Содержание к диссертации
Введение
1. Терминация трансляции и прионы дрожжей (обзор литературы) 9
1.1. Факторы, влияющие на эффективность терминации трансляции у Saccharomyces cerevisiae 10
1.1.1. Факторы терминации трансляции у дрожжей 11
1.1.1.1. Фактор eRF 1 (Sup45) 12
1.1.1.2. Фактор eRF3 (Sup35) 15
1.1.1.3. Другие компоненты аппарата терминации трансляции 17
1.1.1.4. Транскрипционная регуляция экспрессии генов, кодирующих факторы терминации трансляции 20
1.1.1.5. Белки, взаимодействующие с факторами терминации трансляции 20
1.1.2. Факторы, влияющие на нонсенс-супрессию 21
1.1.2.1. Супрессорные тРНК 21
1.1.2.2. Компоненты инициации и элонгации трансляции 24
1.1.2.3. Компоненты рибосомы 27
1.1.2.4. Системы регуляции стабильности мРНК 30
1.2. Связь прионов с терминацией трансляции у дрожжей 36
1.2.1. Прионы дрожжей 36
1.2.1.1. Основные свойства прионов дрожжей 37
1.2.1.2. [PSI+] 42
1.2.1.3. [PIN+]/[RNQl+] 45
1.2.1.4. [URE3] 45
1.2.1.5. Прионные свойства Q/N-богатых транскрипционных факторов 47
1.2.1.6. Прионоподобный детерминант ISP+
1.2.2. Регуляция прионизации у дрожжей 48
1.2.2.1. Система клеточных шаперонов 48
1.2.2.2. Компоненты убиквитин-протеасомного пути деградации
1.2.2.3. Компоненты систем контроля качества укладки белков (РС)С)
1.2.3. Модельные системы для поиска и изучения факторов, влияющих на прионы 52
1.2.3.1. Токсичность прионов [PSI+] и [РШ+] 52
1.2.3.2. Модели токсичности хантингтина/polyQ в дрожжахОшибка! Закладка не опр
1.2.3.3. Тест-система синтетической летальности фактора [PSI+] в комбинации с мутациями sup45 54
1.3. Цель и задачи исследования 55
2. Материалы и методы 56
Среды и методы культивирования ОТ-ПЦРРВ 63
3. Результаты 65
3.1. Скрининг геномной библиотеки, направленный на выявление новых факторов, влияющих на терминацию трансляции 65
3.2. Сверхэкспрессия естественной супрессорной тРНКТгр ослабляет синтетическую летальность 69
3.3. Влияние TEF2 и генов других факторов элонгации трансляции на синтетическую летальность и нонсенс-супрессию 70
3.4. Влияние генов МСМ1, SFP1 и других Q/N-богатых транскрипционных факторов на синтетическую летальность
3.4.1. Влияние гена МСМ1 на синтетическую летальность 73
3.4.2. Влияние Q/N-богатых транскрипционных факторов на синтетическую летальность и нонсенс-супрессию 74
3.4.3. Характеристика Q/N-богатых транскрипционных факторов по их влиянию на жизнеспособность штаммов и супрессию 76
3.4.4. Q/N-богатые транскрипционные факторы могут влиять на экспрессию SUP35 и SUP45 79
3.4.5. SFP1 вызывает токсичность приона [PSI+] и влияет на агрегацию Sup35- 81
3.4.6. Токсичность, вызванная SFP1, компенсируется сверхэкспрессией SUP35C и SIS1, но не SUP45 83
3.4.7. Sfpl формирует SDS-устойчивые агрегаты in vivo, которые могут влиять на [PSF] 86
3.5. Влияние генов HLJ1, CUR1, других шаперонов и ассоциированных с ними факторов на синтетическую летальность 92
3.5.1. Сверхэкспрессия HLJ1, CUR1 и BTN2 усиливает синтетическую летальность 92
3.5.2. CUR1, но не BTN2 усиливает нонсенс-супрессию в штаммах [PSI+], но не [psi ] 93
