Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1 Наследственная врожденная глухота 13
1.2 Аутосомно-рецессивная глухота 1А типа
1.2.1 Мутации в гене GJB2 (Cx26) 18
1.2.2 Мутации в генах GJB6 (Cx30) и GJB3 (Cx31) и протяженные делеции в локусе DFNB1 19
1.3 Обзор литературных данных по спектру и частоте мутаций гена GJB2 (Cx26) в различных популяциях мира 20
1.3.1 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Европе 23
1.3.2 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Азии 26
1.3.3 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Австралии 28
1.3.4 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Африке 28
1.3.5 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Америке 29
1.3.6 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в России 31
1.3.7 Спектр и частота мутаций гена GJB2 (Cx26) в Якутии 32
ГЛАВА 2 Материалы и методы
2.1 Выборка исследования 35
2.2 Методы клинико-аудиологического анализа 38
2.3 Методы молекулярно-генетического анализа 38
2.4 Методы биоинформационного анализа 47
2.5 Эпидемиологические данные 48
2.6 Статистический анализ 49
2.7 Этический контроль 49
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждениe 50
3.1 Спектр выявленных аллельных вариантов гена GJB2 (Cx26) в Якутии 50
3.1.1 Биоинформационный анализ 56
3.1.2 Частота встречаемости выявленных аллельных вариантов гена GJB2 (Сх26) в Якутии 62
3.1.3 Частота генотипов гена GJB2 (Cx26) в Якутии 65
3.1.4 Частота гетерозиготного носительства мутаций гена GJB2 (Cx26) в популяциях якутов и русских 67
3.1.5 Анализ спектра и частоты мутаций гена GJB2 (Cx26) в Якутии 67
3.2 Оценка вклада мутаций гена GJB2 (Cx26) в этиологию потери слуха в Якутии 69
3.2.1 Вклад мутаций гена GJB2 в этиологию потери слуха в Азии 71
3.3 Поиск мутаций в генах GJB6 (Cx30) и GJB3 (Cx31) и двух делеций с.del(GJB6-D13S1830) и с.del(GJB6-D13S1854) 77
3.3.1 Поиск делеций с.del(GJB6-D13S1830) и с.del(GJB6 D13S1854)
3.3.2 Поиск мутаций в некодирующих районах генов GJB6 (Cx30) и GJB3 (Cx31) белок-кодирующем районе гена GJB6 белок-кодирующем районе гена GJB3 аллельных аллельных аутосомно-аутосомно-врожденными
3.3.3 Поиск мутаций (Cх30)
3.3.4 Поиск мутаций в (Cх31)
3.3.5 Биоинформационный анализ выявленных вариантов в генах GJB6 (Сх30) и GJB3 (Сх31)
3.3.6 Анализ клинической значимости выявленных вариантов в генах GJB6 (Сх30) и GJB3 (Сх31)
3.4 Территориальная распространенность рецессивной глухоты 1А типа в Якутии
3.5 Разработка алгоритма ДНК-диагностики рецессивной глухоты 1А типа у пациентов с нарушениями слуха в Якутии
Заключение
Выводы
Список литературы
- Обзор литературных данных по спектру и частоте мутаций гена GJB2 (Cx26) в различных популяциях мира
- Методы клинико-аудиологического анализа
- Частота встречаемости выявленных аллельных вариантов гена GJB2 (Сх26) в Якутии
- Поиск мутаций в некодирующих районах генов GJB6 (Cx30) и GJB3 (Cx31) белок-кодирующем районе гена GJB6 белок-кодирующем районе гена GJB3 аллельных аллельных аутосомно-аутосомно-врожденными
Обзор литературных данных по спектру и частоте мутаций гена GJB2 (Cx26) в различных популяциях мира
Аутосомно-рецессивная глухота 1А типа (АРГ 1А) - наследственное заболевание, характеризующееся врожденным сенсоневральным нарушением слуха. Аутосомно-рецессивная глухота 1А типа обусловлена мутациями в генах GJB2, GJB6 и GJB3 (OMIM#220290). Как правило, данная форма потери слуха вызывается биаллельными мутациями, находящимися в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии в гене GJB2. Однако, известны случаи, когда данное заболевание может быть вызвано наличием гетерозиготных мутаций, находящихся в разных генах (дигенное наследование). Так, в мире описаны случаи дигенной формы АРГ 1А типа, обусловленной гетерозиготными мутациями в гене GJB2 и в гене GJB6 (GJB2/GJB6), либо в гене GJB2 и в гене GJB3 (GJB2/GJB3) (Richard et al, 1998; Wenzel et al, 1998; del Castillo et al, 2002; Pallares-Ruiz et al, 2002; del Castillo et al, 2003; Feldmann et al. 2004; Seeman et al, 2005; Liu et al, 2009).
