Введение к работе
Актуальность тег»я. ь-фзншиланян относится к аезажвммкм аии-Есхзслотам, необходим для вувд медицины и пищевой ПрОиДШіеННОСТИі Йатерэс'к этой аминокислоте в последнее время повышел в связи с тем. 470 ь-фенялалашн является оддам из яошюаентов дидегслдннх заменителей сахара: аспартамг (L-a-аспартил-фзншіаланин метиловый ьфкр) v. других.
Микробиологический способ производства виннокисле* дает воз-
моннссть получения биологически активних Іг-изамеров на основе де
шевого к доступного сырья. В известна шкробиологичеажх способах
получения х-фенилалавина Еаиболеэ эффективными продуцента' этой
аминокислота являются Eschericliia ooli а глутаматпродуаяруктдие Ко
рине бактерии. ПродуиентЕ, далученине на основе Baoillas subtilis,
уступают им по уровню продукции. Вместе с тем, в.еиЫШз язляется
традиционно используемым з шшробнологп'їесгсой и пищевой промышлен
ности микроорганизмом, хсроио изучен.с ьшекулярно-бэолсгической,
генетической, биохимической и фагиологичзской точек зрения. В час
тности, тщательно исследован путь биосинтеза ароматических амино
кислот и его основные регуляторные механизмы у этого мзкроорганиз-
ма. На основе бацилл в нашем институте, а также японской фирмой
Ajinomoto со. Inc. получены эффективные Продуцента ДРУГОЙ аромати
ческой аминокислоты - lr-триптофана. Наконец, B.subtilis безопасны с
точки зрения экологических требований, имеют статус CHiS (general
ly regarded as sate), что является необходимым условием для приме
нения бактерий в производстве продуктов, потребляемых человеком.
Все это делает B.subtilis перспективннм объектом для создания эф
фективного продуцента Ігфенилаланина. —
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование - возможности получения эффективнЕХ продуцентов Ь-фзнилаланина на основе B.subtilis. В связи с этим в работе были поставлены следупдие задачи:
-получить на основе штаммов B.sutrtiiis. прсдудируидих ь-триптофан, рекомбЕнантные штамма,' способные к сверхсинтезу Ь-фенилаланЕна;
-использовать метод ступенчатого отбора дія получения мутантов с увеличенным уровней скнтеза І-фзншіаланина;
-изучить регуляторвые нарушения, определившие способность к сверхсинтезу Ь-фенилаланина, среди которых выявить наиболее значимые для продукция;
-получить рекомОинантные шизмидные продуценти
Іг-фенилаланина, используя гибридяш плазмиды^с генами B.Bubtilis, контролирувдяш биосинтез ароматических аминокислот;
-изучить влияние амплификации генов, кодирующих ферменты биосинтеза ароматических аминокислот, на уровень удельной активности-этих ферментов в клетках шіазмидннх продуцентов и на уровень продукции ь-фенилаланкяа, выявить стадии биосинтеза, лимитирующие синтез іг-фенилаланина у штаммов E.subtilis, отобрать плазмидвне продуцента L-фзншаланина, превышающие по уровню продукции бес-шазшдаые анаммн.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у, шташов B.subtilis - продуцентов 1-гриптофана поток общих предшественников ароматических аыинокаплот был переориентирован на синтез ь-фенилаяашва путем введения гена агоЯ, кодирующего высокоактивную Ш, к дефектного гена trpE, блокирующего синтез триптофана. На основе продуцируацих іг-фенилаланин штаммов B.Bubtilis получены рекокбидантвзе штамаы, содержащие плазмида с генами, кодирующими наиболее значимые для биосинтеза L-фенилаланина ферменты: pheA (ЩЦ), агоА-6 СДАГІК - низкоективяая ЗЫ), агої (ШК), агоН (высокоактивная 5УЧ,- Показано, что амплификация генов агоА-с, агої и агоН приводит к увеличении в 2 - 60 раз уровня удельной активности соответствующих, ферментов в клетках шшзмидных продуцентов, не повышая уровень продукции Зг-фенилаланша. Амплификация гена pheA увеличивает (в 4 - 1000 раз) удельную активность Щ! у всех продуцентов і-феншшанина, но уровень продукции возрастает только у низ-коактивннх продуцентов. В клетки продуцирущих фзнилаланин анало-горезиотентЕНХ ыутавтов введены плазмида, содержащие искусственный axoi-G-pheA шерон. У реномбинавтннх штаммов уровень удельной активности ДДМС повысился в 5 - 6 раз, ЕЩТ -,в 400 -1000 раз, при этом уровень продукции М&енилаланина возрос на 20 - БОЯ, а кон-
версия сахара - почти вдвое.
Получены аналогорезистентше кутавты рекомбинавтрнх штаммов B.subtilis, продуцирующие в лабораторных ферментерах ь-фэнилалания в количестве ло 18 г/л,-что значительно превосходит известные из литературы уровни продукции полученных на основе ьгого микроорганизма штаммов. На штаммы 11-27.. І9Б и T2S4 получены авторские свидетельства NN I3802I2 и IS9Su56. Созданы рекомбинаятные штаммы, содержащие плазмиды с искусственным згоА-0-pheA оперонои и проду-цирунцие L-феяилаланин в количестве до 25 г/л. Англогорззистентвыо и шшзмиднпе штаммы положены в основу лабораторных регламентов на производство кристаллического Ь-февшаланша.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материатов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения и выводов. Материал излокен на/d*-? стр. машинописного текста, включает/^ рисунка? я 22 таблиці/. Список цитированной литературы содержит /3d наименования.