3.5.3. Curl не влияет на свойства агрегатов [PSI+], на изгнание приона и на его индукцию 96
3.5.4. Делеционный анализ гена CUR1 98
3.5.5. Скрининг основных шаперонов клеток дрожжей в тест-системе синтетической летальности и их влияние на прионы [PSP] и [URE3] 99
3.5.6. Влияние Curl на прионы [PSP] и [URE3] компенсируется коэкспрессией SIS1 103
3.5.7. Избыток Curl усиливает ядерный импорт Sisl, а избыток Sisl его снижаетЮб
3.5.8. Сверхэкспрессия Curl не влияет на связывание шаперонов с агрегатами [PSP] 109
4. Обсуждение результатов 115
4.1. Кодон-специфичное снижение синтетической летальности при сверхэкспрессии гена тРНКТгр 115
4.2. Влияние факторов элонгации трансляции на нонсенс-супрессию и синтетическую летальность 116
4.3. Анализ Q/N-богатых регуляторов транскрипции в тест-системе. 118
4.4. Транскрипционный регулятор SFP1 и прионная токсичность [PSI+] 120
4.5. Действие фактора сортинга Curl на прионы опосредовано ядерным импортом Sisl 126
4.6. Заключение 128
5. Выводы 131
- Транскрипционная регуляция экспрессии генов, кодирующих факторы терминации трансляции
- Среды и методы культивирования ОТ-ПЦРРВ
- Сверхэкспрессия естественной супрессорной тРНКТгр ослабляет синтетическую летальность
- Влияние факторов элонгации трансляции на нонсенс-супрессию и синтетическую летальность
Транскрипционная регуляция экспрессии генов, кодирующих факторы терминации трансляции
В терминации трансляции у эукариот принимают участие два белковых фактора eRF1 и eRF3, которые у дрожжей S. cerevisiae кодируются генами SUP45 и SUP35, соответственно. В отличие от бактериальных клеток, у которых несколько факторов в разной степени способны распознавать различные стоп-кодоны (Scolnick et al., 1968; Ito et al., 2000), у дрожжей, как и у других эукариот, единственный фактор терминации I класса eRF1 отвечает за распознавание всех трёх стоп кодонов (Frolova et al., 1994). eRF3 является ГТФазой и способствует работе eRF1 (Zhouravleva et al., 1995; Frolova et al., 1996). Эукариотические факторы терминации взаимодействуют друг с другом физически и для выполнения своей функции in vivo должны формировать комплекс друг с другом (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al., 1995). Распознавание стоп кодонов у эукариот происходит в соответствии с моделью молекулярной мимикрии, согласно которой комплекс факторов терминации имитирует структуру комплекса аминоацил-тРНК и фактора элонгации eEF1A (Song et al., 2000). 1.1.1.1. Фактор eRF1 (Sup45)
Фактор eRF1 кодируется геном SUP45 у S. cerevisiae. Последовательность этого гена содержит 1311 пар оснований; кодируемый белок состоит из 437 аминокислотных остатков, и имеет молекулярную массу 49 кДа (Breining and Piepersberg 1986). В структуре eRF1 выделяют три домена, обозначаемых как N, M и C (Frolova et al., 2000; Song et al., 2000). В соответствии с моделью молекулярной мимикрии, их положение в пространстве соответствует антикодоновой петле, акцепторному стеблю и Т-петле тРНК, соответственно (Song et al., 2000).