Первые результаты исследований по картированию данной формы глухоты были опубликованы в 1994 году. Так, Guilford et al. (1994), провели сравнительный анализ с использованием полиморфных микросателлитных маркеров в двух близкородственных семьях из Туниса с доречевой тугоухостью тяжелой степени. Максимальное сцепление (Lod-балл 9,88 при 6=0,01) было обнаружено с STR-маркером D13S175 на хромосоме 13. Сцепление наблюдалось также с STR-маркерами D13S115 и D13S143, расположенными в области - 13q12. В 1994, Guilford с соавт. назвали данное расстройство как несиндромальная рецессивная глухота, и в последующем использовали символ DFNB1 (Guilford et al, 1994).
Последующие исследования по картированию гена аутосомно-рецессивной глухоты 1А типа, проведенные с помощью различных панелей STR-маркеров во Франции, Испании, Италии, Новой Зеландии и Австралии, также подтверждали наличие сцепления с одним из локусов (DFNB1) 13 хромосомы (Chaib et al, 1994; Maw et al, 1995; Gasparini et al, 1997). В целом стало очевидно, что в локусе DFNB1 может располагаться ген, мутации в котором могут вносить существенный вклад в причину аутосомно-рецессивной глухоты, распространенной среди европеоидных популяций (Chaib et al. 1994; Maw et al. 1995; Gasparini et al. 1997).
В 1997 году Kelsell D.P. и др. убедительно доказали ассоциацию врожденной формы глухоты с мутациями гена GJB2, расположенного в критическом регионе сцепления в локусе DFNB1 (Kelsell et al., 1997). Проведенный авторами гаплотипический анализ c использованием панели STR-маркеров на образцах ДНК пациентов с аутосомно-рецессивной глухотой (DFNB1) показал критическое неравновесие по сцеплению в локусе 13q11-12, расположенном в теломерном участке 13 хромосомы (Kelsell et al., 1997). Геном-кандидатом, локализованном в критическом регионе сцепления был выбран ген GJB2, кодирующий -тип трансмембранного белка -коннексин 26. Выбор именно этого гена был обусловлен тем, что продукт гена GJB2 входит в семейство белков-коннексинов которые создают межклеточные щелевые контакты. У позвоночных организмов была показана экспрессия различных белков этого семейства в тканях улитки (Kikuchi et al., 1995). С помощью ПЦР был амплифицирован кодирующий регион гена GJB2, полученные продукты были просеквенированы. В результате проведенного прямого секвенирования была выявлена гомозиготная нонсенс мутация, приводящая к преждевременному стоп-кодону - p.W77X, а у их нормально слышащих родителей данная мутация была обнаружена в гетерозиготном состоянии. Дальнейшее секвенирование образцов ДНК пробандов из пакистанской семьи с несиндромальной аутосомно-рецессивной глухотой позволило обнаружить другую нонсенс мутацию -р.W24X. Эти исследования впервые показали ассоциацию мутаций гена GJB2 с несиндромальной врожденной формой аутосомно-рецессивной глухоты у человека (Kelsell et al., 1997).
