Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Муковисцидоз и его роль в нарушении фертильности у мужчин 14
1.11 Муковисцидоз и клинические формы 14
1.12 Нарушения фертильности у мужчин с муковисцидозом 15
1.2 Ген муковисцидоза, кодирующий белок CFTR, и его функции 17
1.3 Роль белка CFTR в развитии и функции органов мужской репродуктивной системы 18
1.3.1 Роль гена CFTR в процессе сперматогенеза 19
1.4 Мутации и полиморфные генетические варианты гена CFTR 21
1.5 Андрологические аспекты муковисцидоза у мужчин 26
1.5.1 Нарушения репродуктивной системы у мужчин с муковисцидозом 26
1.5.2 Гипогонадизм у мужчин смуковисцидозом 27
1.5.3 Решение проблем репродукции у мужчин с муковисцидозом 28
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1 Объекты исследования 31
2.2 Материалы исследования 32
2.3 Методы исследования 33
2.3.1 Клинико-генеалогический метод: анализ родословных, клиническое обследование 33
2.3.2 Инструментальные методы 33
2.3.3 Цитологические методы 34
2.3.4 Биохимический метод: определение уровня гормонов в сыворотке крови, биохимический анализ эякулята 37
2.3.5 Молекулярно-генетические методы 38
2.4 Статистическая обработка полученных результатов 40
Глава 3. Результаты исследования 41
3.1 Результаты клинического обследования 41
3.2 Результаты молекулярно-генетического исследования гена CFTR 43
3.3 Результаты андрологического обследования пациентов с муковисцидозом 47
3.3.1 Ультразвуковое исследование органов мошонки и малого таза 47
3.3.2 Спермиологическое исследование 51
3.3.3 Анализ половых клеток из осадка эякулята 59
3.3.4 Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов (ЭМИС) 64
3.3.5 Анализ фрагментации ДНК в сперматозоидах (TUNEL) 68
3.3.6 Гистологическое исследование тестикулярной ткани 68
3.3.7 Биохимическое исследование семенной жидкости 69
3.3.8 Исследование уровня общего тестостерона 73
3.4 Анализ гено-фенотипических корреляций 73
3.4.1 Сравнительный анализ клинических форм муковисцидоза 73
3.4.2 Сравнительный анализ статуса фертильности в зависимости от сохранности семявыносящих протоков и генотипа 81
3.4.3 Сравнительный анализ фенотипических проявлений в зависимости от генотипа по гену CFTR 87
Глава 4. Обсуждение результатов 89
Заключение 109
Выводы 113
Благодарность 116
Список литературы 117
Приложение 130
Приложение 1.Опросный лист 130
Приложение 2. Стадии полового созревания у здоровых мальчиков по Таннеру 132
Приложение 3. Нормативные значения показателей эякулята согласно критериям ВОЗ 133
Приложение 4. Классификация спермиологических «диагнозов» 134
- Роль гена CFTR в процессе сперматогенеза
- Результаты молекулярно-генетического исследования гена CFTR
- Биохимическое исследование семенной жидкости
- Сравнительный анализ статуса фертильности в зависимости от сохранности семявыносящих протоков и генотипа
Роль гена CFTR в процессе сперматогенеза
Вовлеченность продукта гена CFTR в процесс сперматогенеза предполагает факт увеличения частоты мутации гена у мужчин с бесплодием без признаков обструкции семявыносящих путей (высокая частота мутаций гена CFTR у пациентов с тяжелой патозооспермией), и также тот факт, что белок, кодируемый данным геном, синтезируется в незрелых мужских половых клетках, а также в клетках Сертоли [10, 42, 44, 49-52]. В мужских половых клетках экспрессия гена CFTR наблюдается в постмейотических стадиях (Рис.2) [53].
Авторы предположили, что воздействие ионов хлора на сперматоциты может быть важным для изменений объема клетки в сторону ее уменьшения [54]. Сообщено, что в эякуляте мужчин с тератозооспермией, астено-тератозооспермией, астеноспермией и олигоспермией выявлено снижение экспрессии CFTR, а также о связи качества спермы и уровнем экспрессии CFTR [43]. Также наблюдается увеличение частоты мутации гена CFTR у мужчин с бесплодием (11,1%) с тяжелой патозооспермией [55].
