Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА. I. Электрофорез белков в генетических исследованиях (обзор литературы) б
ГЛАВА. II. Материал и методы 12
1. Районы сбора материала и объем выборок .12
2. Приготовление белковых проб для электрофореза; приборы для электрофореза 15
3. Электрофорез белков и получение зимограмм; исследованные белки 17
4. Показатели аллозимной изменчивости; использованные биометрические методы 20
ГЛАВА III. Уточнение таксономического статуса тихоокеанской устрицы 23
1. Таксономическое положение тихоокеанской устрицы, (обзор литературы) 23
2. Генетическая дифференциация в процессе видообразования (обзор литературы) 25
3. Генетическое единство морфометрически различающихся групп тихоокеанской устрицы 31
ГЛАВА. IV. Генетическая изменчивость белков тихоокеанской устрицы 37
1. Генетический полиморфизм белков в природных популяциях (обзор литературы) 37
2. Уровень генетической изменчивости белков в поселениях устриц в заливе Петра Великого Японского моря и в заливе Буссе Охотского моря 42
ГЛАВА V. Популяционно-генетическая структура тихоокеанской устрицы в заливе Петра Великого 49
1. Внутривидовая генетическая дифференциация популяций (обзор литературы) 49
2. Различия аллельных частот в устричных поселениях залива Петра Великого . 51
3. Возможные причины генетической дифференциации устричных поселений в заливе Петра Великого 56
4. Некоторые свидетельства дифференцирующего действия естественного отбора на устричные поселения в заливе Петра Великого 60
5. Генетическое сходство устричных поселений в заливе Петра Великого и популяционно-генети-ческая структура тихоокеанской устрицы 65
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ШВОМ
ЛЖЕРАОТА
ПРИЛОЖЕНИЯ 95
- Электрофорез белков в генетических исследованиях (обзор литературы)
- Районы сбора материала и объем выборок
- Таксономическое положение тихоокеанской устрицы, (обзор литературы)
- Генетический полиморфизм белков в природных популяциях (обзор литературы)
- Внутривидовая генетическая дифференциация популяций (обзор литературы)
Электрофорез белков в генетических исследованиях (обзор литературы)
Принципы электрофореза белков подробно изложены в работах Уилкинсона CI968), Маурера (1971), Левонтина (1978), Серова И др. (1977), Харриса, Хопкинсона ( Harris, Hopkinson, 1976). Метод гель-электрофореза заключается в том, что образцы белков, полученные от нескольких особей, помещают в гель, приготовленный из крахмала, синтетического полимера полиакри-ламида, агара или какого-либо другого вещества, дающего однородный пористый матрикс, и затем пропускают через гель постоянный электрический ток.
Любой полипептид представлен набором из 20 аминокислот. Из них 16 несут электростатически нейтральные боковые цепи, аргинин и лизин имеют в боковых цепях аминогруппы, а глутами-новая и аспарагиновая кислоты - карбоксильные группы. Молекула белка, составленная из аминокислот всех трех типов имеет суммарный заряд, который зависит от соотношения в молекуле положительно и отрицательно заряженных аминокислот, от концентрации водородных ионов в окружающей среде (рН) и от упаковки молекулы. При уменьшении рН аминогруппы аргинина и лизина приобретают положительные заряда, а карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, насыщаясь, становятся нейтральными, и вся молекула белка заряжается положительно. Обратное явление происходит при увеличении рН, и тогда молекула белка приобретает отрицательный заряд.
Если в гене, кодирующем структуру белка, произойдет мутация, вызывающая замену аминокислоты одного типа аминокислотой другого типа, то изменится суммарный заряд белковой молекулы при любом данном значении рН. Такие изменения суммарного заряда белковой молекулы, отражающие аллельные замещения в локусе, кодирующем этот белок, можно регистрировать по изменению скорости движения белка в электрическом поле. Именно эти изменения в скорости движения белков выявляются методом гель-электрофореза.
Районы сбора материала и объем выборок
Сбор устриц и обработка материала происходили в 1975-1979 годах. Из 6 природных устричников в зал. Петра Великого Японского моря и І устричника в зал. Буссе на о.Сахалин (Охотское море) были собраны 2140 особей устриц с глубин 0,5-3 метра. Японо-морские устричники удалены друг от друга на расстояние 20-200 км. Охотоморское устричное поселение в зал. Буссе удалено от группы японо-морских поселений более чем на 1000 км Срис.2).
