Окулофарингеальная миодистрофия и вариабельность локуса ОФМД в популяциях Якутии Куртанов Харитон Алексеевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1. Аутосомно-доминантная окулофарингеальная мио дистрофия 11

1.1.1. Популяционные исследования ОФМД 12

1.1.2. Молекулярно-генетические основы заболевания 18

1.1.3. Клиника ОФМД 24

1.1.4. Дифференциальный диагноз 27

1.1.5. Лечение 28

1.1.6. Генетическое консультирование 30

1.1.7. Молекулярно-генетическая диагностика ОФМД 32

1.2. Этногенез и генетическое разнообразие якутского этноса 33

1.2.1. Этно-исторические сведения о коренных народах Якутии 34

1.2.2. Наследственные болезни в якутской популяции 35

Заключение 38

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41

2.1. Клинико-генеалогическая характеристика больных ОФМД и членов их семей 41

2.2. Молекулярно-генетические методы 42

2.2.1. Характеристика исследованных популяционных выборок 44

2.2.2. Молекулярно-генетический анализ мутации в гене PABPN1 45

2.2.3. Молекулярно-генетический анализ локуса ОФМД по 11

SNP маркеров 49

2.3. Статистическая обработка результатов 51

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 53

3.1 Территориальная и этническая распространенность ОФМД в PC (Я) 53

3.2 Клинико-генеалогическая характеристика больных с ОФМД

3.3 Молекулярно-генетический анализ ОФМД 59

3.3.1. ДНК-диагностика ОФМД 59

3.3.2. Секвенирование мутации (GCN)i4 в гене PABPN1 60

3.4. Генетическая вариабельность, структура неравновесия по

сцеплению и гаплотипическое разнообразие локуса ОФМД в популяциях PC (Я) 62

3.4.1. Генетическая вариабельность локуса ОФМД по частотам аллелей и генотипов в группах больных, здоровых родственников и в популяционных выборках Якутии 62

3.4.2. Оценка межпопуляционного генетического разнообразия (FST) четырех этнических групп на основе частот аллелей и гаплотипов 64

3.4.3. Анализ филогенетических взаимоотношений в этнических группах якутов, эвенков, эвенов и юкагиров 67

3.4.4. Структура гаплотипов и неравновесия по сцеплению (LD) в локусе ОФМД в исследованных группах 71

3.4.5. Медианное древо гаплотипов в локусе ОФМД по первому и второму блокам LD 78

3.4.6. Анализ возраста мутации (GCN)I4B гене PABPN1 в якутской популяции 84

3.5. Популяционно-генетические механизмы накопления ОФМД в Якутии 90

Заключение 94

Выводы 96

Список использованной литературы

• Дифференциальный диагноз
• Этно-исторические сведения о коренных народах Якутии
• Молекулярно-генетический анализ мутации в гене PABPN1
• Генетическая вариабельность локуса ОФМД по частотам аллелей и генотипов в группах больных, здоровых родственников и в популяционных выборках Якутии

Введение к работе

Актуальность исследования. Низкий уровень генетического разнообразия в популяциях якутов по сравнению с другими популяциями Евразии был показан при анализе линий митохондриальной ДНК [Федорова С.А. и др., 2003], Y-хромосомы [Пузырев В.П. и др., 2003, Харьков В.Н. и др., 2008], аутосомных микросателлитных локусов (STR) и локусов Alu-повторов [Степанов В.А., 2002]. Также данными генетико-эпидемиологических исследований якутского населения обосновано выделение нескольких форм этноспецифической патологии, названных "якутскими" наследственными болезнями [Пузырев В.П. и др., 2008]. Помимо окулофарингеальной миодистрофии к «якутским наследственным болезням» относят такие заболевания, как: спиноцеребеллярная атаксия I типа (ОМІМ 164400) [Коротов М.Н., 1994; Зинченко Р.А., 2001; Банщикова Е.С., 2002; Платонов Ф.А. и др., 2004; Гинтер Е.К., 2006; Иллариошкин С.Н. и др., 2006; Конева Л.А. и др., 2010], миотоническая дистрофия (ОМІМ 160900) [Harper P.S. et al., 2004; Сухомясова А.Л., 2005; Федорова С.А., 2005], наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия I типа (ОМІМ 250800) [Тарская Л.А. и др., 2004; Галеева Н.М. и др., 2006], «якутский синдром низкорослости» или синдром 3-М (ОМІМ 273750) [Maksimova N.R. et al., 2007], аутосомно-рецессивная глухота типа 1А (ОМІМ 220290) [Barashkov N.A. et al., 2011; Барашков Н.А. и др., 2013], синдром низкорослости с атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов или SOPH-синдром (ОМІМ 614800) [Maksimova N.R. et al., 2010]. Распространённость этих болезней значительно выше, чем в мировом народонаселении. Для каждого заболевания выявлены особенности молекулярной природы, отличающие их от сходных фенотипов в других популяциях, в которых они встречаются реже [Пузырев В.П. и др., 2008].

