Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 4
1.1. Горох 4
1.2. Молекулярные маркеры 6
1.2.1. Белковые маркеры 8
1.2.2. Молекулярные ДНК-маркеры 9
1.2.2.1. ПДРФ-маркеры 9
1.2.2.2. Полимеразная цепная реакция 12
1.2.2.3. МААР-маркеры 14
1.2.2.3.1. RAPD-маркеры 15
1.2.2.3.2. AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) маркеры 18
1.2.2.3.3. DAF-маркеры 18
1.2.2.4. STS-маркеры 19
1.2.2.4.1. SCAR-маркеры 19
1.2.2.4.2. СAPS-маркеры 21
1.2.2.4.3. SSR-маркеры 22
1.2.2.5. ДНК-Маркеры с полупроизвольными праимерами 24
1.2.2.5.1. ISSR-маркеры 24
1.2.2.5.2. AFLP-маркеры 26
1.3. Генетические карты сцепления 27
1.4. Количественные признаки 30
1.4.1. Картирование локусов количественных признаков 30
1.4.2. Методы картирования локусов количественных признаков 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1. Исходный материал 37
2.2. Выделение ДНК гороха для ГЩР-анализа 39
2.3. Амплификация ДНК RAPD-методом 40
2.4. Амплификация ДНК ISSR-методом 42
2.5. SCAR-маркеры 42
2.6. AP-PCR-метод 43
2.7. CAPS-маркеры 43
2.7.1. Выделение фрагментов из геля 45
2.7.2. Секвенирование фрагментов 45
2.8. Массовый сегрегационный анализ 45
2.9. Полевые эксперименты 46
2.10. Анализ количественных признаков 47
2.11. Анализ средних значений в ряду поколений 48
2.12. Анализ сцепления 49
2.13. Картирование локусов количественных признаков (QTL) 50
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Отбор линий 51
3.2. Выявление молекулярных маркеров в ДНК гороха 51
3.3. Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров 54
3.3.1. Анализ расщепления по морфологическим признакам 54
3.3.2. RAPD- и ISSR-анализ 55
3.3.3. Анализ расщепления с использованием молекулярных маркеров ... 57
3.4. Локализация гена deh с помощью молекулярных маркеров 61
3.5. Картирование SCAR-маркера, сцепленного с геном ха!8 у гороха 65
3.6. Создание генетических карт сцепления гороха 67
3.6.1. Построение генетической карты сцепления для скрещивания (WL1238 х СЫ115) 68
3.6.2. Построение генетической карты сцепления для скрещивания (WL1238* Флагман) 70
3.6.3. Сравнение маркерных локусов в каждой группе сцепления в двух скрещиваниях гороха 75
3.7. Изучение взаимосвязей компонентов урожая гороха 85
3.7. 1. Анализ коэффициентов путей 85
3.7. 2. Анализ средних значений в ряду поколений 88
3.8. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих компоненты урожая у гороха 90
3.8.1. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х СЫН5) 91
3.8.1.1. Локализация QTL высоты 92
3.8.1.2. Локализация QTL, определяющих признак "число бобов" 98
3.8.1.3. Локализация QTL, определяющих признак "число семян" 98
3.8.1.4. Локализация QTL размера семян 100
3.8.1.5. Локализация QTL признака "вес семян" 101
3.8.2. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х Флагман) 103
3.8.2.1. Локализация QTL высоты 103
3.8.2.2. Локализация QTL длины междоузлий 105
3.8.2.3. Локализация QTL числа бобов 107
3.8.2.4. Локализация QTL числа семян 108
3.8.2.5. Локализация QTL размера семян 108
3.8.2.6. Локализация QTL веса семян 109
Заключение 111
Выводы 119
Список литературы 120
- Картирование локусов количественных признаков
- Анализ средних значений в ряду поколений
- Анализ расщепления с использованием молекулярных маркеров
- Сравнение маркерных локусов в каждой группе сцепления в двух скрещиваниях гороха
Введение к работе
Актуальность проблемы. Методы получения молекулярных маркеров, разработанные в последние десятилетия, позволили решить проблему недостатка морфологических маркеров, используемых для картирования в классической генетике [Tingey et al., 1992; Tanksley, 1993; Yuetal., 1995].