Основная функция N-концевого домена состоит в узнавании стоп-кодона. Предположение о роли N-домена eRF1 в распознавании стоп-кодонов было впервые сделано на основании данных рентгено-структурного анализа eRF1 человека (Song et al., 2000), и почти сразу получило подтверждение благодаря мутационному анализу SUP45 в S. cerevisiae. С помощью различных, как биохимических, так и генетических подходов было установлено, что наиболее важную роль в распознавании стоп-кодонов играют консервативные мотивы NIKS, YxCxxxF и GTS-петля. По структуре, мотив NIKS представляет собой петлю между двумя -спиралями, которая пространственно расположена вблизи района YxCxxxF (Song et al., 2000). Методом перекрёстных сшивок и с помощью анализа терминационного комплекса in vitro было показано, что лизин из мотива NIKS непосредственно участвует в распознавании U в 1-м положении стоп-кодона (Frolova et al., 2002; Chavatte et al., 2002; Bulygin et al., 2010), а мотив YxCxxxF отвечает за распознавание аденозинов и гуанозинов 2-м и 3-м положениях (Kolosov et al., 2005; Cheng et al., 2009; Conard et al., 2012). Кроме того, сравнительный анализ вариантов YxCxxxF из различных организмов с неканоническими генетическими позволил установить, что этот мотив также отвечает за омнипотентную специфичность eRF1 дрожжей или млекопитающих, т.е. за способность распознавать все 3 канонических стоп-кодона (Seit-Nebi et al., 2002; Wong et al., 2012). Также было показано, что остаток треонина из мотива GTS либо непосредственно связывается со стоп-кодоном, либо участвует в его декодировании, причём, как замены в мотиве YxCxxxF, так и присутствие различных стоп-кодонов может приводить к изменению конформации N-домена, и, как следствие, изменению положения GTS относительно стоп-кодона (Cheng et al., 2009; Bulygin et al., 2010, 2011; Wong et al., 2012).
Основные выводы приведённых выше исследований были сделаны на основе расшифровки кристалличестких структур eRF1 или комплекса eRF1 с eRF3 (Song et al., 2000; Cheng et al., 2009), которые, однако, не могли учитывать возможные конформационные изменения eRF1 в составе терминационного комплекса с рибосомой. Хотя предпринимались попытки реконструировать структуру комплекса факторов терминации, рибосомы и мРНК, полученные модели обладали низким разрешением (Taylor et al., 2012; des Georges et al., 2014), и почти не привносили новых данных к известным кристаллическим структурам eRF1 и eRF3, не связанных с рибосомой. Наиболее полно описать механизм распознавания стоп-кодонов стало возможно лишь недавно, после моделирования терминационного комплекса на основе данных криоэлектронной микроскопии с высоким разрешением 3,5 – 3,8A (Brown et al., 2015). Оказалось, что мРНК компактизована таким образом, что в A-сайте оказываются не 3, а 4 нуклеотида, благодаря тому, что 4-й нуклеотид формирует стэкинг-пару с основанием G626 из 18S рРНК. Бльшая стабильность этого взаимодействия между двумя пуринами, чем между G и пиримидинами объясняет повышенную эффективность терминации, когда за стоп кодоном следует пурин, и бльшую встречаемость таких терминирующих тетрануклеотидов у эукариот (Brown et al., 1990; Tate et al., 1995; Bonetti et al., 1995). Подтвердилось предположение о том, что последовательность NIKS связывается с уридином в 1-м положении стоп-кодона (Рис. 2А), а Y и С из мотива YxxCxxxF (Рис. 2Б) и T32 (указан номер а-к из eRF1 Homo sapiens, соответствует T29 в Sup45 S. cerevisiae) из GTS – с пуринами во 2-м и 3-м положении, причём в случае UGA изменение конформации N-домена приводит к неспособности T32 взаимодействовать со стоп-кодоном. Наконец, выяснилось, почему кодон триптофана (UGG) не считывается eRF1 в качестве стоп-кодона: ключевую роль здесь играет остаток E55 (E52 в Sup45), который способен формировать водородную связь только с аденозином во 2-м и/или 3-м положении стоп-кодона
Среды и методы культивирования ОТ-ПЦРРВ
Важную роль в регуляции прионов играют также шапероны семейств Hsp70 и Hsp40. Они, в отличие от Hsp104, взаимодействуют избирательно с различными прионами, и могут быть антагонистами. Так сверхпродукция Ssa1 (белка семейства Hsp70) изгоняет [URE3], но не влияет на [PSI+] (Schwimmer & Masison 2002), а отсутствие этого белка ослабляет [PSI+], но не [URE3]. При этом мутация или делеция в гене SSA2, кодирующем гомолог Ssa1, наоборот, приводит к потере [URE3], не ослабляя [PSI+] (Roberts et al., 2004; Hung & Masison 2006). Другой представитель семейства HSP70, шаперон Ssb1 также влияет на проявление прионов. Было показано, что делеция SSB1 уменьшает эффективность элиминации [PSI+] шапероном Hsp104 (Chernoff et al., 1999), а сверпродукция Ssb1 приводит к элиминации [PSI+] (Chacinska et al., 2001).