Окулофарингеальная миодистрофия (ОФМД, ОМІМ 164300) - наследственное нервно-мышечное заболевание с аутосомно-доминантным (АД) типом наследования, клинические симптомы появляются после 40-50 лет [Tome F.M.S., 1994; Blumen S.C. et al., 2000]. Болезнь проявляется птозом век, расстройством глотания и фонации, парезом глазодвигательных мышц, слабостью лицевой мускулатуры, прогрессирующей слабостью и атрофией мышц проксимальных отделов конечностей [Witting N. et al., 2014;NeelA.T. etal., 2015].

В Европе распространенность ОФМД низкая 1:100000 чел. Но в отдельных странах или популяциях ОФМД встречается с очень высокой частотой. Так, во франко-канадской популяции в Квебеке (Канада) частота ОФМД составляет 1:1000 чел. [Bouchard J.-P. et al., 1997]. Самая высокая частота ОФМД в мире на сегодняшний день выявлена у бухарских евреев (Израиль) - 1:600 чел. [Blumen S.C. et al., 2000].

ОФМД в популяциях России мало изучена. Предположительно, частота ОФМД у русских сравнима с европейскими данными. Трудность постановки диагноза связана с поздним началом заболевания и низкой продолжительностью жизни россиян по сравнению с гражданами европейских стран [Иллариошкин С.Н. и др., 2002; Симанов Р.В. и др., 2010]. В Якутии ОФМД была описана М. Зак [1932] и П.А. Петровым [1987]. Последние работы по изучению ОФМД в популяциях Якутии выявили высокую частоту этого заболевания [Максимова Н.Р., 2009].

Мутацию, вызывающую ОФМД, открыли канадский врач невролог Бернард Браис с коллегами в 1998 г. Ген PABPN1 картирован на 14 хромосоме (14ql 1.2-13). Мутация находится в 1-м экзоне гена и представляет собой увеличение числа копий тринуклеотидных GCN-повторов. У здоровых людей нормальное количество GCN-повторов 10, у больных ОФМД число повторов достигает 11-17 копий.

Исследования, касающиеся гаплотипического анализа ОФМД с использованием в качестве маркеров коротких тандемных повторов (STR) или однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), в мире единичны [Максимова Н.Р., 2009; Blumen S.C. et al., 2000, Rodriguez M. et al., 2005, Rivera D. et al., 2008, Pulkes T. et al., 2011].

Таким образом, учитывая территориальную и генетическую подразделенность между разными этносами и популяциями, населяющими Якутию [Максимова Н.Р., 2002; Кучер А.Н., 2005], представляется актуальной необходимость проведения всестороннего исследования ОФМД, с последующей разработкой программы профилактической медико-генетической помощи населению Республики Саха (Якутия).

Цель работы: Клинико-генеалогический анализ, изучение молекулярно-генетических основ и раскрытие возможных механизмов накопления окулофарингеальной мышечной дистрофии в PC (Я).

Задачи исследования:

1. Проанализировать распространенность ОФМД в PC (Я).

2. Провести клинико-генеалогический анализ больных с ОФМД в Якутии.

3. Исследовать молекулярную структуру мутации гена PABPN1 больных ОФМД.

4. Описать генетическую вариабельность, выявить структуру и распространённость SNP-гаплотипов в локусе гена PABPN1 в популяциях, проживающих на территории Якутии (якуты, эвенки, эвены, юкагиры), и у больных ОФМД.

5. Оценить возможные популяционно-генетические механизмы накопления ОФМД в Якутии.

Научная новизна исследования:

В данном исследовании проведен анализ распространенности и особенности этно-территориального распределения ОФМД в PC (Я). Изучены клинические проявления болезни у якутов. Впервые охарактеризовано генетическое разнообразие локуса ОФМД по 11 полиморфным вариантам (rs2231301, rsl950252, rsl535094, rs7142474, rs2239579, rs8020117, rs2295126, rs 1054084, rs2268330, rs7161120, rs4981469) в популяциях Якутии. При анализе структуры неравновесия по сцеплению в локусе ОФМД, выявлен единственный гаплотип (ATCG), связанный с мутацией (GCN)i₄. Произведена оценка возраста генерации разнообразия по 9 исследованным STR-маркерам локуса ОФМД, составившая 3783±1254 года.

Практическая значимость:

Полученные в работе данные существенно расширили знания о частой в республике болезни (ОФМД). Получены новые данные по распространенности, экстерриториальному распределению и показали неоднородность распределения заболевания на территории PC (Я). Информация о выявленных в работе гаплотипах локуса ОФМД, сцепленных с мутацией, может быть использована в сегрегационном

анализе семей пробандов. Результаты молекулярно-генетических исследований уже нашли применение в практической медицине, полученные результаты внедрены в практическую деятельность перинатального центра РБ № 1 НЦМ PC (Я) с 2010 г. Полученные данные молекулярно-генетических исследований локуса ОФМД могут найти применение в лабораторной ДНК-диагностике болезни. Знания о единственной мутации у якутов, наличии этой же мутации у индивидов другого этнического происхождения, о времени происхождения мутации и механизмах ее распространения указывают на необходимость исследования ОФМД, в сопредельных с Якутией областях и использовать полученные информацию в работе медико-генетических служб Якутии, Сибири и Дальнего Востока. Материалы могут быть использованы при преподавании клинической и медицинской генетики студентам медицинских и биологических факультетов и врачам на курсах повышения квалификации. Положения, выносимые на защиту:

6. Распространенность ОФМД (12,5 на 100 тыс. населения) в Якутии превышает мировые значения в десятки раз и позволяет отнести редкое в мире заболевание к частым наследственным заболеваниям у якутов. Клинико-генеалогическая характеристика больных с ОФМД в PC (Я) сопоставима с клиникой больных, описанных ранее (проживающих на других территориях).