Численность выборок из каждой локальности приведена в таблице I. Для оценки уровня генетических различий между разновозрастными группами устриц были исследованы 4 такие группы в зал. Восток и по 2 группы в зал. Амурский и Уссурийский. Поскольку методика определения возраста устриц до настоящего времени не была разработана, для отнесения устриц к той или иной возрастной группе, использовались размерные характеристики. Младшая возрастная группа, в дальнейшем называемая сеголетками, была представлена устрицами, личинки которых осели из планктона на субстрат в течение сезона, во время которого была взята выборка. Высота раковин сеголеток составляла не более 20 мм. Следующая размерно-возрастная группа, называемая мелкими, имела высоту раковин 30-50 мм. Третья группа - средние - характеризовалась высотой раковин 100-150 мм и четвертая - крупные - свыше 200 мм.
Таксономическое положение тихоокеанской устрицы, (обзор литературы)
Тихоокеанская устрица черезвычайно изменчива морфологически, чем и объясняется существование различий во мнениях систематиков о числе видов устриц в прибрежных водах Советского Дальнего Востока и об их родовой принадлежности. Закс (1933), считая всех дальневосточных устриц одним видом Ostrea gigas указывал на существование двух экологических форм. По его мнению морская форла характеризуется клиновидной или клиновидно-округлой раковиной, а форма, приуроченная к опресненным акваториям, имеет вытянутую раковину. Разин (1934) выделяет три вида, характерные для прибрежных вод Приморья: Ostrea gigas - с вытянутой раковиной, o.laperousi - с треугольно-клиновидной раковиной и O.posijetica - с округлой или ок-рутло-клиновидной раковиной. Согласно Разину (1934) эти три вида отличаются друг от друга отношениями длины (і ) к высоте ( h) и ширины ( S ) к высоте раковины (рис. 4). Для О, gigas средние значения i/h = 0,43, S/h = 0,24, для O.laperousi 0,65 и 0,34 и для O.posjetica 0,50 и 0,37, соответственно. Несколько раньше, Хирасе ( Hirase, 1930), исследовавший О. gigas и O.laperousi обитающих у берегов Японии, включает их в подрод crassostrea, учитывая раздельнополость этих видов в отличие от облигатно гермафродитних представителей рода Ostrea. Вялов (1945) относит O.posjetica к роду Lopha (Osreola) на основании сильного развития у этого вида радиальной скульптуры на верхней створке и отражения ее на внутренней поверхности раковины. Стензаль ( Stenzal, 1971) относит о«gigas к роду Crassostrea принимая во внимание наличие у последней промиальной полости - признака, характерного для "неинкубаторных" родов устриц Crassostrea И Saccostrea В отличие от "инкубаторных", к которым принадлежат роды Ostrea и Lopha. Скарлато (I960) предполагает существование единого, морфологически весьма изменчивого вида Crassostrea gigas в прибрежных водах Приморья, Сахалина и Шных Курилл, объясняя различия в форме раковины различиями в условиях обитания, а именно: характером грунта, положением моллюсков в друзах, шютность поселения и гидрологическим режимом в местах обитания. Ахмед С Ahmed, 1973, 1975) также относит тихоокеанскую устрицу к роду Crassostrea на основании кариологических признаков. В хромосомных наборах тихоокеанской устрицы соотношение субметацентрических и метацентрических хромосома оказалось 5/5, что характерно для рода Crassostrea в отличие отСftreaj -у которых это отношение 6/4. Ахмед ( Ahmed, 1975) указывал, что Crassostrea gigas с тихоокеанского побережья Японии отличаются от c.laperousi из Южной Японии морфологически, темпами роста, температурами нереста. Вместе с тем ймаи и Сакаи Clmai, Sakai, 1961) показали, что эти виды скрещиваются и дают плодовитое потомство. Таким образом, существует широкий спектр мнений относительно таксономического статуса тихоокеанской устрицы, и его уточнению посвящен настоящий раздел работы.
Генетический полиморфизм белков в природных популяциях (обзор литературы)
В попытках охарактеризовать изменчивость в популяциях исторически сложились два направления, выдвигающие две альтернативные гипотезы, которые Добжанский ( Dobzhansky, 1955) назвал "классическая" и "балансовая". "Классическая", наиболее полно изложенная в работе Меллера ( Muller, 1950), утверждает, что любая особь почти в каждом локусе гомозиготна по гену "дикого типа" и лить в незначительном числе локусов (около 0,3$) несет в гетерозиготном состоянии вредные аллели. "Балансовая" гипотеза предполагает, что особи в свободно скрещивающейся популяции большей частью гетерозиготны по всем локусам С Wallace, 1958). Сторонники первой признают основным фактором, влияющим на генетическое состояние популяций, "очищающий отбор", а сторонники второй, кроме очищающего отбора, считают важным действие уравновешивающего или балансирующего отбора, связанного с селективным преимуществом гетерозигот. Следует отметить, что авторы как "классической", так и "балансовой" гипотез имели дело с видимыми (морфологическими) и летальными мутациями, частоты которых в популяциях, как пра-вилов, низки.
