Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Стабильность генома и роль различных факторов в ее поддержании 17
1.1.1. Вклад генетических факторов в частоту хромосомных нарушений 19
1.1.2. Влияние эпигенетических механизмов на эффективность репарации ДНК 23
1.2. Роль ретротранспозона LINE-1 в онтогенезе и обеспечении стабильности генома 29
1.2.1. Молекулярная структура LINE-1 32
1.2.2. Роль ретротранспозона LINE-1 в онтогенезе 33
1.2.3. Ретротранспозон LINE-1 и хромосомные нарушения 42
1.3. Фокусы H2AX и их влияние на хромосомную стабильность 47
1.3.1. Типы фокусов H2AX и их формирование 47
1.3.2. Функциональная значимость фокусов H2AX в онтогенезе 55
1.3.3. Фокусы H2AX и хромосомные нарушения 65
2. Материалы и методы 71
2.1. Схема исследования 71
2.2. Материалы 76
2.2.1. Экстраэмбриональные ткани спонтанных и медицинских абортусов 76
2.2.2. Лимфоциты взрослых индивидов 78
2.2.3. Опухолевые линии 81
2.3. Анализ индекса метилирования LINE-1 81
2.4. Стандартный цитогенетический анализ хромосомных аберраций 83
2.5. Оценка уровня сестринских хроматидных обменов 84
2.6. Микроядерный тест и флуоресцентная in situ гибридизация 85
2.7. Анализ фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК 89
2.8. Воздействие ионизирующим излучением in vitro 91
2.9. Методика анализа экспрессионных профилей генов в лимфоцитах индивидов с различным уровнем фокусов белков репарации ДНК 92
2.10. Методика работы с опухолевыми клеточными линиями 93
2.11. Методика работы с нокаутными клеточными линиями 94
2.12. Статистический анализ данных 103
3. Результаты и обсуждение 104
3.1. Влияние индекса метилирования LINE-1 на частоту хромосомных нарушений 104
3.1.1. Нарушения глобального уровня метилирования генома в экстраэмбриональных тканях у спонтанно погибших эмбрионов человека 104
3.1.2. Числовые хромосомные нарушения в клетках эмбрионов человека с различным глобальным уровнем метилирования генома 112
3.1.3. Связь глобального уровня метилирования генома и частоты хромосомных нарушений в соматических клетках взрослых индивидов 118
3.1.4. Механизмы связи глобального уровня метилирования генома и частоты хромосомных нарушений в соматических клетках человека в ходе онтогенеза 132
3.2. Спонтанный уровень фокусов H2AX и хромосомные нарушения 140
3.2.1. Уровень фокусов белков репарации и радиочувствительность опухолевых клеток 140
3.2.2. Уровень фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК и частота хромосомных нарушений в лимфоцитах человека при лучевой терапии in vivo 146
3.2.3. Уровень фокусов H2AX и хромосомные нарушения в соматических клетках in vitro 158
3.2.4. Связь уровня фокусов H2AX с экспрессией генов в нормальных соматических клетках человека 170
3.2.5. Анализ влияния нокаута генов ADAMTS1, THBS1, WHSC1 и RBFOX2 на клеточную радиочувствительность 208
3.2.4 Механизмы связи уровня фокусов H2AX и спонтанных и радиационно-индуцированных хромосомных нарушений в соматических клетках человека 219
Заключение 234
Выводы 240
- Влияние эпигенетических механизмов на эффективность репарации ДНК
- Микроядерный тест и флуоресцентная in situ гибридизация
- Нарушения глобального уровня метилирования генома в экстраэмбриональных тканях у спонтанно погибших эмбрионов человека
- Связь уровня фокусов H2AX с экспрессией генов в нормальных соматических клетках человека
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Стабильность генома является неотъемлемым свойством всех живых организмов (Jeggo P.A. et al., 2016). Ее качественной составляющей является последовательность генов, за сохранение которой отвечает система репарации ДНК (Лаврик О.И. и др., 2016). Однако не меньшую роль играют количественный и структурный аспект, отражающие копийность генов и их расположение на хромосомах, вследствие чего определяющую роль в выживании организма играет постоянство кариотипа (Liang G., Chen H., 2015). Геномная стабильность на уровне кариотипа в значительной степени также поддерживается за счет систем репарации ДНК (Лаврик О.И. и др., 2016). Необходимость сохранения кариотипа наиболее хорошо иллюстрируется фатальными последствиями хромосомных нарушений на уровне целого организма. Так, у человека анеуплоидия по подавляющему большинству хромосом приводит к гибели эмбрионов на ранних стадиях развития, а числовые нарушения по оставшимся хромосомам связаны со значительным снижением жизнеспособности (Никитина Т.В., Лебедев И.Н., 2014). То же касается и крупных структурных хромосомных нарушений (Voet T. et al., 2011).
Нормальный хромосомный состав наиболее критичен именно для эмбрионального этапа развития в силу важности и сложности протекающих процессов дифференцировки, роста и развития организма (Кузнецова Т.В., Баранов В.С., 2007). Тем не менее, развитие многоклеточности привело к снижению давления отбора по стабильности генома отдельных соматических клеток за счет исключения передачи их генов следующему поколению, специализации их функций и компенсации негативных эффектов хромосомных нарушений за счет соседних клеток с нормальным генотипом. В результате во взрослом организме происходит постоянное накопление хромосомных нарушений разного размера. Наиболее крупной и распространенной аномалией кариотипа в соматических клетках человека является анеуплоидия, которая в условиях in vitro возникает в 1% диплоидных клеток в каждом митотическом делении (Thompson S.L., Compton D.A., 2008). Частота анеуплоидных клеток in vivo варьирует в различных тканях, являясь максимальной в мозге и печени (Yurov Y.B. et al., 2007; Duncan A.W. et al., 2012). Кроме того, в клетках возникают структурные повреждения ДНК, при неправильной репарации или ее отсутствии приводящие к образованию хромосомных аберраций. Известно, что частота клеток, несущих многие из этих хромосомных повреждений, повышается с возрастом (Fenech M., Bonassi S., 2011; Rube C.E. et al., 2011) или вследствие различных мутагенных воздействий (Druzhinin V.G. et al., 2015; 2016). В результате в определенный момент онтогенеза организм представляет собой «лоскутное одеяло» из множества клеток, несущих различные отклонения от нормального кариотипа, характерного для зародышевой линии.
Накопление подобных нарушений неизбежно и связано с развитием различных возраст-зависимых патологий, таких как сердечно-сосудистые и неврологические заболевания (Andreassi M.G., 2008; Coppede F., Migliore L., 2010; Krestinina L.Y. et al., 2013). Кроме того, главным следствием постоянно накапливающихся хромосомных повреждений в клетках является канцерогенез (Имянитов Е.Н., 2010; Jeggo P. et al., 2016). Возникновение хромосомных нарушений и сохранение несущих их клеток в ходе онтогенеза во многом лежит в основе старения. Однако темп этих процессов может значительно различаться между индивидами, приводя к формулировке понятия «биологический возраст», который может отличаться от календарного как в одну, так и в другую сторону (Москалев А.А. и др., 2016). Неблагоприятные факторы внешней среды, включая воздействие ионизирующего излучения, играют важную роль в повышении частоты хромосомных нарушений (Vozilova A.V. et al., 2013). Однако эндогенные факторы, влияющие на скорость возникновения и накопления хромосомных нарушений в клетках организма, остаются во многом неясными.