7. Молекулярно-генетической причиной ОФМД у якутов является экспансия (GCN)i₄-noBTopoB в гене PABPN1. При анализе гаплотипа, построенного на основе связанного с мутацией второго блока неравновесия по сцеплению (LD) у якутов (rs7142474, rs2239579, rs8020117, rs2295126), у всех исследованных носителей мутации (GCN)i4 выявлен единственный гаплотип (ATCG). Таким образом, распространение ОФМД в PC (Я) обусловлено накоплением единственной мутации (GCN)i4 в гене PABPN1 в результате эффекта основателя.

8. Возраст мутации (GCN)i₄, рассчитанный на основании анализа STR - гаплотипов больных ОФМД, составил 189,2±62,7 поколений или 3783±1254 года.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на международной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 28-30 ноября 2007); форуме научной молодежи Республики Саха (Якутия), посвященном году академика В.П. Ларионова (Якутск, 1 февраля 2008); 2-й научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере» (Якутск, 4-5 июня 2009); VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010); научно-практической конференции «Медицина в современном мире, взгляд научной молодежи» (Якутск, 25 марта 2010); ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Амстердам, Нидерланды, 28-31 мая 2011), конференции «Генетика человека и патология. Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011), VII съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 3 в рецензируемых журналах перечня ВАК РФ, рекомендованных для защиты по медицине.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 138 стр. машинописного текста и состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), заключения, выводов, списка литературы и 3 приложений. Данные проиллюстрированы 14 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 184 источника, из них 121 зарубежные.

Дифференциальный диагноз

Локус ОФМД картирован на хромосоме 14qll.2-ql3 [Brais et al, 2006]. В норме в гене PABPN1 присутствует семь экзонов. Роль двух длинных интронов, сохраненных во многих мРНК, неизвестна [Brais et al., 2006]. При патологии происходит мутация ОФМД, это экспансия (GCN)n-noBTopoB, которая начинается после кодона ATG. В настоящее время известны две теории, объясняющие механизм возникновения мутации: 1) экспансия GCN-повторов в результате проскальзывания реплицирующей молекулы ДНК-полимеразы (replication slippage) на повторе в обратном направлении, сопровождаемое образованием шпильки в строящейся цепи ДНК; 2) вставка (инсерция) дополнительных (GCN)n-noBTopoB в результате неравной рекомбинации или конверсии гена [Brais et al., 1998; Nakamoto et al., 2002; Chen et al, 2005]. Из этих двух теорий неравный кроссинговер - наиболее вероятный механизм, все еще нет никаких экспериментальных данных, чтобы подтвердить один из этих механизмов [Nakamoto et al., 2002].

Нормальный генный продукт: полиаланин-связывающий ядерный белок 1 закодирован в гене PABPNl [Calado et al, 2000; Fan et al., 2001; Kuhn et al, 2003] и содержится в большом количестве в ядре клетки. Длина гена приблизительно 49 т.п.н. [Wahle et al, 1993; Nemeth et al., 1995]. Поли-(А) хвост посттранскрипционным образом присоединяется к мРНК с помощью многих сопутствующих факторов, включая PABPNl, фактор распада молекулы, фактор специфичности полиаденилирования (CPSF) и поли-(А) полимераза (РАР) [Wahle & Ruegsegger 1999; Zhao et al., 1999].

Было доказано, что PABPNl курсируют между ядром и цитоплазмой [Calado et al., 2000]. Во время транскрипции, PABPNl связан с полимеразой РНК II, а после - сопровождает синтезированный транскрипт (мРНК) через ядерную пору [Bear et al., 2003; Kerwitz et al, 2003]. Экспорт PABPNl из ядра зависит от температуры и прикрепления к РНК, а также от продолжающейся транскрипции. Импорт PABPNl в ядро - активный транспортин-опосредованный процесс [Calado et al, 2000; Banerjee et al, 2013].

К настоящему времени идентифицированы несколько белков, с которыми PABPN образует комплекс при закреплении к мРНК, это HNRPA/B, HNRPA1 [Fan et al, 2003] и HNRPC [Calapez et al., 2002]. Методом иммунопреципитации обнаружено, что PABPNl взаимодействует с белками кэп-структурного комплекса (СВР80, СВР20, и EIF4G) и с белками, вовлеченными в распад мРНК (Upf2 и Upf3) [Ishigaki et al., 2001; Kim et al, 2001].