Также было обнаружено, что на проявление дрожжевых прионов оказывают влияние шапероны семейства Hsp40. Например, сверхпродукция Ydj1, принадлежащего этому семейству, приводит к постепенной элиминации [URE3] (Moriyama et al., 2000). Кроме того, повышение уровня экспрессии Ydj1, или гомологичного ему Apj1, ослабляет некоторые штаммы [PSI+] (Kryndushkin et al., 2002) и приводит к потере некоторых вариантов [PIN+] (Bradley et al., 2002). Другой белок того же семейства Sis1 является необходимым для поддержания прионного статуса как [PIN+] (Sondheimer et al., 2001), так и [PSI+], и [URE3] (Higurashi et al., 2008). Влияние основных групп шаперонов на поддержание [PSI+] и других прионов суммировано в таблице 2.
Влияние шаперонов и кошаперонов на поддержание прионов (по Liebman & Chernoff, 2012). Шаперон Влияние на [PSI+] Влияние на другие прионы Семейство Белок Избыток Недостаток или отсутствие Избыток Недостаток или отсутствие Hsp100 Hsp104 Излечивает Излечивает Не влияет Излечивает Hsp70 Ssa1-4 Дестабилизирует , препятствует Hsp104 Дестабилизирует Излечивает [URE3] (Ssa1, но не Ssa2) Излечивает [URE3] (Ssa2) Ssb1,2 Дестабилизирует , способствует Hsp104 Защищает от Hsp104 Hsp40 Sis1 Способствует Hsp104 Препятствует поддержанию Излечивает [PIN+], [SWI+], [URE3] Ydj1 Не излечивает Излечивает [URE3] Излечивает [SWI+] Apj1 Компенсирует ydjlA Hsp90 Hsp82 Не влияет Защищает от Hsp104 NEF (70) Sse1 Излечивает Излечивает [URE3] Излечивает [SWI+], [URE3] Fes1 Излечивает Излечивает [URE3] Co-70/90 Sti1 Защищает от Hsp104 Cpr1 Защищает от Hsp104 Hsp104 обозначает изгнание [PSI+] при сверхэкспрессии HSP104; , факторы обмена нуклеотидов (NEF) для Hsp70; , кошапероны, кофакторы для Hsp70 и Hsp90; , не тестировалось;
Недавно было обнаружено влияние факторов сортинга шаперонов Сur1 и Btn2 на свойства прионов [URE3] и [NRP1-C]. Предполагается, что эти факторы участвуют в сортинге шаперонов между компартментами PQC (Рис. 7).
Само присутствие приона [PSI+] может быть токсичным. Описаны варианты [PSI+], приводящие к гибели клетки или значительному снижению ее жизнеспособности, что можно компенсировать добавлением С-домена Sup35 (McGlinchey et al., 2011). Сверхпродукция полноразмерного белка Sup35 (или только его PrD) токсична для штаммов [PSI+], но не оказывает влияния на жизнеспособность штаммов [psi-] (Derkatch et al., 1996). Эту токсичность nтакже можно компенсировать сверхпродукцией С-домена Sup35, либо увеличением содержания белка Sup45 (Derkatch et al., 1998).