По мнению Хабби и Левонтина ( Hubby, Lewontin, 1966), метод, который может дать удовлетворительный ответ на вопрос о степени изменчивости в популяциях, т.е. посредством которого можно оценивать степень гетерозиготности в популяциях, должен отвечать четырем требованиям:
1. Фенотипические различия, вызываемые замещением одного аллеля другим (мутацией), в любом исследуемом локусе, должны быть распознаваемы у отдельных особей.
2. Аллельные замещения в одном локусе должны отличаться по своему проявлению от аллелышх замещений в других локусах.
3. Существенная часть аллелышх замещений (или все замещения) в одном локусе должны отличаться друг от друга.
4. Изучаемые локусы должны представлять случайную выборку из генома независимо от вызываемого ими физиологического эффекта.
Метод зимограмм, по мнению Хабби и Левонтина ( Hubby, Lewontin, 1966), удовлетворяет всем 4-м требованиям, единичные мутации в структурном гене вызывают дискретное изменение белкового фенотипа. Мутации в разных локусах отличаются, т.к. выражаются в изменении разных белков. Физиологический или морфологический эффект таких мутаций может оказаться как угодно мал, т.е. выборка исследуемых локусов случайна в отношении фенотипического проявления. Айала (1981) полагает, что случайная выборка из 20 покусов является достаточной для характеристики средней гетерозиготности в популяциях.
Внутривидовая генетическая дифференциация популяций (обзор литературы)
Реальность существования популяций, внутривидовых группировок, имеющих общий генофонд, существующих в течение многих поколений на определенной части ареала вида, ни у кого не вызывает сомнения (Майр, 1968). Основной чертой характеризующей популяцию является панмиксия. Однако, в больших популяциях (популяционных системах) может иметь место подразделен-ность на более мелкие группировки - локальные популяции - генетический обмен между которыми, в некоторой степени затруднен. Такая иерархическая подразделенноеть популяций обнаружена у некоторых рыб, человека (Алтухов, 1973, 1974; Алтухов, Рычков, 1970, 1971), грызунов ( Selaader, 1970) и многих других видов. В свою очередь локальные популяции могут быть подразделены на элементарные популяции, или демы. Элементарные популяции могут различаться по частотам аллелей, причем, как правило, наиболее распространенный аллель является общим для всех элементарных популяций, а различия наблюдаются по частотам редких аллелей.
Изменчивость аллельных частот может существовать не только между компонентами популяционных систем, но и охватывать весь ареал вида. Собственно географической изменчивостью Майр (1974) называет различия между пространственно разобщенными популяциями, однако географическая изменчивость встречается и у видов со сплошным ареалом. Распределения аллельных частот на сплошном ареале, согласно Аронштаму и др. С1977), может иметь следующий характер.
1. Однородность на ареале, а) Мономорфизм генных локусов. По многочисленным данным ( Harris, 1966; Dessauer, Nevo, 1969; Алтухов, Рычков, 1970; Kogima et alM 1972; Алтухов, 1975; Dessauer, Pough, 1975; Алтухов, Дуброва, 1981) биохимический мономорфизм обнаружен на протяжении всего ареала у многих видов, б) Однородность аллельных частот в полиморфных локусах даже у популяций, не находящихся в контакте ( Harris, 1966; Prakash et al», 1969; Johnson, Selander, 1971; Koehn et al«, 1971).
2. Клинальная изменчивость - постепенное изменение частот аллелей в пространстве. Интересно отметить, что часто градиенты изменений частот аллелей коррелируют с градиентами факторов среды ( Nicol, 1967; Johnson et al., 1969; Koehn, 1969; Schopf, Gooch, 1971; Kojima et al,, 1972; Johnson, 1974; Кирпичников, 1973, 1979).
3. Мозаичность частот аллелей. Мозаичность частот аллелей на ареале часто бывает связана с обитанием в резко отличающихся условиях ( Koehn et al», 1976; Levinton, Koehn, 1976;
Levinton, Lassen, 1978; Colgan, 198I). Существование высокой гетерогенности аллельных частот в разных географических популяциях или их структурных компонентах, позволяет идентифицировать внутривидовые группировки и, в отдельных случаях, установить статус группировки ( Utter et al., 1973).