Методы клинико-аудиологического анализа
Все выявленные аллельные варианты были проверены на присутствие в базе данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi). Для предсказания функциональной значимости обнаруженных несинонимичных аминокислотных замен были применены программы: SIFT (http://sift.jcvi.org) (Kumar et al., 2009), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) (Adzhubei et al., 2010), MutationTaster (http://mutationtaster.org) (Flicek et al., 2012) и PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php) (Choi et al., 2015). В анализе использованы референсные аминокислотные последовательности белков Cx30 (NP_001103689.1) и Cx31 (NP_001005752.1) в формате FASTA из базы данных NCBI - Reference Sequence (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Идентификационные коды белков (ЕNSP - Ensembl ID) были получены из базы The Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org) (Uhln et al., 2015).
Визуализация структурной модели белка Cx26 была получена из банка данных пространственных структур белков - Protein Data Bank (PDB) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure). С целью поиска гомологий между белковыми последовательностями и их сравнения использована программа локальных выравниваний - BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Частота встречаемости выявленных аллельных вариантов была получена из данных консорциума the Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute.org), аккумулирующих сведения, полученные из анализа более чем 60 000 экзомов несвязанных родством индивидуумов из различных популяций мира.
Республика Саха (Якутия) является самым крупным субъектом Российской Федерации, расположенным в северо-восточной части Сибири, с общей площадью 3103,2 тыс. км. Республика граничит на западе с Красноярским краем, на юго-западе - с Иркутской областью, на юге - с Амурской и Читинской областями, на юго-востоке - с Хабаровским краем, на востоке - с Магаданской областью и Чукотским автономным округом, на севере с морем Лаптевых и Восточно-Сибирским морем. Республика включает в себя 36 муниципальных образований: 34 муниципальных района (улуса) и два городских округа (ГО «г.Якутск», ГО «Жатай») (http://14.rkn.gov.ru/about/p7613/).
Данные об этническом составе и численности населения каждого муниципального образования получены на основе информации территориального органа Федеральной службы государственной статистики по Республике Саха (Якутия) (http://sakha.gks.ru). По данным Всероссийской переписи населения 2010 г. общая численность населения Республики составляла 958528 человек (64,1% - городское население) с плотностью - 0.31 чел./км2. Этнический состав: якуты - 48,6%, русские - 36,9%, украинцы -2,1%, эвенки - 2,1%, эвены - 1,5%.
В выборке представлены пациенты из 30 различных районов (улусов) Республики. На момент проведения исследований, не было зарегистрировано пациентов с врожденными нарушениями слуха в Нижнеколымском, Эвено-Бытантайском национальном, Аллаиховском, Усть-Янском, Анабарском национальном (долгано-эвенкийский) и Мирнинском районах (улусах) с общей площадью 1111,1 тыс. км и населением 98,1 тыс. человек.
Территориальная распространенность АРГ 1А типа, обусловленная биаллельными GJB2-мутациями, в районах (улусах) была рассчитана на 10 000 человек (расчет произведен только для 22 муниципальных образований с населением более 10 000 человек), а также на общую численность населения.
Для сравнения частот выявленных аллельных вариантов в генах GJB2, GJB6 и GJB3 в исследуемых выборках I и II использовали критерий 2 и точный критерий Фишера (статистически значимым считалось значение при уровне р 0.05). Статистические расчеты проводили с помощью программы BioStat (версия 3.03) (McCraw-Hill, Inc. 1993).
Обследования, предусмотренные рамками данной научно исследовательской работы, проводились после информированного письменного согласия участников или их родителей. Научно исследовательская работа одобрена локальным комитетом по биомедицинской этике при ЯНЦ КМП в 2014 году (г. Якутск, протокол №41 от 12 ноября 2014 г.).