Достаточно давно стало понятным, что в нарушении стабильности генома могут играть важную роль генетические факторы. Это подтверждается существованием ряда синдромов, обусловленных мутациями в генах репарации ДНК и характеризующимися повышенной хромосомной нестабильностью. Кроме того, по-видимому, на частоту хромосомных нарушений в соматических клетках человека могут влиять и полиморфные варианты в генах антиоксидантной защиты, репарации ДНК, апоптоза и метаболизма ксенобиотиков. Однако различная чувствительность к мутагенному воздействию клеток в организме на различных стадиях онтогенеза на фоне одинакового генотипа по определенному набору полиморфных вариантов поднимает вопрос о наличии эпигенетических факторов, влияющих на стабильность генома.
Одним из таких факторов может являться глобальный уровень метилирования генома, снижение которого в онтогенезе часто сопровождается повышением частоты хромосомных нарушений. Наиболее распространенным в геноме человека (около 17 % генома) является семейство ретротранспозонов LINE-1 (long interspersed nuclear element 1) (Ostertag E.M., Kazazian H.H., 2001). Известно, что снижение глобального уровня метилирования ДНК, как это происходит, например, при синдроме ICF, приводит к синтезу большого количества транскриптов ретротранспозонов, ретротранспозиции и встраиванию их в новые сайты в геноме. Возможной причиной влияния снижения глобального уровня метилирования генома на частоту анеуплоидии может быть гипометилирование цитозина в центромерных и прицентромерных повторяющихся последовательностях хромосом (Schueler M.G., Sullivan B.A., 2006; Pironon N. et al., 2010; Fenech M. et al., 2011), приводящее к нарушению целостности кинетохора и возникновению ошибок прикрепления микротрубочек к хромосомам и неправильной работе контрольной точки сборки веретена деления (Gieni R.S. et al., 2008; Heit R. et al., 2009). Кроме того,
активация ретротранспозонов в результате гипометилирования их промоторов может индуцировать накопление двунитевых разрывов ДНК и повышенный уровень инсерционного мутагенеза. Влияние резкого снижения глобального уровня метилирования прослеживается и при воздействии 5-азацитидином (ингибитором ДНК-метилтрансферазы), которое приводит к хромосомной нестабильности (Guttenbach M., Schmid M., 1994; Gieni R.S. et al., 2008).
Помимо уровня метилирования генома, наиболее изученным эпигенетическим феноменом, связанным с поддержанием стабильности генома, является фосфорилирование гистона H2AX (H2AX), приводящее к формированию фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК. Эти структуры представляют собой собранные комплексы, состоящие из собственно белков репарации двунитевых разрывов ДНК и сигнальных медиаторов, участвующих в активации компонентов контрольных точек клеточного цикла. Поэтому, клетки, содержащие фокусы H2AX, имеют измененный эпигенетический фон, потенциально влияющий на функционирование белков репарации ДНК и экспрессию кодирующих их генов. Вследствие этого клетки могут эффективнее реагировать на воздействие мутагенов за счет уже активированной системы ответа на повреждение ДНК. В свою очередь, повышенная активность систем репарации ДНК и контрольных точек клеточного цикла может приводить к снижению спонтанной и индуцированной мутагенами частоты хромосомных нарушений. Однако возможность такого ответа и его механизмы остаются неясными. Это обусловливает необходимость анализа особенностей спонтанного и индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека с различным спонтанным уровнем фокусов H2AX, а также выявления дифференциально-экспрессирующихся генов, определяющих влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на эффективность репарации ДНК.
Степень разработанности темы исследования. Многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов указывают на то, что обеспечение стабильности генома в клетках зависит от генетических причин, таких как вариации на уровне последовательности ДНК или экспрессии генов репарации ДНК, метаболизма ксенобиотиков, антиоксидантной защиты (Aka P. et al., 2004; Angelini S. et al., 2005; Kirsch-Volders M. et al., 2006; Фрейдин М.Б. и др., 2007; Iarmarcovai G. et al., 2008; Cho Y.H. et al., 2009; Сальникова Л.Е. и др., 2009; Andreassen C.N., 2010; Иванова Т.И. и др., 2010; Васильева З. и др., 2012; Larionov A.V. et al., 2016; Minina V.I. et al., 2017). Однако известные полиморфные варианты могут объяснить лишь небольшую часть наследуемости количественных признаков, что приводит к возникновению феномена «потерянной наследуемости» (Manolio T.A. et al., 2009). Причинами такой «недостающей наследуемости» могут быть как вариации в до сих пор недостаточно исследованных регуляторных областях генома, так и эпигенетические механизмы реализации генетической информации в фенотипе (Trerotola M. et al., 2015). В связи с этим, все больше исследований направлено на выявление механизмов регуляции экспрессии
генов и характеристику эпигенетических механизмов патогенеза многих заболеваний с наследственной компонентой. Появляется все больше данных о роли эпигенетики в развитии различных патологий у человека, включая проблемы репродукции (Baranov V.S. et al., 2015; Саженова Е.А. и др., 2017), онкологические (Залетаев Д.В. и др., 2004; Narayanan S.P. et al., 2017), сердечно-сосудистые (Nazarenko M.S. et al., 2015; Khyzha N. et al., 2017) и неврологические заболевания (Younus I., Reddy D.S., 2017). Тем не менее, недостаточно изученной остается область влияния эпигенетического фона на поддержание базовых механизмов обеспечения стабильности генома, играющих важную роль в патогенезе многих заболеваний.
Цель исследования
Выявить связь эпигенетической организации генома со спонтанным и индуцированным уровнем хромосомных нарушений в соматических клетках человека.
Задачи исследования
-
Оценить связь уровня метилирования ретротранспозона LINE-1 с частотой хромосомных нарушений в экстраэмбриональных клетках эмбрионов человека и лимфоцитах на постнатальном этапе онтогенеза.
-
Охарактеризовать связь между спонтанным уровнем фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК и частотой хромосомных нарушений в клетках человека на различных стадиях онтогенеза при воздействии ионизирующего излучения в условиях in vitro.
-
Определить динамику уровня фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК и хромосомных нарушений в лимфоцитах человека после воздействия ионизирующего излучения в условиях in vivo в ходе лучевой терапии злокачественных новообразований.
-
Выявить дифференциально-экспрессирующиеся гены в лимфоцитах индивидов, различающихся по эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК, и оценить их связь с репарацией ДНК в других типах клеток.
