерозиготные носители с.-23+1G A в Якутии, имея более толстый эпидермис, так же могут иметь повышенную устойчивость к кишечным инфекциям [Meyer et al., 2002; Common et al., 2004; Man et al., 2007; D Adamo et al., 2009; Guastalla et al., 2009; Vuckovic et al., 2015]. Поскольку, мутантные аллели гена GJB2 (p. R143W), в органотипической модели культуры клеток показывают повышенную миграцию клеток, по сравнению с клетками дикого типа и значительно менее восприимчивы к клеточной инвазии, кишечным патогеном Shigella flexneri [Man et al., 2007]. В последующем эти данные были подтверждены при исследовании частоты случаев диареи у гетерозиготных носителей мутации c.35delG, где у гетерозигот по данной мутации случаи диареи встречались достоверно реже, чем у лиц с нормальным GJB2-генотипом [Vuckovic et al., 2015].
Проведен анализ устойчивости гетерозиготных носителей мутации c.-23+1G A гена GJB2 к диарее. Были обследованы условно здоровые индивиды, у которых было проведено анкетирование согласно Бристольской шкале стула, которая содержала информацию о количествах случаев диареи за последний год (n=272). В результате проведенного молекулярно-генетического тестирования на наличие мутации c.-23+1G A гена GJB2 среди 272 участников исследования было выявлено 34 гетерозиготных носителей данной мутации и 238 индивидуумов не являлись носителями данной мутации.
Согласно Бристольской шкале стула более чем у 75% обследованных индивидуумов наблюдалась нормальная форма кала (тип 3 – 39%, тип 4 – 36%), и лишь у небольшого числа обследованных регистрировалась склонность к запору (тип 1 – 1%, тип 2 – 15%) или к диарее (тип 5 – 7%, тип 6 – 2%). При распределении общей выборки индивидуумов по GJB2 генотипу на гетерозиготных носителей мутации с.-23+1G A (n=34) и не носителей (n=238) наблюдалась схожая тенденция – большинство имели 3 и 4 тип стула. Гистограмма распределения по типам стула у гетерозиготных носителей мутации с.-23+1G A (n=34) и не носителей (n=238) представлена на рисунке 22А. Распределение по полу и по GJB2-генотипу не выявило статистически значимых отличий по типам стула (р 0,05) (рисунок 22Б).
За последний год у гетерозиготных носителей мутации c.-23+1G A случаи диареи не были зарегистрированы у 8 индивидуумов из 34 (23%). У лиц без мутации c.-23+1G A за последний год случаи диареи не были зарегистрированы у 12 человек из 238 прогенотипированных (5%) (таблица 10). При сравнении данных групп были получены достоверные отличия, которые свидетельствуют о том, что у гетерозиготных носителей мутации c.-23+1G A случаи диареи не регистрировались (0-никогда) за последний год достоверно чаще (p 0,05), чем у неносителей данной мутации. При распределении общей выборки по полу, также были выявлены статистически значимые отличия в частоте случаев диареи (респонденты чаще отвечали: 0 - «никогда»), как у мужчин (p 0,05), так и у женщин (p 0,01) (таблица 10).
Полученные результаты согласуются с ранее проведенными исследованиями в Италии, где было проведено исследование с участием 203 индивидуумов (63% женщин и 37% мужчин) в возрасте от 19 до 65 лет [Vuckovic et al., 2015]. Из них 170 индивидуумов не имели мутаций в гене GJB2, а у 33 индивидуумов были обнаружены мутации в гене GJB2 (чаще в гетерозиготном состоянии) [Vuckovic et al., 2015]. С применением линейной регрессии была обнаружена значительная корреляция частоты диареи в зависимости от GJB2-генотипа (p=0,017). Было показано, что у гетерозиготных носителей мутации с.35delG гена GJB2 частота случаев диареи была достоверно ниже, чем у не носителей GJB2 мутаций [Vuckovic et al., 2015].
Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают ранее полученные данные о том, что гетерозиготные носители мутаций гена GJB2 могут иметь повышенную устойчивость к желудочно-кишечным заболеваниям, в частности, к диарее. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о селективном преимуществе гетерозиготных носителей мутантных аллелей гена GJB2, что может объяснить обнаруженную ранее крайне высокую частоту гетерозиготного носительства мутации c.-23+1G A гена GJB2 (10,3%) в популяции якутов.