Патологический генный продукт: были предложены различные гипотезы патогенетических механизмов токсичности полиаланинов [Brais et al., 1998; Brais et al., 1999]. Патологическое скопление и неэффективная белковая деградация, как предполагают, являются частью патологического механизма [Brais et al., 2003]. Полагают, что из-за удлиненной патогенной полиаланиновой области PABPN1 накапливается и нарушает нормальные клеточные процессы. Однако, несмотря на растущее число исследований, изучающих патогенез ОФМД, природа основного патологического механизма все еще не установлена. Гипотезы патогенетических механизмов токсичности полиаланинов представлены ниже. 1. Накопление/скопление. Было предложено, что когда в PABPN1 присутствует больше чем десять аланинов (нормальное число), то полиаланиновая область полимеризируется в устойчивую форму р-листов, которая устойчива к ядерной протеосомной деградации. Полиаланиновые макромолекулы растут со временем, от чего и развивается ОФМД и PABPN1 содержащие внутриядерные нити, которые видны при электронной микроскопии [Tome & Fardeau, 1980 , Tome et al., 1997; Calado et al, 2000]. Различные химерные белки с длинными полиаланиновыми областями накапливаются как внутриядерные включения (INI) [Gaspar et al., 2000, Rankin et al, 2000; Abu-Baker et al., 2013]. В одном трансфекционном эксперименте длинный химерный белок 37-Ala-GFP вызвал формирование ядерных включений и гибель клеток [Rankin et al., 2000]. Исследования с веществами (трегалоза, доксициклин), которые влияют на эти скопления, были апробированы на клеточных моделях, моделях мышей с ОФМД и в большинстве случаев получили положительные результаты [Davies et al, 2005, Wang et al, 2005, Davies et al, 2006, Verheesen et al, 2006].

ОФМД заболевание вызванное экспансией тринуклеотидных повторов. Описано девять заболеваний причиной которых является экспансия полиаланиновых повторов [Lavoie et al., 2003]. Среди них, самое короткое увеличение тринуклеотидных повторов (на один GCG-повтор) при аутосомно-рецессивной форме ОФМД [Braise et al, 1998; Blumen et al, 1999; Werling et al., 2015].

Хотя многочисленные случаи ОФМД были идентифицированы в разных популяциях, большое разнообразие мутаций наводит на мысль о существовании большого количества независимых оригинальных мутационных событий [Braise et al., 1998]. Доминантные случаи наблюдались более чем в 35 странах. Доминантные и рецессивные ОФМД вызваны экспансией устойчивых в митозе и мейозе коротких (GCN)io-noBTopoB и реже точечными мутациями, приводящих к удлинению полиаланинового протяжения в белке [Braise et al., 1998, Robinson et al, 2006, Nakamoto et al, 2002]. Первоначально считали, что болезнь вызвана экспанцией только GCG-повторов, как позже выяснилось, в аланиновом протяжении имеются и GCA-вставки. Т.к. кодоны GCA и GCG кодируют одну аминокислоту, решили, что обозначение триплета GCN, удлинение которого приводит к ОФМД, будет правильнее [Braise et al., 1998; Nakamoto et al., 2002]. Два недавних примера наводят на мысль, что новые мутации еще возникают, так как выявляются случаи без семейной отягощенности [Gurtler et al., 2006; Tremolizzo et al, 2007].

Существует проблема корреляции генотипа с клиническими проявлениями болезни. Связь возраста начала и тяжести болезни может зависеть от вида (GCN)n мутации, но все еще недостаточно данных для обоснованных выводов. Доза гена при ОФМД имеет четкое влияние на возраст начала и тяжесть клинических проявлений [Braise et al., 1998]. Тяжесть доминантного фенотипа ОФМД также неодинакова [Bouchard et al., 1997]. Тяжелые случаи имеют более раннее начало (до 45 лет), птоз, дисфагию и слабость проксимального отдела ног, которые начинаются до 60 лет.

Двадцать процентов больных с тяжелым течением аутосомно-доминантной ОФМД оказались компаунд-гетерозиготами, носителями в одном аллеле мутации (GCN)i2-i7, а в другом одного дополнительного триплета GCN [Brais et al, 1998]. Гетерозиготное носительство (GCN)n - считается полиморфизмом, т.к. не вызывает болезни. Этот полиморфизм встречается в популяциях Северной Америки, Европы и Японии с частотой 1 -2 %. Причина остальных 80 % тяжелых случаев аутосомно-доминантной ОФМД неизвестна.

Этно-исторические сведения о коренных народах Якутии

ДНК выделяли из цельной венозной крови. Кровь из локтевой вены под действием вакуума через иглу втягивается в пробирку «BD Vacutainer» напрямую и смешивается с консервантом - ЭДТА. Транспортировка проводилась в термоконтейнерах с хладагентом. При необходимости кровь хранили в морозильнике при -20 С.

В настоящей работе использованы молекулярно-генетические методы исследования, такие как: полимеразная цепная реакция (ПЦР). анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). секвенирование ДНК по методу Сэнгера с использованием автоматической лазерно-флуоресцентной секвенирующей техники. электрофорез в агарозном и полиакриламидном (ПААГ) гелях. Выделение ДНК проводилось из 5-15 мл венозной крови фенольно хлороформным методом [Медицинские лабораторные технологии, 1999]. Хранилась выделенная ДНК в морозильнике при -80 С. Измерение концентрации и чистоты выделенной ДНК проводили на спектрофотометре (метод измерения оптической плотности раствора ДНК в проходящем свете с длиной волны 260/280 нм) фирмы Nanodrop (США). Все выделенные ДНК были доведены до концентрации 100 нг/мкл.