Существует две точки зрения на причины возникновения токсичности [PSI+]. Согласно первой, при сверхпродукции Sup35 или его PrD в клетке значительно сокращается количество молекул белка Sup35 в мономерном состоянии, бльшая часть которого переходит в агрегаты. Согласно второй, прионные агрегаты захватывают другие важные для жизнедеятельности белки (см. Liebman & Chernoff, 2012), однако точные причины гибели клеток остаются неизвестны. В пользу первой гипотезы свидетельствует уменьшение количества растворимого белка Sup35 за счет его агрегации в штаммах [PSI+] (Patino et al., 1996; Paushkin et al., 1996). С этим хорошо согласуется ослабление жизнеспособности клеток, у которых снижено количество Sup35C (Valouev et al., 2002), при этом остаётся неясным, какое именно количество белка Sup35 является минимально необходимым для поддержания жизнеспособности. В пользу второй точки зрения говорят недавние исследования, показывающие, что агрегированный Sup35 сохраняет свои функции фактора терминации трансляции, а токсичность [PSI+] не коррелирует с уменьшением количества растворимого Sup35 и зависит от состава и размеров агрегатов Sup35 (Pezza et al., 2014).
Существуют свидетельства того, что токсичность [PSI+] связана с тем, что в агрегаты Sup35 входят другие жизненно важные белки. Первым кандидатом на эту роль является белок Sup45, физически взаимодействующий с Sup35 в ходе терминации трансляции (Zhouravleva et al., 1995). Действительно, увеличение экспрессии SUP45 частично снимает токсичность, вызванную прионом [PSI+] (Derkatch et al., 1998). При этом данные о присутствии Sup45 в прионных агрегатах весьма противоречивы: в ряде исследований получены результаты в пользу этого предположения (Paushkin et al., 1997; Czaplinski et al., 1998; Vishveshwara et al., 2009; Pezza et al., 2014), однако есть работы, свидетельствующие об обратном (Patino et al., 1996; Eaglestone et al., 1999).
Феномен прионной токсичности прионов у дрожжей представляет собой удобную систему для изучения амилоидов и прионов in vivo. Сверхэкспрессия SUP35 токсична как для штаммов [PSI+] (Chernoff et al., 1992), так и для штаммов [psi-][PIN+] (Derkatch et al., 1997), что обусловлено возникновением [PSI+] de novo. Этот факт послужил основой для скрининга, который позволил идентифицировать эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на формирование приона и его токсичность (Tyedmers et al., 2008).
В ряде работ было показано, что фактор [PSI+] приводит к гибели гаплоидных штаммов, несущих некоторые мутации sup35 или sup45 (Liebman and All-Robyn 1984; All-Robyn et al. 1990). Сходный летальный эффект наблюдали при совмещении в гаплоидном штамме мутаций sup35 и sup45 (Инге-Вечтомов и Андрианова., 1970), а впоследствии было показано, что супрессорные мутации sup35 и sup45 не способны сосуществовать в гаплоидных клетках, а иногда и в диплоидных гетерозиготах (Тиходеев, 1990). Вследствие этого несовместимость [PSI+] и мутаций sup35 и sup45, вероятно, связана с нарушениями в терминации трансляции. На основании этого феномена в лаборатории физиологической генетики была разработана тест-система синтетической летальности [PSI+] и мутаций sup45, позволяющая идентифицировать факторы, влияющие как на нонсенс-супрессию, так и на свойства приона [PSI+] (Kiktev et al., 2007).