-
Экспериментально проверить участие выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в обеспечении выживаемости клеток, репарации ДНК и эпигенетической регуляции экспрессии генов в нокаутных опухолевых клеточных линиях, полученных с использованием системы редактирования генома CRISPR/Cas9. Новизна исследования, уровень новизны. В исследовании впервые
обнаружены эффекты ряда эпигенетических модификаций хроматина (индекса метилирования ретротранспозона LINE-1 и уровня фокусов фосфорилированного гистона H2AX) на возникновение спонтанных и индуцированных хромосомных нарушений в клетках человека на различных этапах онтогенеза. Впервые обнаружено гипометилирование ретротранспозона LINE-1 в хорионе и экстраэмбриональной мезодерме 79 % и 60 % спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, соответственно, что может являться отражением патологических процессов, приводящих к
эмбриональной гибели. Кроме того, в ворсинах хориона спонтанных абортусов с нормальным кариотипом выявлена повышенная спонтанная частота анеуплоидии по хромосомам 8 и X, которая при этом отрицательно коррелирует с индексом метилирования ретротранспозона LINE-1. В лимфоцитах взрослых индивидов выявлена отрицательная корреляция индекса метилирования LINE-1 со спонтанной частотой микроядер. При хроническом воздействии ионизирующего излучения регистрируется отрицательная корреляция индекса метилирования LINE-1 с частотой индуцированных аберраций хроматидного типа и сестринских хроматидных обменов.
Впервые выявлено влияние спонтанного уровня фокусов H2AX на частоту хромосомных нарушений в соматических клетках человека. Была выявлена отрицательная корреляция спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах больных злокачественными новообразованиями до нейтронной терапии с частотой аберраций хромосомного типа после окончания терапии. Данный эффект подтверждался в лимфоцитах здоровых индивидов в условиях in vitro: наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляция спонтанного уровня фокусов H2AX с частотой центромеро-негативных микроядер после воздействия радиации в дозе 2 Гр in vitro в лимфоцитах здоровых индивидов.
Впервые были выявлены дифференциально-экспрессирующиеся гены, связанные со спонтанным уровнем фокусов H2AX в соматических клетках человека. Эксперимент по оценке экспрессии некоторых из выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы медицинских абортусов позволил обнаружить статистически значимую отрицательную корреляцию экспрессии генов ADAMTS1, WHSC1 и RBFOX2 со спонтанным уровнем фокусов H2AX, и экспрессии генов ADAMTS1 и WHSC1 с частотой радиационно-индуцированных микроядер после воздействия гамма-излучением.
Впервые созданы клеточные линии HeLa с нокаутом генов ADAMTS1, THBS1, RBFOX2 и WHSC1. Обнаружено, что исследуемые гены связаны сетью взаимной транскрипционной регуляции. Были впервые обнаружены эффекты нокаута генов ADAMTS1, THBS1, RBFOX2 и WHSC1 на выживаемость необлученных и облученных клеток. Выявлено, что нокаут генов WHSC1 и THBS1 приводит к снижению, а нокаут гена RBFOX2 – к повышению эффективности посева необлученных клеток линии HeLa. После воздействия ионизирующего излучения нокаут генов WHSC1, ADAMTS1 и RBFOX2 приводит к снижению клональной выживаемости опухолевой клеточной линии HeLa. Обнаружено влияние нокаута гена WHSC1 на повышение спонтанного уровня фокусов H2AX и 53BP1.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют имеющиеся теоретические представления о механизмах поддержания целостности и стабильности хромосомного аппарата соматических клеток человека. Получены новые данные о влиянии эпигенетических модификаций хроматина в соматических клетках человека на спонтанную и радиационно-индуцированную частоту хромосомных
нарушений. Это указывает на необходимость учета межиндивидуальной вариабельности по эпигенетическим маркерам при проведении различных процедур, связанных с воздействием мутагенных факторов на человека.
Выявление генов, ответственных за формирование индивидуального ответа соматических клеток человека на воздействие радиации, открывает широкие возможности для характеристики механизмов их регуляции и влияния на экспрессию множества других генов. Созданные нокаутные клеточные линии по отдельным генам с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 позволяют перейти к выявлению причинно-следственных связей между нарушением экспрессии отдельных генов и изменением выживаемости клеток и эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК. Проведенный анализ экспрессии регуляции транскрипции в различных соматических клетках человека и созданных нокаутных линиях дает возможность построить сети регуляции экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах контроля стабильности генома. В целом, полученные результаты расширяют понимание механизмов, задействованных в формировании хромосомных нарушений в клетках человека.
Методология и методы исследования. Методологической и теоретической основой исследования послужили труды отечественных и зарубежных ученых в области влияния эпигенетических факторов на стабильность генома. В работе выдвинуты две основные гипотезы, предполагающие связь эпигенетических модификаций хроматина с частотой спонтанных и индуцированных мутагенами хромосомных нарушений: 1) гипометилирование LINE-1 связано с повышением частоты хромосомных аберраций; 2) повышенный спонтанный уровень фокусов H2AX в клетках активирует систему ответа на повреждения ДНК.
В работе использован комплекс современных цитогенетических, молекулярно-генетических, иммуногистохимических, биоинформационных и статистических методов. В частности, применены различные методы анализа стабильности генома, включая оценку частоты хромосомных аберраций, микроядер, сестринских хроматидных обменов, уровня и динамики фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК. Использовались современные методы полнотранскриптомного анализа экспрессии генов с помощью экспрессионных микрочипов, результаты которого подтверждались с помощью ПЦР в реальном времени как в тех же образцах, так и в клетках других типов. Проведен блок работ в модельных системах в условиях in vitro. Для этого с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 созданы нокаутные опухолевые клеточные линии, в которых проведена валидация участия выявленных дифференциально-экспрессирующихся генов в обеспечении стабильности генома. В работе использованы различные методы секвенирования генома, включая пиросеквенирование для оценки индекса метилирования ретротранспозона LINE-1 и массовое параллельное секвенирование для анализа последовательности мутаций, полученных с помощью технологии CRISPR/Cas9.
Положения, выносимые на защиту
-
Гипометилирование генома связано с повышенной спонтанной частотой анеуплоидных клеток в экстраэмбриональных тканях внутриутробно погибших эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором и с частотой микроядер в лимфоцитах на постнатальных этапах онтогенеза.
-
Снижение уровня глобального метилирования генома в лимфоцитах ассоциировано с повышением числа двунитевых разрывов ДНК в S- и G2-фазах клеточного цикла, репарируемых гомологичной рекомбинацией.
-
Уровень и динамика фокусов белка 53BP1 в ходе репарации двунитевых разрывов ДНК связаны с выживаемостью опухолевых клеточных линий, а спонтанный уровень фокусов гистона H2AX обратно пропорционален частоте хромосомных нарушений после воздействия радиации в лимфоцитах периферической крови, но не в фибробластах экстраэмбриональной мезодермы.