Амплификация области гена, содержащего тринуклеотидные повторы (GCN) проводилась стандартными парами праймеров для анализа мутации ОФМД [Bouchard et al, 1997]. Последовательность использованных праймеров и условия ПНР представлены в табл. 4.

Проведено секвенирование участка гена PABPN1 с целью уточнения типа мутации у больных ОФМД в якутской популяции. Для этого был амплифицирован фрагмент ДНК с мутацией по выше описанной методике (табл. 4). После амплификации методом электрофореза в агарозном геле (1,5 %, 100 Вт, 1,5 ч.) провели разделение аллелей с последующим вырезанием из геля аллель-специфических бэндов. Экстракцию ДНК из агарозного геля проводили коммерческим набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) и субклонировали в плазмидный вектор (pGEM Easy Vector; Promega). По шесть клонов для каждого аллеля были очищены с помощью набора QIAptrep Miniprep (QIAGEN). Продукты амплификации были очищены с помощью флуоресцентного дидеокси-терминационного метода (DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN)) и просеквенированы на автоматическом ДНК-анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Анализ результатов секвенирования проводился с помощью нормальной последовательности ДНК человека по базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информатизации, National Center for Biotechnology Information) (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Анализ локуса ОФМД провели с помощью 11 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) - маркеров. Подбор SNP проводился по базе UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) (рис. 2, табл. 5). Два из этих SNP под номером 5 и 8 ранее были изучены в популяциях с ОФМД. В настоящее время по 8-му SNP в базе NCBI нет информации о полиморфизме этого SNP. Охваченная 11 однонуклеотидными полиморфизмами область составила 20581 п.н. В эту область входят гены PABPN1 и BCL2L2 (табл. 4, 5).

Генотипирование индивидов осуществляли методом ПНР-ПДРФ. Последовательность праймеров («Сибэнзим», г. Новосибирск; «BIORON», Германия) и условия ПЦР и ПДРФ приведены таблице 4. Для двух полиморфизмов (rs2239579 и rsl054084) были использованы праймеры описанные в литературе [Rodriguez et al, 2005, Rivera et al., 2008]. Из-за мономорфности SNP rs 1054084 был исключен из дальнейшего анализа. Для остальных SNP были сконструированы оригинальные праймеры. Из них для шести SNP (rs2231301, rsl535094, rs7142474, rs2268330, rs7161120, rs4981469) в ампликонах отсутствует сайт ферментов рестрикции для детекции полиморфизма. С целью идентификации полиморфизма были созданы модифицированные праймеры, путем замены нуклеотида в последовательности праимера, приводящие к появлению искусственного сайта рестрикции для соответствующего фермента.

Карта локуса ОФМД с (GCN) повторами и с исследованными однонуклеотидными полиморфизмами. На карте полиморфизмы расположены относительно мутации, которая играет роль условной нулевой точки отсчета. Единица измерения - пары нуклеотидов (п.н.). Данные по SNPs взяты из базы NCBI.

Частоты гаплотипов определялись с помощью ЕМ-алгоритма. Неравновесие по сцеплению (LD) между парами SNP рассчитывалось с помощью предложенного Левонтином коэффициента D и коэффициента г2 Пирсона. С помощью алгоритма «Solid spine LD» построена блочная структура, с заданным порогом D 0,75 [Barret et al, 2005]. Методом анализа молекулярной вариабельности (AMOVA) вычисляли уровень генетического разнообразия и межпопуляционную дифференциацию.

Филогенетический анализ взаимоотношений гаплотипов и генотипов выстроенных на основе однонуклеотидных полиморфизмов, проводили, конструируя филогенетические деревья в программе Phylip. Медианные сети гаплотипов строили в программе Network (алгоритм медианных сетей) [Bandelt et al., 1995; 1999].

Возраст мутации считали методом «генетических часов» предложенным Лабудой в 1997 году, где учитьшается количество поколений (g) с момента возникновения мутации в популяции до сегодняшнего дня исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени [Risch et al, 1995; Labuda et al, 1997; Близнец и др., 2006; Вассерман и др., 2007]. В настоящей работе для статистического анализа полученных результатов использовались программы: «Office Microsoft Excel 2007», «Statistica 8.0», «ARLEQUIN», «Haplowiev 4.0», «Network» и пакет программ «PHYLIP». Результат считался достоверным, если уровень значимости р 0,05.

Молекулярно-генетический анализ мутации в гене PABPN1

В современных популяциях человека характер структуры гаплотипов является результатом комплексного эволюционного процесса (демографическая история популяций: миграции, изменение эффективной численности, подразделенность и гено-специфические факторы: темп мутирования, давление отбора, рекомбинации) [de la Vega et al, 2005].

