Введение к работе
Актуальность.
Изучение процессов внутриутробного развития плода человека в условиях изменяющейся экологии и появления всё большего количества потенциально мутагенных и тератогенных веществ в среде обитания является крайне актуальным (Бочков Н.П.,1989).
Решение этих вопросов особенно важно в медицинской генетике и акушерско-гинекологической практике, поскольку именно эти направления медицины обеспечивают нормальную репродукцию популяции путем профилактики врожденной и наследственной патологии, лечения бесплодия и невынашивания беременности. Для этих целей в акушерстве-гинекологии используется большое количество медикаментозных средств, применение которых может приводить к нежелательным последствиям с точки зрения организма плода (Jacobson В. 1962, Driscoll S.1980, Ivett J. 1981).
В литературе имеется достаточно указаний на то, что половые стероидные гормоны, применяемые в акушерско-гинекологической практике, могут оказывать мутагенное и тератогенное действие на развивающийся организм (Brasken М. 1978, Berger М. 1980, Симпсон Дж. 1985).
Для определения мутагенных эффектов предложен целый ряд тест-систем на микроорганизмах, растениях, насекомых и клетках млекопитающих (Бочков Н.П. 1989). Наиболее приемлемыми для анализа мутагенных эффектов в популяции человека являются динамический учет врождённых пороков развития (ВПР) среди новорожденных и цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови (Бочков Н.П. 1975).
Однако, даже учет частоты и спектра хромосомных аберраций имеет ряд недостатков.
Во-первых, он дает возможность изучать лишь хромосомные аберрации в лимфоцитах, стимулированных к делению митогенами в условиях их культивирования in vitro. Во-вторых, получаемые данные отображают чувствительность постнатальных клеток к повреждающему воздействию, а клетки развивающегося эмбриона могут отличаться от них в этом отношении. В-третьих, этот метод не дает возможности оценить суммарное воздействие фактора и их метаболитов на развивающийся эмбрион человека при действии на организм матери.
Следует подчеркнуть, что именно на 6-12 неделях внутриутробного развития происходит формирование пула митотических клеток, из которых в последствии образуются гаметы (Карлсон Б. 1983).
В последнее время большое внимание, помимо исследования хромосомных аберраций, как критерия мутационных событий, уделяется изучению частоты полиплоидных клеток и метафаз с преждевременным расхождением хроматид (ПРХ) (Atkin N. 1967, Mehes К.1978, Fitzgerald Р.1975,1985, MadanK.1987).
Широкое применение женских половых стероидных гормонов в гинекологической практике с одной стороны, и недостатки имеющихся способов оценки мутагенных эффектов у эмбрионов с другой стороны, сформировали необходимость проведения настоящего исследования.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось : изучить мутагенные эффекты у эмбрионов человека при воздействии микрофоллина на организм беременной. Для достижения поставленной цели решали ряд задач:
1.Изучить частоту приема половых стероидных гормонов женщинами во время беременности.
2.Разработать метод получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека.
3.Изучить частоту и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека в норме и при приеме беременными больших доз микрофоллина.
4.Изучить частоту полиплоидов и клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека а норме и при приеме беременными больших доз микрофоллина.
Научная новизна .
Впервые установлена частота и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека 6 — 12 недели внутриутробного развития без их культивирования in vitro в норме и при воздействии на организм беременной микрофоллина в больших дозах. Показано, что у эмбрионов, перенесших воздействие больших доз микрофоллина частота клеток с хромосомными аберрациями достоверно больше.
Впервые установлено наличие и изучена частота клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека 6 — 12 недель внутриутробного развития. Показано, что частота клеток с ПРХ зависитот пола эмбриона. У эмбрионов женского пола она достоверно выше, чем у эмбрионов мужского пола. Показано,что наличие клеток с ПРХ не связано с присутствием колхицина в питательной среде.
Впервые установлено достоверное повышение частоты клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека при приеме беременными больших доз микрофоллина.
Впервые изучена частота полиплоидных клеток в лимфоцитах эмбрионов человека без их культивирования in vitro. Установлено достоверное увеличение количества полиплоидных клеток у эмбрионов, перенесших внутриутробно воздействие больших доз микрофоллина.
Предложен способ получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека 6-12 недели внутриутробного развития без их культивирования in vitro (отраслевое рационализаторское предложение N881).
Практическая ценность.
Предложен метод получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без их культивирования in vitro Его можно использовать для кариотипирования абортированных эмбрионов человека, для изучения частоты и спектра хромосомных аберраций, исследования состояния отдельных участков хромосом (С-; Ag-полиморфизма) в состоянии in vivo. Предложенный метод обладает рядом преимуществ в сравнении с существующими. Во-первых, отсутствует культивирование клеток in vitro. Во-вторых, нет необходимости в соблюдении стерильности.
Предложенный метод, можно использовать для оценки повреждающего воздействия факторов окружающей среды на различных вредных производствах; в относительно малых коллективах; при возникновении экологического неблагополучия для быстрой оценки возможных его последствий.
Предложен способ оценки мутагенных эффектов в тканях эмбрионов человека при воздействии факторов внешней среды на организм беременной, путем исследования метафазных хромосом в лимфоцитах эмбрионов человека.
Данные о влиянии микрофоллина на генетический аппарат эмбриона человека являются важными для акушерско-пшекологической практики с точки зрения выбора оптимальной терапии на ранних сроках беременности, а также при консультировании женщин, принимавших большие дозы гормональных препаратов.
Внедрение результатов исследования в практику.
Основные результаты диссертации внедрены в практику медико-генетической консультации Львовского МГЦ, Всесоюзного центра радиационной медицины АМН СССР, НИИ наследственной патологии МЗ БССР, а
также Медико-генетической консультации Житомирской области. Получено отраслевое рационализаторское предложение «Способ получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбриона человека без их культивирования in vitro» (N 881). Изданы методические рекомендации: «Хромосомный анализ абортивного материала для оценки возможного мутагенного влияния факторов окружающей среды», Львов, 1990; «Генетический мониторинг населения в связи с загрязнением внешней среды», Львов, 1991.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на 5 -ом съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Вавилова, ноябрь, 1987 г., г.Москва; 5-ом съезде генетиков и селекционеров Украины, июнь, 1986 г., г.Умань; 1-ом съезде медицинских генетиков УССР, март, 1988, г.Львов; конференции молодых ученых Института медицинской генетики АМН СССР, апрель, 1987 г., г.Москва; 22 -ом симпозиуме генетиков с международным участием 28-30 августа, 1989 г., Г.Братислава, Чехословакия.
По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Прием беременными микрофоллина в больших дозах увеличивает частоту клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека.
-
Наличие клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека является онтогенетической нормой.
-
Прием беременными микрофоллина увеличивет количество клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека.
-
Частота клеток с ПРХ связана с полом эмбриона.
-
Прием беременными микрофоллина увеличивает частоту полиплоидных клеток у эмбрионов мужского пола.
-
Предложенный метод получения препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов печени эмбрионов человека без их культивирования in vitro можно использовать для проведения генетического мониторинга популяции в связи с загрязнением внешней среды.
Структура и объем диссертации. ,
Диссертация изложена на 136 страницах. Включает введение, обзор литературы, материал и методы, результаты исследования и их обсуждение, выводы. В работе 7 рисунков, 19 таблиц; список литературы включает 245 работ, из них 14 отечественных и 231 зарубежных авторов.