-
Гены ADAMTS1, RBFOX2, WHSC1 и THBS1, экспрессия которых зависит от спонтанного уровня фокусов H2AX в различных типах соматических клеток человека, связаны взаимной транскрипционной регуляцией и влияют на выживаемость клеток. Степень достоверности результатов. Достоверность полученных данных
обеспечивается репрезентативным объемом выборок, использованием высокоразрешающих молекулярно-генетических методов исследования, нокаутных модельных систем in vitro, а также биоинформационных алгоритмов анализа данных и современных пакетов статистических программ. Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были представлены в форме устных и стендовых докладов на IV-VI Международных конференциях по радиации и ее применению в различных областях исследований (Ниш, Сербия, 2016; Будва, Черногория, 2017; Охрид, Македония, 2018), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Конференциях европейского общества генетики человека (Гетеборг, Швеция, 2010; Нюрнберг, Германия, 2012; Глазго, Шотландия, 2015; Барселона, Испания, 2016), VI, VII и XII Региональных конференциях молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2017), Невском радиологическом форуме (Санкт-Петербург, 2011), III Республиканской научно-практической конференции «Радиационная безопасность Республики Саха (Якутия)» (Якутск, 2011), X международном симпозиуме по хромосомным аберрациям (ISCA10, Амальфи, Италия, 2012), Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2012), Конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2012), VI международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения (Северск-Томск, 2013), VI Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону, 2014), Международной молодежной научной конференции «Современные проблемы генетики,
клеточной биологии и биотехнологии» (Томск, 2014), Международной конференции «Хромосома» (Новосибирск, 2015), Международных конференциях «Перспективы развития фундаментальных наук» (Томск, 2016, 2017, 2018), Международной конференции «Физика рака» (Томск, 2017); VII Международной школе «Геномика и биология живых систем» (Звенигород, 2016), Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы» (Москва, 2016), Конференции «Актуальные проблемы радиобиологии и астробиологии» (Дубна, 2016), II Всероссийской конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2017), Конференции «Биотехнологии – медицине будущего» (Новосибирск, 2017), Международной конференции «Хромосомы и митоз» (Новосибирск, 2017), Научных конференциях «Генетика человека и патология» (Томск, 2011, 2017). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2016), а также на межлабораторном семинаре в НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (Томск, 2018).
Личный вклад автора. Диссертационная работа является самостоятельным научным трудом, выполненным на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. В работе использован материал, полученный автором совместно с сотрудниками лаборатории. Автор лично осуществлял планирование и участвовал в проведении всех экспериментов. Анализ фактического материала, статистическая обработка, обобщение данных и оформление результатов исследований в виде статей в значительной степени проведены лично автором.
Публикации. По теме исследования опубликовано 59 работ, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук, 2 монографии, 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Библиографический указатель включает 609 источников, из них – 31 публикация в отечественной литературе, 578 – в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 54 рисунками и содержит 26 таблиц.
Влияние эпигенетических механизмов на эффективность репарации ДНК
Эпигенетические модификации представляют собой «митотически и/или мейотически наследуемые изменения в функции генов, которые не могут быть объяснены изменениями в последовательности ДНК» (D Urso, Brickner, 2014). Эпигенетический статус при этом может быть достаточно стабильным (как при инактивации X хромосомы и импринтинге) или динамичным. Динамичное изменение эпигенетической регуляции в ответ на воздействие определенного стимула часто описывается как «эпигенетическая память» (D Urso, Brickner, 2014). Поэтому, влияние эпигенетических механизмов на эффективность репарации ДНК необходимо рассматривать с учетом того, насколько стабильным является то или иное эпигенетическое состояние.
Одним из таких параметров эпигенетического фона является изменение уровня метилирования генома (Ванюшин, 2006). Средний уровень метилирования генома отражает уровень метилирования CpG-сайтов, локализующихся как в белок-кодирующих генах, так и в значительно большей степени в различных повторяющихся последовательностях. Связь между гиперметилированием промоторов отдельных генов и повышением частоты хромосомных аберраций является достаточно хорошо изученным феноменом (Кузьмина и др., 2017). Меньше известно о связи с уровнем хромосомных нарушений метилирования ДНК в повторяющихся последовательностях.
Изменение эпигенетического фона клеток в ходе онтогенеза потенциально может приводить к повышению частоты анеуплоидии и структурных повреждений ДНК вследствие активации экспрессии ретротранспозонов (рис. 1). Тем не менее, по-видимому, это негативное влияние уравновешивается значительной ролью наиболее распространенного ретротранспозона LINE-1 (уровень метилирования которого в основном и отражает глобальный уровень метилирования генома) в регуляции глобального профиля экспрессии у эукариот (Feschotte, 2008; Goodier, Kazazian, 2008; Faulkner et al., 2009) и непосредственным участием LINE-1 в таких фундаментальных физиологических процессах, как ранний эмбриогенез, развитие и дифференцировка (Beraldi et al., 2006; Sciamanna et al., 2011; Vitullo et al., 2012). Интересно, что несмотря на известное влияние глобального уровня метилирования ретротранспозонов на протекание ранних этапов зародышевого развития, до сих пор не исследовался вклад нарушений глобального уровня метилирования генома в структуру генетических причин эмбриональной гибели. Поэтому, учитывая важную роль тканей плаценты в выживании эмбриона, необходимо провести анализ глобального уровня метилирования генома в экстраэмбриональных тканях внутриутробно погибших зародышей человека.
Таким образом, снижение глобального уровня метилирования генома может быть связано с повышением частоты хромосомных аномалий в клетках человека. Однако, неясно, оказывает ли подобное влияние стабильно низкий глобальный уровень метилирования генома, характерный для некоторых стадий онтогенеза. В ходе установления тканеспецифичного метилирования ДНК de novo в эмбриональном развитии человека уровень метилирования ДНК в экстраэмбриональных тканях возрастает незначительно, в то время как геном клеток, дающих начало эмбриональным структурам, подвергается существенному метилированию (Dean et al., 2003; Kang et al., 2003) (рис. 1). Это делает экстраэмбриональные ткани единственно доступным реально существующим естественным модельным объектом для изучения влияния стабильно низкого глобального уровня метилирования генома на возникновение числовых и структурных хромосомных нарушений.
Уровень хромосомных нарушений в соматических клетках взрослых индивидов также характеризуется значительной межиндивидуальной вариабельностью (Allshire, Madhani, 2017), которая отчасти может быть обусловлена влиянием эпигенетического фона. В некоторых работах показано, что глобальный уровень метилирования ДНК может снижаться после влияния различных мутагенов, включая ионизирующее излучение (Lu, Ramos, 1998; Lu et al., 2000; Lu, Ramos, 2003; Farkash et al., 2006; Stribinskis, Ramos, 2006; Teneng et al., 2007; Wright et al., 2010), тогда как промоторы отдельных генов при этом гиперметилируются (D Urso, Brickner, 2014). Однако неизвестно, пропорциональны ли эти изменения уровня метилирования частоте структурных и числовых хромосомных нарушений, возникающих в соматических клетках человека после мутагенного воздействия (рис. 1).
На участие мейотически наследуемых эпигенетических механизмов в определении уровня генетических нарушений указывают исследования трансгенерационных эффектов радиационного воздействия на микросателлитную нестабильность у мышей (Abouzeid Ali et al., 2012; Mughal et al., 2012). Несмотря на то, что метилирование ДНК является наиболее постоянной эпигенетической модификацией, оно, по-видимому, не играет значимой роли в этом процессе, так как степень проявления трансгенерационной генетической нестабильности не зависит от дефицита фолатов (Voutounou et al., 2012). Альтернативным объяснением может являться трансгенерационная передача информации за счет различных некодирующих РНК, что приводит к изменению экспрессии генов, отвечающих за циркадные ритмы у потомства облученных мышей (Gomes et al., 2015).