В клетках Сертоли CFTR участвует в активации транскрипции (CFTR/HCO3-зависимая активация FSH/cAMP/PKA/CREB пути), регуляции гематотестикулярного барьера, межклеточных взаимодействий (оптимальное микроокружение для сперматогенеза). Показано, что у мышей, нокаутированных по гену CFTR, наблюдалась низкая экспрессия CREB, маленькие размером яички и олигоспермия [56]. Кроме того, при обследовании биопсийного материала у пациентов с необструктивной азооспермией также выявлено снижение экспрессии CFTR и CREB в клетках Сертоли [56]. При исследовании влияния дисфункции хлорного канала CFTR на цитоскелет клеток Сертоли у мыши выявлено, что хлорный канал CFTR играет важную роль в поддержании нормального цитоскелета клеток Сертоли, сниженная функция и экспрессия белка CFTR могут влиять на функцию клеток Сертоли и, следовательно, сперматогенез яичка [57]. Обсуждается влияние CFTR через HCO3- зависимую регуляцию sAC/cAMP/CREM пути на регуляцию генов, необходимых для сперматогенеза [54].
Ген CFTR участвует в регуляции оплодотворяющей способности сперматозоидов [28, 58]. Белок CFTR вовлечен в секрецию ионов HCO3- в эндометрии и фаллопиевых трубах, что необходимо для активации капацитации сперматозоидов перед оплодотворением. Однако не показано значимого нарушения его функции на успешность оплодотворения в программах ЭКО [59, 60].
Результаты молекулярно-генетического исследования гена CFTR
Молекулярно-генетическое исследование выполнено у 93 пациентов. Патогенные варианты гена CFTR обнаружены в 186 из 186 (100%) проанализированных аллелей. Выявленные патогенные вариантыгена CFTR и их частоты представлены в таблице 3.
«Легкие» патогенные варианты в соответствии с классификации по классам (IV-V) составили48 (25,8%) из 186 патогенных вариантов.
Наиболее частыми патогенными вариантами гена CFTR являлись: F508del, n=88 (47,3%), 3849+10kbC T, n=23 (12,4%), CFTRdele2,3 (21kb), n=11 (5,9%),E92K, n=9 (4,8%),2789+5G A, n=4 (2,2%),L138ins, n=4 (2,2%),N1303K, n=4 (2,2%),W1282X, n=4 (2,2%),1677delTA, n=4 (2,2%),2184insA, n=3 (1,6%),3272-16T A, n=3 (1,6%),2143delT, n=3 (1,6%),другие, n=26 (13,0%).
Спектр генотипов в группе мужчин с МВ и их частоты представлены в таблице 4.
Наиболее частыми генотипами по гену CFTR являлись: F508del/F508del, n=19 (20,4%), F508del/3849+10kbC T, n=14 (15,05%), F508del/2789+5G A, n=4 (4,3%), F508del/CFTRdele2,3, n=4 (4,3%), F508del/E92K, n=3 (3,2%), F508del/L138ins, n=3 (3,2%), F508del/3272-16T A, n=2 (2,15%), F508del/W1282X, n=2 (2,15%), другие , n=42 (46,0%). В обследуемой выборке 47 (50,5%) из 93 генотипов являлись «легкими». Следует отметить, что наличие «легкой» мутации в гене CFTRне всегда строго соответствует легочной форме заболевания. Так, у пациента с генотипом 1677delTA/E92K в возрасте 30 лет диагностирована недостаточность поджелудочной железы, панкреатическая эластаза составляла 200мкг/г и легочная форма МВ перешла в смешанную форму МВ. Строго говоря, мутацию E92K нельзя отнести к «легким» патогенным вариантам гена CFTR, поскольку она может быть с варьирующими клиническими последствиями.
Особенностью спектра патогенных вариантов и генотипов по гену CFTR у российских мужчин с МВ являются высокая частота «легких» патогенных вариантов (n=25,8%) и генотипов (n=50,5%), а также высокая частота патогенного генетического варианта 3849+10kbС T – 12,4%, встречающийся в 24,7% в компаунд-гетерозиготном состоянии [111].
Биохимическое исследование семенной жидкости
Биохимическое исследование семенной жидкости выполнено для показателей фруктозы у 33 пациентов, нейтральной -гликозидазы и лимонной кислоты - у 22 пациентов с МВ. У остальных пациентов биохимическое исследование не проведено вследствие недоступности биологического материала или малого объема эякулята.
У 32 обследованных пациентов спермиологический диагноз – азооспермия, у 1 – астенозооспермия. Биохимическое исследование семенной жидкости выполнено у 29 пациентов из группы контроля (табл.12).
Среднее значение уровня нейтральной -гликозидазы (биохимический маркер, отражающий экскреторную функцию придатков яичек) у пациентов с МВ составило 18,3±28,4 мМЕ, в группе контроля не измерялось (табл. 12). Среднее значение уровня лимонной кислоты (биохимический маркер, отражающий экскреторную функция предстательной железы) в эякуляте составило 11,3±10,4 мг у пациентов с МВ, и 13,53±5,3 мг в группе контроля.