Частота встречаемости выявленных аллельных вариантов гена GJB2 (Сх26) в Якутии
Частота нуклеотидных вариантов гена GJB2 в популяциях мира Данные по частоте встречаемости нуклеотидных вариантов гена GJB2 в популяциях мира, были получены из базы данных консорциума the Exome Aggregation Consortium (ExAC), где на момент исследования была доступна информация о более 200 изменениях в последовательности гена GJB2. Из 12 аллельных вариантов гена GJB2 выявленных в данном исследовании, в таблице 7 представлены сведения по частотам 9 вариантов. Так, наиболее распространенным из патогенных вариантов гена GJB2 оказался c.109G A с частотой 0.006587 (799 из 121300 изученных хромосом), характерный для восточноазиатских популяций (0.07242, 626 из 8644 изученных хромосом).
Приблизительно с такой же частотой 0.00604 (733 из 121352 изученных хромосом) встречался вариант - c.35delG, распространенный среди популяций Европы (среди финских - 868/6614 хромосом; не финских -585/66686 хромосом) и не встречающийся в популяциях Восточной Азии (0/8654 хромосом). Среди «benign» вариантов чаще всех обнаруживался вариант - c.79G A, с частотой 0.04538 (5507 из 121350 изученных хромосом), который преимущественно встречался в популяциях Азии (2518/8632 хромосом) и не был зафиксирован в Европе (0/6614 хромосом). Исходя из данных ExAC, в исследуемых выборках обнаружены варианты гена GJB2, распространенные в основном среди популяций Европы и Восточной Азии, что соответствует демографической характеристике Республики Саха (Якутия).
Таким образом, в Якутии, исходя из данных ExAC, в исследуемых выборках обнаружены аллельные варианты гена GJB2, характерные в основном для популяций Европы и Восточной Азии.
Анализ частоты встречаемости выявленных аллельных вариантов гена GJB2 в Якутии проводился в выборке неродственных пациентов (363 из 393 обследованных индивидов). Доля патогенных вариантов (мутаций) гена GJB2 составила 51.10% от числа исследованных хромосом неродственных пациентов. Среди них были выявлены три наиболее распространенные мутации (аллельная частота 1%): c.-23+1G A (42.28%), с.35delG (5.92%) и c.109G A (1.92%). При распределении неродственных пациентов по этнической принадлежности оказалось, что среди пациентов якутов наиболее частой мутацией была - c.-23+1G A (51.28%), второй по частоте встречалась мутация c.109G A (2.37%), третьей - c.35delG (1.64%). Среди русских пациентов наиболее часто встречались мутации с.35delG (22.34%) и c.-23+1G A (5.31%). У пациентов другой этнической принадлежности были обнаружены только две мутации c.-23+1G A (21.42%) и с.35delG (15.47%) (таблица 8).
На доброкачественные «benign» варианты гена GJB2, не имеющих клинического значения в выборке неродственных пациентов (n=363) пришлось 7.30% всех исследованных хромосом пациентов (таблица 8).
При сравнении с контрольными группами слышащих индивидов, мутации c.-23+1G A и с.35delG в опытной группе встречались достоверно чаще, чем в контрольных группах (p 0.001), что подтверждает их известную ассоциацию с потерей слуха (таблица 8). Следует отметить, что замены c.[79G A(;)341A G] и c.[79G A(;)368С A], предположительно находятся в цис-положении, что ранее было показано в исследованиях других азиатских популяций (Posukh et al., 2005; Tang et al., 2006; Tekin et al., 2010). Кроме того, в нашем исследовании у одного индивида из контрольной выборки замена c.79G A была обнаружена в гомозиготном состоянии в сочетании с с.368G A, что, вероятно, свидетельствует в пользу того, что варианты c.79G A и с.368G A также находятся в цис-положении. Исходя из этого, расчет частот аллельного варианта гена GJB2 c.[79G A(;)341A G] не выявил статистически значимых различий в сравниваемых группах, а аллельный вариант c.[79G A(;)368С A] был обнаружен только в контрольной группе якутов с частотой 1.40% (таблица 8). Таблица 8 - Аллельная частота вариантов гена GJB2 в Якутии №12 3 4 5 6 7 8 Аллельные варианты гена GJB2 Пациенты якуты n=274 Контрольнаягруппа(якуты)n=107 2 p Пациентырусскиеn=47 Контрольнаягруппа(русские)n=80 2 p Пациентыдругих национ.и метисы n=42 Всегопациентовn=363