Следующим свидетельством в пользу влияния эпигенетических механизмов на эффективность репарации ДНК является значительная вариация в радиочувствительности различных типов клеток организма, обладающих одним и тем же генотипом и отличающихся лишь эпигенетическим ландшафтом, приобретенным в ходе разворачивания эпигенетической программы развития организма. Более того, ответ на повреждение ДНК в клетках может динамично меняться вместе с изменением эпигенетического ландшафта в ходе дифференцировки. Примером является изменение параметров репарации ДНК и апоптоза при дифференцировке из стволовых клеток в клетки-предшественники и терминально дифференцированные клетки, показанное в том числе и в наших работах (Buschfort-Papewalis et al., 2002; Vasilyev et al., 2013; Durdik et al., 2017).
Еще более динамичным процессом является «эпигенетическая память», представляющая собой влияние эпигенетических механизмов на трансгенерационные эффекты в митотических поколениях соматических клеток после воздействия мутагенного фактора. Такие эффекты могут быть как негативными (например, радиационно-индуцированная хромосомная нестабильность (Morgan et al., 1996)), так и позитивными, выражающимися в так называемом адаптивном ответе и приводящими к снижению частоты хромосомных нарушений относительно ожидаемого уровня (Sasaki et al., 2002; Tapio, Jacob, 2007). В обоих случаях в основе наблюдаемых эффектов могут лежать механизмы, обеспечивающие «эпигенетическую память» о мутагенном воздействии. Действительно, недавно было обнаружено, что после воздействия на клетки -излучения происходит повышение уровня метилирования и снижение уровня ацетилирования гистонов, что было связано с возникновением радиорезистентности (Wang et al., 2017). Более того, при добавлении селективного ингибитора деацетилаз гистонов SAHA наблюдалось повышение уровня ацетилирования гистонов и исчезновение радиорезистентного фенотипа (Wang et al., 2017). Таким образом, модификации гистонов потенциально могут отвечать за формирование эпигенетической памяти о воздействии мутагенного фактора и приводить к активации в клетках систем ответа на повреждение.
Наконец, эпигенетические механизмы в узком молекулярно биологическом смысле (регуляция активности генов за счет метилирования ДНК, модификаций гистонов, работы некодирующих РНК) играют значительную роль и непосредственно в регуляции ответа на повреждение ДНК в клетках. Во-первых, существуют модификации гистонов, непосредственно связанные с сигналингом и репарацией повреждений ДНК. Так, наиболее известным маркером двунитевых разрывов ДНК являются фосфорилированные фокусы гистона H2AX, которые сами по себе являются эпигенетическим феноменом. Кроме того, метилирование гистона H4 по лизину в позиции 40 (H4K20) за счет метилтрансфераз PRSET7 и WHSC1 является необходимым для привлечения к двунитевому разрыву ДНК одного из ключевых сигнальных факторов репарации двунитевых разрывов ДНК – белка 53BP1 (Hartlerode et al., 2012). Дополнительным фактором в привлечении 53BP1 к сайту двунитевого разрывов ДНК является метилирование лизина в позиции 79 в гистоне H3 (Huyen et al., 2004). Вблизи двунитевых разрывов ДНК также снижен уровень H3K4me3 (Mosammaparast et al., 2013), что обусловлено привлечением гистоновых деметилаз LSD1/KDM1A (Mosammaparast et al., 2013) и KDM4B (Young et al., 2013). С другой стороны, модификация H3K9me3, связанная с подавлением активности репарации ДНК в гетерохроматиновых областях (Di Micco et al., 2011), необходима для активации TIP60 и ATM (Sun et al., 2009), что приводит к повышению интенсивности ответа на повреждение ДНК.
Микроядерный тест и флуоресцентная in situ гибридизация
Культивирование лимфоцитов периферической крови осуществлялось аналогично описанному в разделе по цитогенетическому анализу хромосомных аберраций из тех же образцов цельной крови. После 44 часов культивирования в культуру клеток добавлялся цитокинез-блокирующий агент цитохалазин В (Sigma, США) до конечной концентрации 5 мкг/мл (Fenech, 2006). Через 72 часа культивирования начиналась процедура фиксации. Суспензии клеток переносились в центрифужные пробирки, которые затем центрифугировались при 500 об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант отбрасывался и в пробирки добавлялось 4 мл 0,56 % KCl с инкубацией 5 минут при 37 С. Затем снова проводилось центрифугирование при 500 об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант отбрасывался и добавлялся фиксатор (метанол : ледяная уксусная кислота – 3:1) небольшими порциями по 1 мл через каждые 3 минуты до заполнения пробирок. Затем снова проводилось центрифугирование, супернатант отбрасывался, добавлялось 9 мл фиксатора и пробирки инкубировались в течение ночи при –20 С. Затем после центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре и отбрасывания супернатанта в пробирки добавлялось 9 мл фиксатора с инкубацией в течение 20 минут при –20 С. Эти этапы повторялись 3-4 раза, после чего суспензии центрифугировались при 1000 об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре, супернатант отбрасывался и оставшийся 1 мл суспензии переносился в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, в которых клеточные суспензии хранились при –20 С.
Препараты двухъядерных лимфоцитов периферической крови человека готовились путем раскапывания на каждое предметное стекло по 20 мкл клеточной суспензии. Качество препаратов оценивалось в проходящем свете на микроскопе Axioscop 40 (Zeiss, Германия) по количеству двухъядерных клеток.
Фибробласты экстраэмбриональной мезодермы медицинских абортусов размораживали, вводили в культуру и наращивали до образования монослоя в соответствии со стандартными методами. После достижения монослоя часть клеток подвергали воздействию гамма-излучения в дозе 1,0 Гр на базе НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН, другая часть клеток являлась контрольной. В облученных и необлученных культурах производили смену среды с последующей фиксацией и анализом материала. Для анализа фокусов H2АХ клетки фиксировали на 2 временных точках, через 30 мин и 24 часа после облучения. Процедура фиксации клеток для анализа микроядер проводилась спустя 72 ч после облучения в соответствии со стандартным протоколом, аналогичном использованному для лимфоцитов периферической крови.
Для получения ДНК-зондов использовались трансформированные клоны Е. coli с плазмидами, содержащими вставки центромеро-специфичных фрагментов а-сателлитной ДНК, любезно предоставленные профессором М. Роччи (Институт генетики г. Бари, Италия). Для суспензионной культуры Е. coli использовалась жидкая среда LB (на 50 мл среды: 0,5 г пептона, 0,25 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl) после автоклавирования при избыточном давлении 1,5 атм, в течение 1 часа с добавлением 50 мкг/мл ампициллина. Посев осуществлялся в пробирки объемом 15 мл, которые затем инкубировались в течение суток при постоянном встряхивании на орбитальном шейкере (37 С, 100 об./мин).
Процедура по выделению плазмидной ДНК, содержащей вставки центромеро-специфичных фрагментов ДНК хромосом человека, из клеток Е. сoli проводилась с помощью набора Wizard Minipreps (Promega, США. Концентрация ДНК определялась на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, США).
Введение метки в ДНК осуществлялось стандартным методом ник-трансляции (Маниатис и др., 1984) с использованием ферментов ДНК полимеразы I Е. coli (Thermo, США) и ДНКазы I (Thermo, США) и смеси 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (Sigma, США): дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ в соотношении 5:5:5:1. В качестве дНТФ, несущих корреспондентные группировки, применялись флуоресцеин-12-дУТФ и TAMRA-5-дУТФ (БиоСан, Россия). Для постановки реакции ник-трансляции использовался 1 мкг плазмидной ДНК.