Среднее значение уровня фруктозы (биохимический маркер, отражающий функцию семенных пузырьков) в эякуляте составило 0,48±0,82 мг у пациентов с МВ, и 9,8±4,99мг в группе контроля (табл. 12). При этом выявлено значимое снижение уровня фруктозы у пациентов с МВ по сравнению с контрольной группой (p 0,0001, согласно U-критерию Манна-Уитни). Сниженное количество фруктозы обнаружено в 32 из 33(97,0%) исследованных образцах семенной жидкости, при этом в 31 образце отмечена олигозооспермия (рис.16).
Горизонтальной красной пунктирной линией обозначена нижняя граница нормы количества фруктозы в семенной жидкости (норма 2,4 мг). Вертикальной красной пунктирной линией обозначена нижняя граница нормы объема эякулята (1,5 мл). Розовым сектором указаны образцы с олигоспермией. Область, обведенная оранжевой линией, включает образцы со сниженным объемом и сниженным количеством фруктозы В 27 (81,8%) образцах семенной жидкости количество фруктозы составиломенее 0,5 мг/эякуляте, при этом у 26 из них объем эякулята составлял 1,2 мл и менее, что свидетельствует о выраженном угнетении секреции семенных пузырькову большинства (78,8%) пациентов с МВ. Нормальное общее количество нейтральной -глюкозидазы (более 20 мМЕ) отмечено в 6 из 22 (27,3%) исследованных образцах семенной жидкости. Снижение ее содержанияв эякуляте наблюдали в 16 из 22 (72,7%) образцах. Среди 6 пациентов, у которых уровень нейтральной -глюкозидазы находился в пределах референсных значений, у трехмужчин зарегистрирован нормальный объем эякулята, у трех мужчинон был снижен. Во всех образцах, в которых обнаружено нормальное количество -гликозидазы в семенной жидкости, объем эякулята составил не менее 1 мл. Во всех образцах с нормальным объемом эякулята (3) также выявлено нормальное количество нейтральной -глюкозидазы (рис.17).
Горизонтальной красной пунктирной линией обозначена нижняя граница нормы количества -гликозидазы в семенной жидкости (20 мМЕ). Вертикальной красной пунктирной линией обозначена нижняя граница нормы объема эякулята (1,5 мл). Розовым вертикальным сектором указаны образцы с олигоспермией. Область, обведенная оранжевой линией– образцы со сниженным объемом и сниженным количеством -гликозидазы, область, обведенная зеленой линией – образцы со сниженным объемом эякулята и нормальным количеством -гликозидазы
Анализ распределения количества нейтральной -гликозидазы в семенной жидкости в зависимости от объема семенной жидкости позволил выявить среди образцов с олигоспермией – образцы со сниженным объемом (n=16) и нормальным (n=3) количеством -гликозидазы (Рис. 17). У трех пациентов с ее нормальным количеством объем эякулята составил более 1,5 мл, т.е. отсутствовала олигоспермия, таким образом, секреторная функция семенных пузырьков у них была сохранена. Это свидетельствует о гетерогенности в степени нарушения/сохранности экскреторной функции придатка яичка и семенных пузырьков у пациентов с МВ.
Снижение количества лимонной кислоты (биохимический маркер секреторной функции предстательной железы и эндокринной функции яичек) выявлено в 12 из 22 (54,5%) проанализированных образцов эякулята (рис. 18), среди них 6 пациентовимели легочную форму МВ и 6 пациентов – смешанную форму МВ [110,115].
Горизонтальной красной пунктирной линией обозначена нижняя граница нормы количества лимонной кислоты в семенной жидкости (10 мг). Вертикальной красной пунктирной линией обозначено нижняя граница нормы объема эякулята (1,5 мл). Розовым вертикальным сектором указаны образцы с олигоспермией. Область, обведенная оранжевой линией – образцы со сниженным объемом и сниженным количеством лимонной кислоты, область, обведенная зеленой линией – образцы со сниженным объемом эякулята и нормальным лимонной кислоты
Таким образом, у большинства мужчин с МВ выявлено снижение исследованных биохимических показателей семенной жидкости (фруктозы, нейтральной альфа-гликозидазы и лимонной кислоты – 97%, 73% и 54,5% образцах, соответственно), что указывает на аплазию или выраженную гипоплазию семенных пузырьков, непроходимость семявыносящих протокови нарушение секреции предстательной железы, соответственно.
