Введение к работе
Актуальность теки. Одной из актуальних проблем генетики человека является изучение молекулярних основ наследственных заболеваний и их распространения в различных регионах. Предметом исследования в данной работе является р>-талассемия - аутоеомноре-ц&ссивное наследственное заболевение, относящееся к классу гемоглобинопатии, связанное с нарушением биосинтеза ji-глооиновои полипептидной цепи гемоглобина.
По последним оценкам, частота гетерозиготных носителей му-тантиых аллелей р-глобинового гена составляет в среднем в мире около 3 или примерно 150 млн человек (Kazazian, Bohom, 1988). Продолжительность лизин гомозигот, дали? при осуществлении специальной хелатирующей терапии и частых переливаний крови, не превышает 25-30 лет.
Согласно современным представлениям, различные аллели р,-та-лаесемических генов, возникшие в регионах с высокой частотой малярийной инфекции, с течением времени получили широкое распространение под воздействием поломиельного селекционного давлення. Однако количество часто встречающихся аллелей относительно невелико. Краме, того, ісаадая этническая популяция имеет свои специфические типы аллелей. По данным мировой статистики, до G0X всех [Ь-талассемий могут бить описаны 20 аллелями.
Благодаря широкому развитию молекулярно-генетических методов, к настоящему времени охарактеризованы Солее 70 точечных мутаций (ъ-глобшювого гена, приводядах к [і-талассемии (KuUar, 1989), и определены частоты их встречаемости для большинства популяций Средиземноморского и Азиатского регионом. К ряде стран успешно действу»? программы, направленные на определение групп риска, проведение пренаталыюй диагностики [>-талассомии. Но недавним сообщениям, детская смертность, связанная с (у таласеемией в этих регионах, понизилась в 5-Ю раз по отношению к тому урон-ню, который мог бы быть при отсутствии этих предупредительных мер.
Определение спектра р, талассекпччпких ьутнций ьееьмл актуально для накі'.'й страны, так ivtK оу^-отнум' гг-оі раїїичі-ские рітио-ніі с ЕыеокоЛ частстпй r.orpevieMjcni чгсги заОоли.ип'.и. Например, частота носителей;;, тал:\.:се"нче''!'-их генл-. в .\;'еіб-.іиддгш<' д;хти-
ГРЄТ |\1'- («І.!:. ЇСІ-іреЕ, I'f'Jl ('ЛИЛ'.:., ДО її. W К. ] ні!-- ГО ilj ч.-|Ч- Ції
- A -первичный молекулярный дефект был определен лишь у одного' больного, проживающего в этом регионе (С. А. Лимборская, 1987).
До последнего времени анализ мутационных событий в геноме человека требовал конструирования геномных или кДНК-клонотек, выделения искомых генетических, детерминант и их последующего генетического анализа. Методические трудности, возникающие при проведении такого рода исследований, накладывали определенные ограничения на возможности широкого анализа природы генетических дефектов человека. Ситуация принципиально изменилась с созданием метода специфической амплификации ДНК m vitro (полимеразная Цепная реакция - ПЦР), который сделал возможным прямое выделение фрагментов геномной ДНК.
Цель исследования состояла в определений природы мутационных повреждений й-глооинового гена у больных І-талассемией в Азербайджане.
Задачи исследования.
-
Выбрать оптимальную структуру олигонуклеотидных прайме-ров, позволяющих амплифицировать те области 0-глобинового гена, которые характеризуются наибольшей частотой мутационных нарушений.
-
Подобрать условия для ПЦР - амплификации ДНК с использованием термоетаоильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus.
-
Определить мутационные повреждения Ь-глобинового гена прямым секвенированием соответствующих амплифицированних фрагментов ДНК больных -талассемией.
-
Проанализировать встречаемость наиболее распространенных &-т.чласеемических мутаций в Азербайджане с помощью метода ал-лельспецифической гибридизации.
Научная новизна. С помощью аллель-специфической гибридизации и секвеиирования амплифицированних ДНК-фрагментов глобшю-вых генов больных fyталассемией, проживающих в Азербайджане, выявлены мутации в й и 33 кодонах; на границе 82-83 кодонов; в 1-ом, 6-ом и її 0-ом нуклеотидах первого интрона; в. 1-ом нуклео-тиде второго интрона, Делеция гуанозииа на стыке 32-83 кодонов является новой, ранее не описанной, р-талассомиченкой. мутацией.
Практическая значимость. Осуществленная в данной работе первичная характеристика JS-талассемических мутаций позволяет определить группу олигонуклеотидных зондов, необходимых для тестирования гетерозиготного носительства и проведения пренатальної! диагностики этого заболевания в Азербайджане.
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в пяти печатных работах и докладывались на VIII симпозиуме СССР-ФРГ "Genom organization end regulation of gene activity", проходившем в июне, 1989г в Иркутске to. 82); на Симпозиуме европейского биохимического общества (FEBS) "Trends on comparative molecular genetics", проходившем в июле 1989г в Праге (с. 51); а также на первой Всесоюзной конференции "Геном человека", проходившей в октябре 1990г в .Москве (с. 182). Материаш работы отмечены первой премией на конкурсе лучших работ Л11ЯФ АН СССР за 1989г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 13 отечественных и 103 иностранных библиографических источников. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 12 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.