Панцентромерные ДНК-зонды были получены двумя способами: в результате смешивания меченых TAMRA-5-дУТФ ДНК-зондов, специфичных к прицентромерным последовательностям каждой пары хромосом набора человека, или с помощью мечения участков ДНК -сателлитных последовательностей ДНК центромерных районов всех хромосом набора человека, амплифицированных за счет ПЦР. Во втором случае ПЦР проводилась на программируемом термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1 мкл геномной ДНК, 1 мкл каждого праймера, смесь четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов с концентрацией 0,1 мМ каждого и 1 ед. активности Taq-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия) в буфере 50 тМ КС1, 10 тМ Tris, рН 8,3. Условия ПЦР были следующими: 35 циклов: денатурация 45 с при 94 С, отжиг праймеров 45 с при 62 С, элонгация 45 с при 72 С.
Для проведения ПЦР использовались праймеры, специфичные к -сателлитным последовательностям ДНК центромерных районов всех хромосом человека (Muller et al., 2008):
Праймер 27 (5 -CATCACAAAGAAGTTTCTGAGGCTTC-3 );
Праймер 30 (5 GCATTCAACTCACAGAGTTGAACCTTCC-3 ),
Реакция ник-трансляции для введения метки в панцентромерные ДНК-зонды проводилась аналогично центромеро-специфичным ДНК-зондам на отдельные хромосомы набора. Специфичность ДНК-зонда оценивалась на препаратах метафазных хромосом человека. Различий в специфичности панцентромерных ДНК-зондов, полученных с помощью смешивания меченых TAMRA-5-дУТФ ДНК-зондов, специфичных к прицентромерным последовательностям каждой пары хромосом набора человека, или полученных с помощью ПЦР, не было обнаружено.
Постановку реакции FISH проводили по следующему протоколу. Препарат отмывался в трех сменах 2xSSC по 5 минут при 37 С и инкубировался в 0,01 % пепсине в течение 10 минут при 37 С. Затем проводилась постфиксация в 0,5 % растворе параформальдегида в фосфатном буфере (PBS) в течение 10 минут при комнатной температуре и отмывка в течение 5 минут в PBS. Затем препарат обезвоживался за счет проводки по 3 стаканам с этанолом с увеличением концентрации (70 %- 80 %- 100 %), по 5 минут в каждом, после чего высушивался в термостате при 37 С. На препарат наносилось 10 мкл гибридизационной смеси (5 мкл 100 % формамида, 2,5 мкл 50 % декстрансульфата, 1 мкл ДНК спермы лосося в конечной концентрации 0,1 мкг/мкл, 1 мкл ДНК-зонда). Денатурация ДНК-зонда в течение 5 минут при 75 С с последующей гибридизацией ДНК-зондов на препарате в течение 15-18 часов при 37 С проводились во влажной камере с подогревом ThermoBrite (Abbott Molecular, США). На следующий день препараты отмывались от неспецифически связавшегося ДНК-зонда в растворе 0,4xSSC, 0,3 % NP-40 (Amresco, США) в течение 2 минут при 70 С и в растворе 2xSSC, 0,1 % NP-40 (Amresco, США) в течение 5 минут при 37 С. Затем препараты заключались в среду Vectashield (VectorLab, США) с окраской DAPI под покровными стеклами. Флуоресцентные сигналы оценивались на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) при увеличении 63Ох с использованием светофильтров, специфичных к пропусканию спектра испускания красителей DAPI, флуоресцеин и TAMRA.
Анализ частоты микроядер проводился с использованием общепринятых критериев (Fenech et al, 2008). Частота анеуплоидии оценивалась посредством одновременного подсчета числа флуоресцентных сигналов для пар хромосом (2 и 8, 7 и 12, X и Y), меченных флуорохромами двух разных цветов в 1000 двухъядерных клеток для каждого индивида. Анализ проводился на закодированных препаратах одним исследователем.
Нарушения глобального уровня метилирования генома в экстраэмбриональных тканях у спонтанно погибших эмбрионов человека
В выборке спонтанных абортусов с полной и мозаичной формами анеуплоидии и нормальным кариотипом и медицинских абортусов был оценен индекс метилирования LINE-1 в экстраэмбриональных тканях. Для целей этого анализа был использован материал 65 спонтанных абортусов с трисомией хромосом 2, 7, 8, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, дисомией Y-хромосомы, моносомией хромосомы 13 и X. На основе результатов FISH-анализа данная выборка была разделена на подгруппы спонтанных абортусов с полной и мозаичной формами анеуплоидии (31 и 34 эмбрионов, соответственно) (Приложение 2, 3). Кроме того, были исследованы 43 спонтанных абортуса с нормальным кариотипом и 27 медицинских абортусов.
Индексы метилирования отдельных CpG-сайтов в промоторе LINE-1 статистически значимо не отличались между собой и коррелировали друг с другом. Поэтому далее мы использовали среднее значение индекса метилирования трех CpG-сайтов в промоторе LINE-1. Ни в одной из исследованных групп не выявлено межтканевых различий в индексе метилирования LINE-1 между трофобластом и экстраэмбриональной мезодермой.
Индекс метилирования LINE-1 в трофобласте и экстраэмбриональной мезодерме не отличался значимо между группами спонтанных абортусов с полной формой анеуплоидии (49,93 ± 4,86 % и 51,33 ± 5,03 % соответственно) и медицинских абортусов (50,97 ± 6,16 % и 52,72 ± 3,75 % соответственно) (рис. 6). В группе спонтанных абортусов с мозаичной формой анеуплоидии индекс метилирования LINE-1 оказался выше, чем у медицинских – как в трофобласте (55,23 ± 6,34 %), так и в экстраэмбриональной мезодерме (55,65 ± 6,85 %), однако эти различия статистически значимы только при сравнении в трофобласте (p = 0,0003). Кроме того, индекс метилирования LINE-1 в группе спонтанных абортусов с мозаичной формой анеуплоидии был выше по сравнению с чистыми анеуплоидами, при этом статистически значимые различия отмечались только в трофобласте (p = 0,0004) (рис. 6).
Индекс метилирования LINE-1 в трофобласте и экстраэмбриональной мезодерме в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом оказался значимо ниже (43,21 ± 6,18 % и 44,59 ± 6,65 % соответственно), чем в группе медицинских абортусов (p 0,001) (рис. 6). Согласно результатам ROC-анализа, индекс метилирования LINE-1 в трофобласте хориона является хорошим классификатором (AUC = 0,81), позволяющим отделять спонтанных абортусов с нормальным кариотипом от медицинских абортусов с высокой чувствительностью (83 %) и специфичностью (70 %). Кроме того, использование отдельно индекса метилирования только второго проанализированного CpG-сайта позволяет еще повысить возможности классификации (AUC = 0,82) (рис. 7).