Сравнительный анализ статуса фертильности в зависимости от сохранности семявыносящих протоков и генотипа
Обследованная выборка в зависимости от сохранности семявыносящих протоков – СП (по результатам спермиологического исследования) и статуса фертильности (по анамнестическим данным – наличие ребенка) разделена на группу без обструкции СП, n=18 (19,8%) и группу с обструкцией СП, n=73 (80,2%).
Сравнительная характеристика пациентов выявила значимое различие между данными группами по частоте мутации 3849+10kbC T между мужчинами с обструкцией СП (8,2%, т.е. у 6 человек из 73) и мужчинами без обструкции СП (94,4%) (p 0,00001, согласно точному критерию Фишера) (рис. 21), по частоте генотипов F508del/3849+10kbC T (n=2 с обструкцией СП и n=12 без обструкции СП, p 0,05) и F508del/F508del (n=19 и n=0, p 0,05), форме МВ (смешанная, n=28 и легочная, n=18, p 0,001) и показателю хлоридов пота (112,3±32,5 и 86,9±25,3, p=0,004, согласно U-критерию Манна-Уитни) (таблица 17).
Таким образом, наличие патогенного варианта 3849+10kbС T, генотипа F508del/3849+10kbC T является генетическим фактором сохранения проходимости семявыносящих протоков (p 0,00001 и p 0,001, соответственно); для генотипа F508del/F508del характерно нарушение проходимости семявыносящих протоков (p 0,01) [111].
В обследованной выборке 23 пациента являлись носителем мутации 3849+10kbС T, характерной для легочной формы МВ. У восьми мужчин с мутацией 3849+10kbС T у супруги анамнестически отмечено наступление беременности естественным путем, семь из которых закончились родами, а одна – прервана медицинским абортом по желанию. Из них у 6 мужчин, у которых отмечено наступление беременности у супруги, в том числе повторное и рождение детей, спермиологическое обследование не было проведено из-за недоступности биологического материала. Среди остальных 17 пациентов диагностированы: азооспермия/криптозооспермия (n=6), мягкие формы патозооспермии (n=10) или нормозооспермия (n=1). Данная мутация обнаружена среди 9,5% пациентов с обструкцией семявыносящих путей и у 94% пациентов без обструкции.
Выявлено значимое различие (p 0,00001, согласно критерию Фишера) по частоте мутации 3849+10kbC T между мужчинами с обструкцией СП (8,2%) и мужчинами без обструкции СП (94,4%) (Рис. 22) [111].
У 17 из 18 (94,4%) мужчин с сохраненной фертильностью/без обструкции семявыносящих протоков выявлен генотип с мутацией 3849+10kbC T в компаунд-гетерозиготном состояниис другой мутацией гена CFTR, у одного пациента – генотип F508del/4382delA, имеющего ребенка от беременности, наступившей естественным путем. Однако следует отметить, что анализ ДНК на отцовство у данных пациентов не проводился.
Проведен сравнительный анализ результатов обследования пациентов с мутацией 3849+10kbC T с сохраненной и нарушенной проходимостью семявыносящих путей (табл. 18). Данные группы существенно не отличались по таким показателям как средний возраст, возраст постановки диагноза, CFTR генотип, ИМТ, средний общий объем яичек, уровень тестостерона. Отмечены различия между группами пациентов по структуре спермиологических изменений, в частности форм патозооспермии и рН эякулята. Пациенты с сохранной проходимостью семявыносящих путей не имели азооспермию/криптозооспермию, имели нормальный pH (p=0,04, согласно U-критерию Манна-Уитни).
У компаунд-гетерозигот по патогенному варианту 3849+10kbC T с обструкцией СП показатель хлоридов пота значимо выше (p 0,01, согласно U-критерию Манна-Уитни) по сравнению с мужчинами с МВ без обструкции СП (122,6±43,1 ммоль/л и 81,9±17,3 ммоль/л, соответственно) (таблица 18). Потовый тест отражает функциональную активность белка CFTR, и значимые его различия в группах, не отличающихся по CFTR генотипу, указывают на внутригенные и межгенные взаимодействия. Требуется дальнейшее изучение возможных факторов, влияющих на обструкцию СП при МВ. Проведен сравнительный анализ результатов обследования пациентов на IVS8-Тn-полиморфизм (13 пациентов) с мутацией 3849+10kbC T с сохраненной и нарушенной проходимостью семявыносящих путей (табл.19).
По результатам анализа IVS8n полиморфизма у пациентов с патогенным вариантом 3849+10kbC T выявлено: как у пациентов с обструкцией, так и без обструкции семявыносящих путей, не встречается 5Т-аллель, характерный для аплазии vas deferens при синдроме CBAVD.