Наличие большого числа молекулярных маркеров, распределенных по всему геному, дает возможность эффективно картировать интересующие исследователей гены. Молекулярные маркеры позволяют избежать в генетическом анализе проблем, связанных с взаимодействием разньж локусов [Tanksley, 1993; Yu et al., 1995]. При использовании данного подхода полностью исключаются эффекты, вызванные влиянием внешней среды [Newbury and Ford-Lloyd, 1993; HahnetaL, 1995].
Генетические карты, содержащие ДНК-маркеры, представляют собой мощные инструменты для генетических и селекционных исследований растений. Благодаря картам сцепления была облегчена характеристика количественных признаков и стало возможным идентифицировать районы генома, содержащие интересующие локусы, и оценить тип их действия на формирование фенотипа [Tanksley 1993].
Для изучения организации геномов растений генетики используют самые разные объекты, имеющие как чисто теоретическое значение (легкость проведения генетических исследований и хорошая изученность), так и практическое значение (важность для сельскохозяйственного использования). К таким, широко используемым генетическим объектам можно отнести и горох посевной.
Горох посевной (Pisum sativum L.) является важной сельскохозяйственной культурой и удобной моделью для генетических исследований. Горох выращивается как продовольственная и как кормовая культура. Главными проблемами выращивания гороха, как производственной культуры, считаются относительно низкий и изменчивый урожай, а также трудности, возникающие при уборке урожая [Hedley and Ambrose, 1985]. Значительный морфологический полиморфизм гороха обеспечил достаточное количество маркеров для первьж генетических исследований и заложил основы построения первых генетических карт [Blixt, 1974].
В настоящее время опубликованы карты хромосом гороха, содержащие молекулярные маркеры (Ellis et al., 1993; Laucou et al.,1998). Благодаря использованию общих маркеров удалось создать «консенсусную» карту хромосом [Weeden et al.,1998], объединившую морфологические и молекулярные локусы. Небольшое число работ по картированию QTL с применением молекулярных i4MKfflffljfftH5SUWAjp)CBsaneabi
I БИБЛИОТЕКА і
!_3щ
2 изучению веса семян (Timmerman-Vaughan et al., 1996], высоты и числа узлов [Irzykowska et al., 2002] и устойчивости к болезням |Timmerman-Vaughan et al., 2002; Klet-Nayel et al., 2002]. Однако, детальная карта хромосом гороха еще не создана, и требуется дополнительный поиск новьж морфологических и молекулярньж маркеров и их локализация.
Цель и задачи исследования. Таким образом, все вышесказанное свидетельствует, что процесс генетического картирования у гороха ведется интенсивно, но требует дополнительных исследований. В связи с этим нами была предпринята работа, целью которой являлся поиск и идентификация новьж молекулярньж маркеров с помощью RAPD-, ISSR-, SCAR- и CAPS-методов, и создание генетической карты для локализации локусов важных качественных и количественных признаков гороха. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Идентифицировать новые молекулярные маркеры в геноме гороха.
Создать генетические карты сцепления гороха для двух скрещиваний (WL1238 х СЫ115) и (WL1238 х Флагман).
С помощью молекулярньж маркеров точно локализовать гены важных качественных физиологических признаков chill5, deh, ха18 и 6 SCAR-маркеров.
Выявить и картировать локусы количественных признаков (QTL), используя созданные карты групп сцепления гороха.
Сравнить созданные генетические карты сцепления друг с другом и ранее опубликованными картами гороха.
Научная новизна.
Выявлены новые полиморфные RAPD и ISSR-фрагменты генома гороха, использованные для построения детальных молекулярно-генегических карт хромосом.