Сверхэкспрессия естественной супрессорной тРНКТгр ослабляет синтетическую летальность
Чтобы подтвердить это предположение, мы проанализировали в тест-системе мультикопийный вектор YEplac181EF2, который содержит более протяжённый участок 5 -проксимально рамке считывания TEF2 (Valouev et al., 2009). Так как известно, что другие факторы элонгации трансляции также могут влиять на нонсенс-супрессию и на эффективность работы факторов терминации трансляции (Kinzy & Woolford, 1985; Carr-Schmid et al., 1999; Valouev et al., 2009), мы также проверили аналогичные конструкции для сверхэкспрессии TEF3 (CAM1), TEF4 и TEF5 (EFB1). Оказалось, что введение дополнительных копий гена TEF2 действительно усиливает синтетическую летальность (Рис. 14А). Остальные факторы элонгации приводили к едва заметному улучшению роста гибридов. Одновременно, мы проверяли влияние тех же конструкций на нонсенс-супрессию в штамме [PSI+]. Как и ожидалось, TEF2 усиливал супрессию, а остальные факторы элонгации приводили к её заметному снижению (Рис. 14А, правая панель). Таким образом, антисупрессия, вызванная повышенной продукцией некоторых факторов элонгации, слабо детектируется с помощью теста на синтетическую летальность, что необходимо учитывать при дальнейшем использовании теста.
Сконцентрировавшись на изучении TEF2, мы предположили, что его сверхэкспрессия может приводить к усилению нонсенс-супрессии и у штаммов с мутациями sup45. Для проверки данной гипотезы мы сверхэкспрессировали TEF2 в мутантах sup45-113 и sup45-115. Действительно, штаммы с мутантными аллелями sup45 в присутствии TEF2 росли лучше на средах для оценки супрессии (Рис. 14Б). Таким образом, мы показали, что TEF2, по-видимому, является универсальным аллосупрессором, так как он усиливает супрессию как на фоне [PSI+], так и на фоне мутаций sup45. А
Среди генов, обнаруженных в плазмиде YEp13-2084, наиболее вероятным кандидатом на роль гена, сверхэкспрессия которого может усиливать синтетическую летальность, является MCM1. Он кодирует регулятор транскрипции из семейства MADS, который может действовать как активатор или репрессор генов, зависимых от типа спаривания (Elble & Tye, 1991). Белок Mcm1 состоит из 286 аминокислотных остатков, но для выполнения им функции регулятора транскрипции достаточно N-концевого участка (аминокислотные остатки 1–96) (Bruhn et al., 1992), в то время как его С-концевой район обогащен остатками глутамина (Q) и аспарагина (N), что ранее позволило отнести Mcm1 к потенциально прионогенным белкам (Michelitsch & Weissman, 2000). Далее мы проанализировали влияние не только Mcm1, но и других Q/N-богатых регуляторов транскрипции на синтетическую летальность. 3.4.1. Влияние гена МСМ1 на синтетическую летальность
Ген МСМ1 и его С-терминальный Q-богатый домен были встроены в вектор, позволяющий конститутивно экспрессировать ген или его фрагмент на высоком уровне под контролем промотора GPD. При такой сверхэкспрессии МСМ1 мы увидели только очень слабое влияние полноразмерной аллели на синтетическую летальность (Рис. 15А) и наблюдали небольшое снижение жизнеспособности у всех гибридов при сверхпродукции С-домена (MCM1AN) (Рис. 15Б). Однако сверхэкспрессия МСМ1 под контролем индуцибельного промотора CUP1 приводила к явному усилению синтетической летальности (Рис. 15В).