Примечание: вычисление аллельной частоты GJB2-вариантов проводилось в выборке неродственных пациентов; жирным шрифтом выделены GJB2-аллельные частоты, статистически значимо различающиеся в выборке пациентов и контрольной выборке; АЧ - аллельная частота; wt - дикий тип (норма); - вероятно, находятся в цис-положении на одной хромосоме; - в группу включены пациенты, не являющиеся якутами или русскими, а также потомки от межэтнических браков. 3.1.3 Частота GJB2-генотипов в Якутии
В результате поиска патогенных вариантов в экзонах 1 и 2 гена GJB2 в опытной группе (n=393 пациент) был идентифицирован 21 различный GJB2 генотип, из которых 10 генотипов состоят из биаллельных мутаций (в гомозиготном, или в компаунд-гетерозиготном состоянии). Среди патогенных GJB2-генотипов в общей выборке пациентов наиболее частыми оказались 4 генотипа: с.[-23+1G A];[-23+1G A] (37,9%), c.[ 23+1G A];[35delG] (4,6%), c.[35delG];[35delG] (3,6%) и c.[109G A];[109G A] (1,0%) (таблица 9). При распределении пациентов по этнической принадлежности, среди пациентов якутов самым частым генотипом был с.[-23+1G A];[-23+1G A] (47,9%), вторым по частоте - c.[-23+1G A];[35delG] (2,7%), третьим c.[109G A];[109G A] (1,4%). Среди русских пациентов наиболее частыми были c.[35delG];[35delG] (17,6%), c.[-23+1G A];[35delG] (3,9%) и с.[ 23+1G A];[-23+1G A] (3,9%). У пациентов другой этнической принадлежности и потомков от межэтнических браков (метисы) выявлены три генотипа, из которых чаще встречался c.[-23+1G A];[35delG] с частотой 17,4%, а генотипы с.[-23+1G A];[-23+1G A] и c.[35delG];[35delG] обнаружены с одинаковой частотой 10,9% (таблица 9). В общей выборке пациентов, семь различных генотипов с моноаллельной мутацией гена GJB2, в сочетании с «benign» вариантом, не имеющим клинического значения или «диким» типом последовательности гена GJB2, были обнаружены у 38 (9,6%) пациентов. Четыре различных GJB2-генотипа с вариантами не имеющих клинического значения были обнаружены у 40 (10,2%) пациентов. У 125 (31,8%) пациентов изменений в нуклеотидной последовательности в гене GJB2 не было идентифицировано (таблица 9).
Поиск мутаций в некодирующих районах генов GJB6 (Cx30) и GJB3 (Cx31) белок-кодирующем районе гена GJB6 белок-кодирующем районе гена GJB3 аллельных аллельных аутосомно-аутосомно-врожденными
Выраженная вариабельность территориальной распространенности АРГ 1А типа с разными GJB2-мутациями, может быть связана с различным этническим составом населения районов (улусов). На рисунке 17 показано, что наибольшая распространенность АРГ 1А типа, обусловленная гомозиготной мутацией c.-23+1G A, регистрируется только в центральных и западных районах Якутии, с локальными очагами накопления в Чурапчинском (центральная группа улусов) и Нюрбинском улусах (вилюйская группа улусов), в которых проживает, в основном, якутское население. Интересным представляется то, что эти результаты оказались сопоставимы с результатами реконструкции предкового гаплотипа с мутацией c.-23+1G A, где наиболее рекомбинированные гаплотипы были обнаружены также в центральной и вилюйской группах улусов (Barashkov et al., 2011).