В исследованных выборках в программе Arleqiun с помощью ЕМ-алгоритма обнаружено 52 гаплотипа (табл. 11). Больше всего гаплотипов наблюдается у вилюйских якутов (23), меньше всего у больных русских (2), у европейцев и йоруба - по 6 гаплотипов. Частота гаплотипов составила от 0,3 % до 71,8 %. Основными гаплотипами (ОГ) считаются гаплотипы с частотой более 5 %. Всего выявлено 14 ОГ (в таблице 11 это гаплотипы под номерами 1-14). Частоты двух ОГ в сумме составили 100 % наблюдаемых хромосом в выборке больных русских (ОГ № 1 и 3) и у выборки европейцев (ОГ № 1,4, 5, 7, 9, 13). В остальных выборках частоты ОГ в сумме составляют более 90 %.

Анализ неравновесия по сцеплению (LD) проводился в программе «HaploView 4.1». Блочная структура строилась на основе алгоритма «Solid Spine» с порогом D 0,75 (рис. 8 и 9). Анализ показал, что у якутов выявляется 3 блока LD: первый включает три полиморфизма (rs2231301, rs 1950252, rs 1535094), второй состоит из четырех полиморфизмов (rs7142474, rs2239579, rs8020117, rs2295126) (рис. 8), третий блок образован двумя SNP rs7161120 и rs4981469.

В других популяциях кроме якутов три блока не выявлено. Если рассмотреть якутов на уровне локальных популяций то у центральных якутов и вилюйских якутов выявляются три блока LD, причем у вилюйских якутов третий блок состоит из другого рядом расположенного полиморфизма rs2268330 и rs7161120.

Тесное сцепление между всеми полиморфизмами (1 блок) выявлено у китайцев и японцев. У европеоидов сцепление по 9 полиморфным вариантам (рис. 9). В популяции йоруба выявлен один большой блок, включающий семь полиморфизмов (rs2231301, rsl950252, rsl535094, rs7142474, rs8020117, rs2295126, rs7161120). В выборке носителей мутации (GCN)i4 (больных и здоровых носителей) общей численностью 73 человека, из которых 68 являлись якутами и 5 человек русскими, всего обнаружено 15 мультилокусных генотипов по 10 SNPs. По результатам генотипирования выявлено, что все исследованные индивиды являлись гетерозиготными носителями мутации (GCN)i4. В результате из полученных данных методом сегрегационного анализа, из гомозиготных мультилокусных генотипов получено 3 гаплотипа ассоциированных с данной мутацией. Двенадцать якутов и 2 русских оказались гомозиготами по всем 10 SNPs, с единственным возможным гаплотипом GGGATCGCCC (гаплотип № 1 табл. 11). То есть, этот гаплотип непосредственно наблюдается у больных и однозначно ассоциирован с мутацией. Этот гаплотип является наиболее частым у больных якутов (48,6 %) и по результатам расчетов в Arlequin. Аналогично, 7 образцов якутов и 3 русских имеют гомозиготный генотип по всем 10 SNPs с единственно возможным гаплотипом, ассоциированным с мутацией (GCN)i4, GGGATCGGCC (гаплотип № 3 табл. 11). Один образец больных якутов также имеет гомозиготный генотип по всем 10 SNPs с третьим возможным гаплотипом, ассоциированным с мутацией (GCN)i4, GGGATCGGCG (гаплотип № 9 табл. 11). Таким образом, у носителей мутации непосредственно из гомозиготных мультилокусных генотипов восстанавливаются три гаплотипа однозначно ассоциированные с мутацией.

Два гаплотипа, обнаруживающие ассоциацию являются наиболее частыми, и встречаются как у якутов-носителей мутации, так и у больных русских, а третий относительно редок и обнаружен только у якутов. Гаплотипы № 1 и № 3 могут быть получены один из другого путем рекомбинации между двумя блоками SNP, выявленными в HaploView 4.1. Гаплотип № 9 является либо результатом мутации, произошедшей в гаплотипе № 3, либо результатом рекомбинации внутри третьего блока SNP.

У 8 якутов-носителей мутации, гетерозиготных по различным SNP, ассоциация мутации с гаплотипом GGGATCGCCC (№ 1) установлена путем проведения генеалогического анализа. Данные по генотипам их родственников позволяют однозначно установить, какие именно аллели могли получить эти индивиды от родителей-носителей мутации, а какие - от здоровых. Таким же образом у 11 якутов-носителей мутации, гетерозиготных по различным SNP, установлена ассоциация мутации (GCN)i4 с гаплотипом GGGATCGGCC (№ 3) (из них 8 принадлежат к одной родословной). Из оставшихся 28 образцов, имеющих гетерозиготные генотипы, 3 носителя мутации могут иметь гаплотип № 9, а 25 распределяться между гаплотипами № 1 и № 3. Вероятность принадлежности к тому или иному гаплотипу у этих индивидов должна быть пропорциональна частоте гаплотипов у больных № 1 и № 3.