Сверхпродукция генов МСМ1(А) и МСМЫЩЪ) в штаммах 2-ОТ56 \pst], ОТ56 [PSPf и ОТ55 [PSI+]W, которые были трансформированы плазмидами pGPD-MCMl(A) и pGPD-MCMlAN (Б). В. Сверхпродукция МСМ1 под контролем промотора CUP1. Для индукции экспрессии в среду добавлено 150хМ C11SO4. Приведены результаты скрещиваний трансформантов со штаммами серии L-1A-D1628. 3.4.2. Влияние Q/N-богатых транскрипционных факторов на синтетическую летальность и нонсенс-супрессию
Мы проверили, влияет ли сверхэкспрессия генов других Q/N-богатых транскрипционных факторов и РНК-связывающих белков под контролем промотора CUP1 на синтетическую летальность [PSI+] с мутациями sup45. В качестве контроля использовали ген GFP под контролем того же промотора. Мы также проверили влияние генов SWI1 и SCH9, слитых с геном EYFP и сверхэкспрессированных с мультикопийных плазмид под контролем конститутивного промотора GPD. Оказалось, что увеличение экспрессии генов CYC8, PGD1, NRP1, PAB1, PIN3, VTS1 и SCH9, как и GFP, не приводило к нарушению жизнеспособности гибридов (Рис. 16А, обозначены чёрным цветом). Гены ABF1, FKH2, REB1, NAB2 и SWI1 существенно снижали жизнеспособность гибридов (Рис. 16А, обозначены жёлтым цветом), что не позволило определить влияют ли они на синтетическую летальность. Некоторые из факторов, также как MCM1, усиливали синтетическую летальность, наиболее выраженный эффект проявляли гены GLN3, MOT3, MCM1 и SFP1 (Рис. 16A, обозначены зелёным цветом). Исходно мы использовали аллель SFP1-fs636, которая содержит сдвиг рамки считывания в 636м кодоне, который приводит к последующему появлению стоп-кодона и синтезу укороченного белка. Экспрессия аллели SFP1 дикого типа вызывала ещё более выраженное снижение жизнеспособности гибридов (Рис. 16Б), а её более сильная сверхэкспрессия с мультикопийной плазмиды вызывала ухудшение роста даже на фоне немутантного SUP45 (Рис. 16Б). Чтобы убедиться, что частичный эффект сверхэкспрессии SFP1-fs636 не вызван возможной супрессией мутации сдвига рамки считывания в штамме [PSI+], нами в аналогичный вектор была клонирована аллель SFP1С(636), которая не содержит 3 -конца гена после данной мутации. Сверхэкспрессия SFP1С(636) приводила к аналогичным эффектам в тесте на синтетическую летальность, что и SFP1С(636) (Рис. 16В, левая панель), и также приводила к небольшому усилению супрессии в штамме OT56 (Рис. 16В, правая панель).
Влияние факторов элонгации трансляции на нонсенс-супрессию и синтетическую летальность
Для того, чтобы установить, связан ли эффект плазмид YЕp13-1825 и YЕp13-5618 именно с присутствием на них гена HLJ1, нами была сконструирована мультикопийная плазмида, на которой ген экспрессируется под контролем собственного промотора. Присутствие этой плазмиды значительно повышало синтетическую летальность (Рис. 31А). Таким образом, сверхэкспрессия HLJ1 вероятно может влиять на свойства приона [PSI+].
Ранее в работе А.В. Архипенко был показан аналогичный эффект сверхэкспрессии гена CUR1 (Архипенко, 2009), который кодирует фактор сортинга шаперонов, участвующий в транспорте белков-шаперонов между компартментами контроля укладки белков (PQC) IPOD и JUNQ (Malinovska et al., 2012). Мы проанализировали эффекты гомолога CUR1, гена BTN2, который также участвует в релокализации шаперонов. Выяснилось, что подобно CUR1, BTN2 усиливает синтетическую летальность (Рис. 31Б). А . ut M Б sup45 ли/ WT105 107113 115 WT 101 102 104 105 107 113 115 116 WT
Влияние генов HLJ1, CUR1 и BTN2 на синтетическую летальность. А. Результаты скрещиваний трансформантов штаммов ОТ55 и ОТ56 с производными 1A-D1628, несущими указанные аллели SUP45 на плазмидах с маркером URA3 (А) или LEU2 (Б). HLJ1, CUR1 и BTN2 сверхэкспрессированы с плазмид pRS425-HLJ1, pRS426-CUR1 и pAG416GPD-BTN2, соответственно. pRS425 (А), pRS426 и pRS316 (Б) использованы в качестве контрольных векторов.