Следует отметить, что спонтанные абортусы с чистыми и мозаичными формами числовых хромосомных нарушений имеют анеуплоидии по разным хромосомам, и соответственно обнаруженные различия могли быть обусловлены разной представленностью эмбрионов с анеуплоидиями по разным хромосомам в сравниваемых подгруппах. Чтобы исключить влияние этого фактора, было проведено сравнение индекса метилирования LINE-1 в обеих внезародышевых тканях только эмбрионов, обладающих самой частой анеуплоидией в I-ом триместре беременности – трисомией хромосомы 16. В этом случае индекс метилирования LINE-1 оказался также статистически значимо выше в трофобласте эмбрионов с мозаичной формой трисомии 16 (55,08 ± 5,34%) по сравнению с чистой формой трисомии 16 (48,73 ± 5,89%) (p = 0,014). Более высокий индекс метилирования LINE-1 (по сравнению с медицинскими абортусами) статистически значимо сохраняется и в группе спонтанных абортусов с мозаичной формой любой другой анеуплоидии, за исключением трисомии 16 (p = 0,003). Таким образом, обнаруженные нами различия между группами эмбрионов с мозаичными и полными формами числовых хромосомных нарушений не связаны с неравномерностью распределения анеуплоидии по разным хромосомам и преобладанием трисомии 16.
Профиль метилирования ДНК экстраэмбриональных тканей может меняться в ходе внутриутробного развития вследствие идущих процессов формирования плаценты. С другой стороны, метилирование ДНК теоретически может изменяться после остановки развития самого зародыша, отражая адаптационные способности продолжающих в этих условиях (неразвивающаяся беременность или анэмбриония) относительно автономное развитие плацентарных тканей. Поэтому нами был проведен анализ корреляции между индексом метилирования LINE-1 и возрастом эмбрионов, определенным по дате последней менструации, а также возрастом, определенным по данным ультразвукового исследования. Оказалось, что в обоих случаях никаких статистически значимых связей не наблюдается. Кроме того, не было выявлено значимой корреляции между индексом метилирования LINE-1 и разностью между возрастом эмбрионов, определенным по дате последней менструации, и возрастом, определенным по данным ультразвукового исследования. Данный показатель отражает задержку развития эмбриона и время, прошедшее с момента его гибели до момента получения биологического материала для исследования. Иными словами, задержка эмбриона в полости матки после остановки развития не оказывает заметного влияния на регистрируемый уровень метилирования генома (по крайней мере, по результатам оценки индекса метилирования LINE-1).
Внезародышевая мезодерма и цитотрофобласт хориона являются производными различных зародышевых листков (эпибласта, дифференцирующегося из внутренней клеточной массы, и трофэктодермы соответственно). Ранее нами обнаружено, что клетки внезародышевой мезодермы эмбрионов I-го триместра беременности содержат больше гиперметилированных CpG-сайтов, расположенных в промоторах генов, чем клетки цитотрофобласта (Толмачева и др., 2011). Однако, в настоящем исследовании индекс метилирования LINE-1 не отличался между внезародышевой мезодермой и цитотрофобластом во всех изученных группах эмбрионов, включая медицинских абортусов. Это свидетельствует о том, что индекс метилирования LINE-1, по-видимому, или не изменяется, начиная от стадии дробления, на которой происходит разделение внутренней клеточной массы и трофоэктодермы, или эти изменения носят равномерный и однонаправленный характер в обоих внезародышевых листках. Таким образом, полученные в настоящем и предыдущих наших исследованиях данные свидетельствуют о том, что различия рисунка метилирования ДНК между внезародышевыми тканями определяются, в основном, характером метилирования промоторных регионов генов, а не мобильных генетических элементов LINE-1.
Анеуплоидия в эмбриональных клетках может иметь как мейотическое, так и митотическое происхождение, но независимо от происхождения геномной мутации появление мозаичного варианта кариотипа всегда является результатом митотических ошибок, происходящих на ранних этапах эмбриогенеза. Очевидно, что избыток/недостаток дозы генов, расположенных на одной из хромосом набора, в зиготе или хромосомный дисбаланс, возникающий на первых этапах дробления бластомеров, сами по себе могут изменять эпигенетический профиль генома и приводить к нарушению динамики процессов эпигенетического репрограммирования в раннем эмбриогенезе (Pendina et al., 2011). Известно, что на этот период предымплантационного развития приходится одна из волн эпигенетического репрограммирования генома, во время которой происходит «снятие» метилирования с родительских пронуклеусов. При этом отцовский геном подвергается активному деметилированию, затрагивающему, в основном, повторяющиеся последовательности, в том числе и LINE-1, тогда как в материнском геноме происходит пассивное деметилирование, которое касается последовательностей генов, кодирующих белки (Li, 2002; Smith et al., 2012).
Связь уровня фокусов H2AX с экспрессией генов в нормальных соматических клетках человека
На основе полученных результатов, демонстрирующих обратную зависимость кластогенного действия ионизирующего излучения от спонтанного уровня фокусов H2AX в лимфоцитах периферической крови как in vitro, так и in vivo, был проведен эксперимент по анализу регуляции активности генов, связанных с развитием радиационно-индуцированного ответа (табл. 15).
В обеих группах был проведен полнотранскриптомный анализ экспрессионных профилей с использованием технологии микрочипов, по результатам которого были выделены гены, дифференциально экспрессирующиеся в обследованных группах как в контроле, так и в ответ на облучение (рис. 33).
Сравнение с использованием FDR. Сравнение данных микрочипового анализа в группах индивидов с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественность сравнений Бенджамина-Хохберга (FDR – false discovery rate или ожидаемая доля ложных отклонений) позволило выявить статистически значимые отличия по экспрессии лишь нескольких генов. Облучение в группе НФ приводило к повышению экспрессии 3 генов (FDXR, ENST00000424084, EDA2R) при FDR 0,05 и еще 6 генов (TNFRSF10B, ENST00000452402, RPS27L, FRG2C, BBC3, PVT1, PHLDA3) при 0,05 FDR 0,20 по сравнению с необлученными образцами. В группе ВФ после облучения значимо повышалась экспрессия генов FDXR и EDA2R (табл. 16) при FDR 0,05 и еще 4 генов (TNFRSF10B, RPS27L, BBC3, PHLDA3) при 0,05 FDR 0,20.
Ген FDXR кодирует ферредоксин редуктазу – митохондриальный флавопротеин, который инициирует транспорт электронов на цитохром P450. Экспрессия ферредоксин редуктазы запускается за счет p53 и сенсибилизирует клетки к апоптозу, вызываемому активными формами кислорода (Liu, Chen, 2002). Экспрессия гена FDXR является признанным маркером воздействия радиации и используется для биологической дозиметрии (He, Klionsky, 2009; Abend et al., 2016; Edmondson et al., 2016; Tilton et al., 2016). Более того, в недавнем исследовании было показано, что экспрессия одного гена FDXR позволяет оценить поглощенную дозу ионизирующего излучения с той же точностью, как и анализ всего профиля экспрессии с помощью микрочипов (Abend et al., 2016). Продукт гена EDA2R – рецептор эктодисплазина A2, относящийся к суперсемейству TNFR. Как и ген FDXR, ген EDA2R находится под транскрипционным контролем p53 (Brosh et al., 2010; Tanikawa et al., 2010) и является хорошо известным маркером воздействия ионизирующего излучения (He, Klionsky, 2009; Zheng et al., 2013; Zheng et al., 2015). Таким образом, обнаруженная в настоящем исследовании активация отдельных генов после воздействия ионизирующего излучения подтверждается обширными литературными данными.