Высокая суммарная частота гаплотипов № 1, № 3 и № 9 у гомозиготных носителей мутации предполагает (при соблюдении равновесия Харди-Вайнберга) и значительную частоту именно этих гаплотипов среди индивидов с гетерозиготными генотипами. В силу этого ассоциация мутации с другими гаплотипами представляется очень маловероятной. Высокая частота мультилокусных гомозигот у носителей мутации, конечно, может быть связана с наличием большого числа родственников в исследованной выборке, но отсутствие гомозигот по другим аллелям свидетельствует об очень низкой частоте ассоциированных с мутацией гаплотипов, помимо № 1, № 3 и № 9 или их полном отсутствии.

Таким образом, мутантный аллель (GCN)i4 у якутов связан с весьма ограниченным набором гаплотипов, что может отражать недавний эффект основателя по ОФМД в якутской популяции.

Генетическая вариабельность локуса ОФМД по частотам аллелей и генотипов в группах больных, здоровых родственников и в популяционных выборках Якутии

Предковый гаплотип АТСА находится на минимальном числе мутационных шагов от всех остальных гаплотипов и распологается в сети соответственно принципу максимальной экономии мутационных шагов (рис. 10). На рисунке 10 гаплотипы, производные от предкового гаплотипа, разделяются на две группы. В первую группу входит 4 гаплотипа, а во вторую 5 гаплотипов. От предкового гаплотипа в обеих ветвях самые дальние гаплотипы отстоят на 4 мутационных (рекомбинантных) шага.

Медианная сеть по первому блоку LD представлена на рисунке 11. Всего по этим локусам найдено семь гаплотипов. У больных якутов найдено 5 гаплотипов, у больных русских один гаплотип и три у здоровых родственников. Предковый гаплотип по базе NCBI - GGG (Ht7). Он обнаружен во всех выборках, встречается во всех выборках с высокой частотой, более 50 %. Чаще всех встречается у йоруба 90,3 % и больных якутов 80,7 %. У русских больных -100 %. В результате обработки полученных данных методом сегрегационного анализа исходя из гомозиготных мультилокусных генотипов только гаплотип GGG связан с мутацией (GCN)i4, что может говорить в пользу теории «эффекта основателя» ОФМД в якутской популяции. Остальные 4 гаплотипа (AGG, GAC, GAG, GGC) у больных встречаются с низкой частотой и, вероятно, не несут мутацию. Больше всего гаплотипов найдено у больных ОФМД якутов и у йоруба (по 5 гаплотипов). У якутов, эвенков, китайцев и японцев - по 4 гаплотипа. По 2 гаплотипа выявлено у европейцев, юкагиров и эвенков. Самое маленькое гаплотипическое разнообразие у больных русских - 1 гаплотип. В медианной сети (рис. 11) все гаплотипы расположены от предкового гаплотипа (GGG) на расстоянии, не превышающем пяти мутационных шагов. Показательно, что от предкового гаплотипа отходят две ветви гаплотипов. Одна образует только один гаплотип в результате одного мутационного (рекомбинантного) шага, а вторая ветвь состоит из пяти гаплотипов с пятью мутационными (рекомбинантными) шагами.

Из данных мировой литературы, на сегодняшний день, ОФМД описан более чем в 30 странах, в большинстве из них описаны единичные случаи ОФМД. С высокой частотой ОФМД встречается только в 3-4 популяциях. Проведенные исследования в этих популяциях показали сильный эффект основателя. Вероятно, высокая частота ОФМД в якутской популяции вызвана эффектом основателя и тем, что возможно на ранних этапах своего этногенеза популяция якутов прошла через «горлышко бутылки». В последнем случае, в момент прохождения «горлышка бутылки» у якутов должно было быть очень низкое гаплотипическое разнообразие с последующим его ростом из одного гаплотипа-основателя. Гаплотип, найденный в двух неродственных русских семьях с ОФМД из Иркутской области и идентичный гаплотипу больных ОФМД якутов может свидетельствовать, что мутация (GCN)i4 была привнесена из других мест, а не возникла на территории Якутии. Учитывая то, что было найдено три гаплотипа сконструированных по 10 SNP-локусам ассоциированных с мутацией у якутов, можно предположить - мутация была занесена в Якутию не один раз, а, вероятно, разными волнами мигрантов, или же, разнообразие гаплотипов по 10 SNP с мутацией возникло уже на территории Якутии в результате мутаций или рекомбинации. У якутов низкий уровень генетического разнообразия по сравнению с другими народами был показан при анализе линий митохондриальной ДНК, Y-хромосомы, аутосомных микросателлитных локусов и локусов Alu-повторов [Федорова и др., 2003; Пузырев и др., 2003; Харьков и др., 2008; Федорова, 2008]. Также возможно, на территорию Якутии мутация попала уже после того, как у больных семей сформировалось большое гаплотипическое разнообразие вне Якутии. Учитывая все выше изложенное, возможно, мутация (GCN)i4 возникла давно, где-то в Евразии, и была распространена с низкой частотой. А когда попала в Якутию, получила большое распространение в результате «эффекта основателя». Данные о случаях ОФМД в Сибири и Дальнем Востоке отсутствуют. Это, вероятно, говорит о несовершенной диагностике ОФМД из-за недостаточной осведомленности врачей и из-за того, что болезнь начинается позднем возрасте. Поэтому, важно информирование врачей для повышения диагностирования ОФМД, выявления новых семей отягощенных ОФМД, с целью повышения качества оказания медико-генетической помощи больным ОФМД в Сибири и на Дальнем Востоке РФ.