Поскольку усиление синтетической летальности может свидетельствовать как о влиянии на [PSI+], так и о влиянии на аппарат терминации трансляции, мы проверили влияют ли CUR1 и BTN2 на нонсенс-супрессию в штаммах [psi–]. Сначала мы сверхэкспрессировали CUR1 и BTN2 в производных штамма 1B-D1606, которые несут четыре нонсенс-мутации: ade1-14 (UGA), his7-1 (UAA), lys9-A21 (UAA) и trp1-289 (UAG), а также содержат либо ген SUP45 дикого типа, либо мутации sup45-101, -105, -107, -113 -115. Ни CUR1, ни BTN2 не влияли на нонсенс супрессию у мутантов sup45, в отличие от TEF2, сверхэкспрессия которого усиливала супрессию всех четырёх нонсенс-мутаций (Рис. 32А). Кроме того, мы проверили, влияют ли CUR1 и BTN2 на фенотипическую супрессию в штамме 33G-D373, возникающую в присутствии паромомицина. Мы также не обнаружили различий в росте между штаммами, сверхэкспрессирующими CUR1 или BTN2, и штаммом с контрольной плазмидой (Рис. 32Б). Таким образом, CUR1 и BTN2, по-видимому, влияют не на процесс терминации трансляции, а на свойства приона [PSI+]. SC-Ura-His
Сверхэкспрессия CUR1 и BTN2 не влияет на нонсенс-супрессию в отсутствие [PSI+]. CUR1 или BTN2 были сверхэкспрессированы в штаммах 1B-D1606, несущих аллель SUP45 дикого типа, либо мутации sup45-101, -105, -107, -113 или -115. Представлены репрезентативные серии 10-кратных разведений 1B-D1606 и 113-1B-D1606, трансформированых pRS426-CUR1 (CUR1), pAG416GPD-Btn2 (BTN2), YEplac195EF2 (TEF2) или pRS426 (вектор). Аналогичные результаты были получены на фоне остальных аллелей SUP45. C. Штамм 33G-D373 был трансформирован pAG415GPD-Cur1-EGFP (CUR1), pAG415GPD-Btn2-EGFP (BTN2) или pRS315 (вектор). Одинаковые количества клеток были нанесены на среды с добавлением 0,2 мг/мл паромомицина или без него. 50-кратные разведения показаны только для SC-Leu и YEPD т.к. на других средах для них роста не наблюдалось. Снизу указаны нонсенс-мутации в, маркирующие штаммы.
Чтобы проверить, влияют ли CUR1 и BTN2 на фенотип [PSI+] мы сверхэкспрессировали эти гены в штаммах OT56 и OT55, несущих сильный ([PSI+]S) и слабый ([PSI+]W) варианты приона, соответственно. Оказалось, что сверхэкспрессия CUR1 усиливает супрессию в обоих штаммах, в то время как BTN2 не влиял на неё (Рис. 33А). Экспрессия гена CUR1 индуцируется при тепловом шоке (Malinovska et al., 2012), а значит рост при повышенной температуре может привести к усилению эффектов CUR1. Чтобы проверить это предположение, мы оценили нонсенс-супрессию при росте штамма OT56 при 34 C, и действительно, различия по силе супрессии мутации ade1-14 оказались более значительными при 34 C, чем при 30 C (Рис. 33Б, верхний ряд). Трансформанты мультикопийной плазмидой, несущей CUR1 не сохраняли более сильную супрессию после изгнания плазмиды как из штамма OT56, так и OT55 (Рис. 33Б). Таким образом, именно увеличение экспрессии CUR1 усиливает нонсенс-супрессорный фенотип [PSI+].