Наибольшая распространенность АРГ 1А типа, обусловленная биаллельной GJB2-мутацией c.35delG, которая чаще всего встречается среди пациентов европеоидного происхождения (Chan et al., 2014; Tsukada et al., 2015), была зарегистрирована в пяти районах - Оймяконском, Нерюнгринском, Ленском и Вилюйском с «эпицентром» накопления в городском округе «г.Якутск», которые являются крупными промышленными районами, с многонациональным составом населения. Таким образом, полученные данные по территориальной распространенности АРГ 1А типа с выявленными очагами накопления в отдельных районах Якутии, в дальнейшем могут быть использованы для проведения медико профилактических мероприятий по предупреждению и снижению частоты врожденных нарушений слуха в Республике Саха (Якутия). Рисунок 17. Территориальная распространенность АРГ 1А типа, обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 с.-23+1G A, на 10 000 населения.
Примечание: - распространенность АРГ 1А типа обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 с.-23+1G A составляет менее 0.1 на 10 000 населения (расчет произведен только в районах с населением более 10 000 человек). Рисунок 18. Территориальная распространенность АРГ 1А типа, обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 c.35delG, на 10 000 населения. Примечание: - распространенность АРГ 1А типа обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 c.35delG составляет менее 0.1 на 10 000 населения (расчет произведен только в районах с населением более 10 000 человек). Рисунок 19. Территориальная распространенность АРГ 1А типа, обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 c.109G A. Примечание: - распространенность АРГ 1А, обусловленная биаллельной мутацией гена GJB2 c.109G A составляет менее 0.1 на 10 000 населения (расчет произведен только в районах с населением более 10 000 человек). 3.5 Разработка алгоритма ДНК-диагностики аутосомно-рецессивной глухоты 1А типа у пациентов с врожденными нарушениями слуха в Якутии
Учитывая, выявленные особенности спектра и частоты патогенных вариантов в гене GJB2 у пациентов с врожденными нарушениями слуха в Якутии, нами разработан регионально-адаптированный подход к рутинной ДНК-диагностике аутосомно-рецессивной глухоты 1А типа (АРГ 1А). Преимуществом данного подхода является разработка оптимального алгоритма ДНК-диагностики, основанного на последовательном поиске наиболее распространенных патогенных вариантов гена GJB2 (c.-23+1G A, с.35delG и c.109G A), с последующим ресеквенированием белок-некодирущей (экзон 1) и белок-кодирующей областей (экзон 2) гена GJB2, а также поиском протяженной делеции с.del(GJB6-D13S1830), позволяющий таким образом детектировать патогенные варианты обуславливающие АРГ 1А в Якутии. На первом этапе алгоритма происходит поиск самого распространенного патогенного GJB2-варианта c.-23+1G A в экзоне 1, затем c.35delG и с.109G A в экзоне 2 гена GJB2. Детекция только этих трех патогенных вариантов гена GJB2 позволит обнаружить до 99% патогенных GJB2 аллелей, встречающихся в Якутии. При выявлении у пациента только одного патогенного варианта или отсутствия из этих трех вариантов, рекомендуется проведение дальнейших поисков мутационных изменений в последовательности гена GJB2 (экзон 1 и экзон 2) с помощью ресеквенирования, что позволит повысить информативность ДНК-диагностики АРГ 1А. В тех случаях, когда в результате ресеквенирования будут обнаружены патогенные варианты в гетерозиготном состоянии, рекомендуется поиск протяженной делеции с.del(GJB6-D13S1830) (309 тпн). В тех случаях, когда в результате каждого этапа поиска патогенных вариантов в гене GJB2, будут обнаруживаться биаллельные патогенные варианты (в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии), диагноз «аутосомно-рецессивная глухота 1А типа» - подтверждается. В тех случаях, когда патогенных GJB2-вариантов не будет обнаружено, можно заключить, что потеря слуха у данного пациента не связана с нарушением нуклеотидной последовательности гена GJB2. Таким образом, использование предлагаемого алгоритма, позволит наиболее быстро и точно подтвердить или опровергнуть у пациента аутосомно-рецессивную глухоту 1А типа, обусловленную патогенными вариантами гена GJB2, рутинным способом. Алгоритм ДНК-диагностики АРГ 1А у пациентов с врожденными нарушениями слуха в Якутии, схематически представлен на рисунке 20.