Высокое накопление ОФМД в якутской популяции, найденная единственная мутация (GCN)i4 - ((GCG)i0(GCA)3(GCG)) и обнаруженый единственный гаплотип (ATCG), сцепленный с мутантным аллелем (GCN)i4, дает право предпологать возможность накопления мутации в результате эффекта основателя в якутской популяции. В работе Максимовой Н.Р. было проведено исследование 9 STR-маркеров в локусе ОФМД у 29 больных ОФМД из разных семей (28 якутские семьи и 1 русская семья) (табл. 11). Были выявлены аллели, ассоциированные с ОФМД и определен гаплотип, связанный с мутацией (GCN)M [Максимова, 2009]. Рассчитаны частоты аллелей в выборке больных и в выборке здоровых родственников без мутации (табл. 12). Таблица 11

Оценку возраста происхождения мутации проводили по 6 STR-маркерам, с известной хромосомной и генетической локализацией: D141003, D14S283, D14S990, D14S581, D14S972, D14S264, Маркеры D14S50, D14S64, D14S1041 не были включены в анализ возраста мутации, так как частота аллелей ассоциированных с болезнью оказалась выше в группе здоровых родственников не несущих мутацию, по сравнению с больными. Возможно, это объясняется случайными причинами, вследствие небольшой выборки здоровых родственников (N = 20; см. табл. 12) [Близнец и др., 2006; Вассерман и др., 2007].

Суммируя полученные и литературные данные можно заключить, что накопление ОФМД у якутов произошло из-за небольшой численности изначальной популяции якутов, сновными факторами накопления наследственных заболеваний в якутской популяции являются: небольшая численность популяции предков, географическая изолированность, высокая рождаемость якутов [Федорова, 1999], положительная брачная ассортативность по национальности [Данилова и др., 2005; Кучер и др., 2007а] и, как следствие этого - дрейф генов и «эффект основателя». Доказательством являются единственная найденная мутация в гене окулофарингеальной миодистрофии и выявленный «гаплотип основателя» в локусе гена PABPN1 по данным SNP-локусов. Также, низкий уровень генетического разнообразия в популяциях якутов по сравнению с другими популяциями Евразии, был показан при анализе линий митохондриальной ДНК [Федорова и др., 2003], Y-хромосомы [Пузырев и др., 2003; Харьков и др., 2008; Федорова, 2008], на основании данных о полиморфизме (СТО)п-повторов гена миотонинпротеинканазы в популяциях Республики Саха (Якутия) [Федорова и др., 2003] и локусов Alu-повторов [Степанов, 2002]. На основании данных генетико-эпидемиологических исследований якутского населения обосновано выделение нескольких форм этноспецифической патологии названных "якутскими" наследственными болезнями [Пузырев и др., 2008]. Помимо ОФМД к «якутским наследственным болезням» относят: спиноцеребеллярная атаксия I типа (OMIM 164400) [Коротов, 1994; Зинченко, 2001; Банщикова, 2002; Платонов и др., 2004; Гинтер, 2006; Иллариошкин и др., 2006; Конева и др., 20102], миотоническая дистрофия (OMIM 160900) [Harper et al, 2004; Сухомясова, 2005; Федорова, 2005], наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия I типа (OMIM 250800) [Тарская и др., 2004; Танеева и др., 2006], «якутский синдром низкорослости» или синдром 3-М (OMIM 273750) [Maksimova et al, 2007], аутосомно-рецессивная глухота типа 1А (OMIM 220290) [Barashkov et al, 2011; Барашков и др., 2013], синдром низкорослости с атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов или SOPH-синдром (OMIM 614800) [Maksimova et al, 2010]. Распространённость этих болезней значительно выше, чем в мировом народонаселении. Для каждого заболевания выявлены особенности молекулярной природы, отличающие их от сходных фенотипов в других популяциях, в которых они встречаются значительно реже [Пузырев и др., 2008].

В составе 10 локусных SNP-гаплотипов, у якутов выявлено 3 гаплотипа ассоциированных с мутацией. С учетом блочной структуры неравновесия по сцеплению в пределах блока неравновесия, включающего точку мутации, обнаружен 1 гаплотип (ATCG), сцепленный с мутантным аллелем (GCN)i4, что, возможно, свидетельствует о накоплении мутации в результате эффекта основателя. Вследствие выявленного значительного возраста происхождения мутации (более 3 тыс. лет) и того факта, что гаплотип из 4 наиболее близко расположенных и сцепленных с мутацией (GCN)i4 SNP обнаружен как у якутов, так и русских, можно предположить давнее возникновение мутации на территории Евразии и накопление её у якутов, вследствие эффекта основателя. Появление двух дополнительных гаплотипов по десяти SNP, сцепленных с мутацией в гене ОФМД у больных, может быть обусловлено их возникновением уже на территории Якутии в результате рекомбинации.