После облучения в группе ВФ по отношению к группе НФ значимо выше оказалась экспрессия длинной некодирующей РНК ENST00000424415 и белок-кодирующего гена ADAMTS1, и значимо ниже – экспрессия гена длинной некодирующей РНК ENST00000424084 (при FDR 0,05). При 0,05 FDR 0,20 в группе ВФ была повышена экспрессия гена CRNDE и снижена экспрессия генов EIF2A, PNPLA5, FRG2C.
К сожалению, в литературе нет информации по возможной функции длинных некодирующих РНК ENST00000424415 и ENST00000424084. При этом транскрипт гена ENST00000424415 человека (chrX:3809479-3820041, hg19) обладает высокой степенью гомологии (свыше 90 %) по определенным нуклеотидным последовательностям с субтеломерным районом короткого плеча Х хромосомы высших приматов (шимпанзе, гориллы, макаки, гиббона, бабуина и мартышки). Аналогичная ситуация наблюдалась для транскрипта гена ENST00000424084 (chr1:25043707-25113119, hg19), что указывает на эволюционную консервативность выявленных последовательностей РНК по крайней мере у приматов.
CRNDE (Colorectal Neoplasia Differentially Expressed (Non-Protein Coding)) – ген длинной некодирующей РНК. Повышенная экспрессия CRNDE отмечается во многих типах солидных опухолей и при лейкемии (Graham et al., 2011; Ellis et al., 2012; Zhang et al., 2012; Szafron et al., 2015). Транскрипты CRNDE вовлечены в процесс эпигенетической регуляции экспрессии многих генов посредством взаимодействия с хроматин-модифицирующими комплексами, большей частью с PRC2 (polycomb repressive complex 2) (Khalil et al., 2009). Повышенная экспрессия CRNDE в лимфоцитах индивидов с высоким спонтанным уровнем фокусов H2AX, обнаруженная в настоящем исследовании, может быть обусловлена активацией PI3K/MAPK сигнальных каскадов или инсулин/IGF-зависимого сигнального пути, что способствует развитию апоптоза и элиминации поврежденных клеток (Ellis et al., 2014).
ADAMTS1 (Disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1) – ген, кодирующий белок семейства ADAMTS, который содержит несколько функциональных модулей, включая пропептидную область, металлопротеиназный и дизинтегрин-подобный домены, а также тромбоспондиновый (TS) мотив 1 типа (NCBI: 9510). Экспрессия гена ADAMTS1 имеет разнонаправленный характер в нормальных и опухолевых клетках, что может свидетельствовать о его роли в про- и антионкогенной активности. В нормальных тканях экспрессия ADAMTS1 выражена слабо, хотя повышение уровня экспрессии отмечено в клетках сердечной мышцы, где ассоциировано с ранними патофизиологическими изменениями при инфаркте миокарда (Nakamura et al., 2004). ADAMTS1 участвует в процессах ангиогенеза и развития мочеполовой системы, а также раневой репарации кожи (Krampert et al., 2005).
Изменение экспрессии гена сопровождается процессом малигнизации (Ricciardelli et al., 2011; Freitas et al., 2013) и опухолевой васкуляризацией (Gustavsson et al., 2008). Для многих опухолей характерна сниженная экспрессия гена ADAMTS1, которая достигается за счет гиперметилирования его промотора (Lind et al., 2006; Ahlquist et al., 2008; Choi et al., 2008; Yegnasubramanian et al., 2011). Тем не менее, для опухолей некоторых локализаций, наоборот, характерна повышенная экспрессия гена ADAMTS1 (Tan Ide et al., 2013). Более того, в недавнем биоинформатическом анализе ADAMTS1 был выделен как один из ключевых генов, играющих роль в развитии опухолей молочной железы (Wu et al., 2016). ADAMTS1, по видимому, участвует в различных сигнальных путях. Так, экспрессия гена ADAMTS1 повышалась в клетках опухолевой линии A2780 с мутантным p53 (Davidson et al., 2014), что указывает на негативную регуляцию экспрессии гена ADAMTS1 за счет p53. Кроме того, экспрессия гена ADAMTS1 также повышалась и после ингибирования TGF, что, в свою очередь, приводило к инвазии эпителиальных клеток (Le Bras et al., 2015). Интересно, что одной из функций ADAMTS1, по-видимому, является активация TGF через разрезание его неактивной формы в межклеточном матриксе (Bourd-Boittin et al., 2011).
Следовательно, регуляция ADAMTS1GF может происходить по механизму отрицательной обратной связи. Это особенно важно, учитывая, что TGF является важным компонентом ответа клетки на повреждение ДНК (Barcellos Hoff, Cucinotta, 2014), в частности, регулируя киназную активность ATM. Нокаут TGF в мышиных клетках или ингибирование сигналинга TGF в клетках человека нарушает активность и автофосфорилирование ATM, что приводит к снижению уровня фосфорилирования ключевых мишеней ATM (включая гистон H2AX и p53) деактивации контрольных точек клеточного цикла, связанных с повреждениями ДНК, и повышенной радиочувствительности клеток (Ewan et al., 2002; Kirshner et al., 2006; Wiegman et al., 2007). Таким образом, повышенный уровень экспрессии гена ADAMTS1 в лимфоцитах индивидов из группы ВФ может приводить к активации TGF, что, в свою очередь, повышает уровень активности ATM и фосфорилирования гистона H2AX, что и приводит к наблюдаемому в этой группе повышенному уровню фокусов H2AX. Кроме того, высокая частота радиационно-индуцированных микроядер в клетках индивидов из группы НФ может также объясняться низкой экспрессией гена ADAMTS1, так как ингибирование сигналинга TGF приводит к повышению радиочувствительности клеток (Ewan et al., 2002; Kirshner et al., 2006; Wiegman et al., 2007).
Расширенный анализ генов с отличиями в экспрессии в 2 и более раза.
Учитывая малый размер групп индивидов, для расширенного анализа дифференциально экспрессирующихся генов были выделены гены, для которых отмечались значимые отличия по экспрессии между группами в 2 и более раза без использования поправки FDR. Подобный подход является допустимым и применяется как для целей биомониторинга мутагенной нагрузки окружающей среды, так и в медицинских исследованиях (Shi L, et al., 2005; Guo L, et al., 2006).
В результате проведенного анализа было выявлено 600 генов (326 генов, кодирующих белки, из них экспрессия 174 генов повышена в группе ВФ и 152 – в группе НФ), экспрессия которых статистически значимо различалась в 2 и более раза между обеими группами индивидов в необлученных лимфоцитах периферической крови. После облучения различия в экспрессии между группами индивидов наблюдались для 614 генов (353 гена, кодирующих белки, из них экспрессия 180 генов повышена в группе ВФ и 173 – в группе НФ) (рис. 34) (Приложение 4, 5).
Экспрессия 90 генов (из них 56 генов, кодирующих белки) значимо различалась между группами НФ и ВФ и в необлученных, и в облученных образцах. Это указывает на то, что дифференциальная экспрессия генов в необлученных клетках с различным уровнем фокусов H2AX не может полностью описать экспрессионный ответ клеток на воздействие радиации.