Впервые в России с помощью RAPD, ISSR, SCAR и CAPS-маркеров созданы подробные карты групп сцепления гороха для двух скрещиваний. Созданные карты включают 202 маркера со средним расстоянием между маркерами около 10 сМ. Общая длина карт составляет 1262 и 1008 сМ. &ш карты в дальнейшем могут быть использованы для молекулярно-генегических исследований генома гороха.
Представленные карты групп сцепления гороха по насыщенности маркерами не уступают ранее созданным картам (Laucou et.al. 1998, Irzykowska et al., 2001) и позволяют вести успешную работу по локализации новьж важных локусов качественных и количественных признаков гороха.
С помощью созданных генетических карт впервые точно локализованы на хромосомах гороха новые гены, влияющие на формирование фотосинтетического аппарата (chill5 жха18) и ген, определяющий структуру стебля и соцветий (deh).
На основе построенньж карт впервые в России идентифицированы и локализованы локусы количественньж признаков (QTL), определяющие высоту растений, длину междоузлий, число семян, число бобов, размер семян и вес семян.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты вносят важный вклад в изучение генома гороха и создают предпосылки для быстрой и точной локализации на хромосомах новых генов качественньж и количественньж признаков. Создание детальньк молекулярно-генегических карт гороха облегчает возможность использования молекулярных маркеров в селекционных исследованиях и открывает возможность для вьшвления, клонирования и секвенирования генов, определяющих формирование сложных физиологических и морфологических признаков высших растений. Полученные данные по картированию молекулярных маркеров гороха могут быть использованы в учебной работе со студентами для демонстрации, эффективности ДНК-маркеров в картировании генома растений.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 2-ой международной Ирано-Российской конференции "Сельское хозяйство и природные ресурсы" (МСХА, Москва, 2001); Конференции, посвященной 100-летию соднярожденя А.Р. Жебрака и 70-летию образования генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени КА. Тимирязева (Москва, 2002); Workshop "Application of Molecular Markers in Plants Studies". (Warsaw, Poland, 2002); 3-ей международной Ирано-Российской конференции "Сельское хозяйство и природные ресурсы" (МСХА, Москва, 2002); Sixth Iranian International Statistics Conference (Tehran, Iran, 2002); 9th Iranian Student Seminar in Europe, ISS (Birmingham, Uk., 2002); Conference on Applied Statistics in Agriculture (Kansas State University, USA, 2003); IV международной конференции "Геном растений" (Одесса, Украина, 2003); конференции, посвященной 100-летию начала научной селекции в России (МСХА, Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка
литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая
таблиц и ... рисунок. Список литературы включает. наименования.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 01-04-48080,04-04-48956) и научно-исследовательской программы "Геном растений".
Картирование локусов количественных признаков
Локусы количественных признаков (Quantitative trait loci, QTL) - это районы или местоположения гена/генов, влияющих на признак, измеряемый по линейной количественной шкапе. QTL идентифицируют статистическими методами и интегрируют с генотипическими и фенотипическими данными. Основываясь на позиции маркера на карте сцепления, можно локализовать локус количественного признака на определенном участке хромосомы, согласно уровню статистической вероятности.
Основная идея картирования QTL была известна более 40 лет назад со времени публикации работы Тодей [Thoday, 1961]. Принцип состоял в том, что если генетические маркеры рассредоточены по всему геному изучаемого организма, то сегрегация этих маркеров может быть использована для оценки эффектов, связанных с QTL. При этом возникает возможность картирования и оценки свойств отдельных QTL. Картирование QTL стало реальным в последние 10 лет прошлого века, преимущественно благодаря развитию и применению техники молекулярного маркирования, так как выявление сцепления локусов количественных признаков и молекулярных маркеров обеспечило новый и достоверный метод идентификации QTL. Молекулярные маркеры сегрегируют как единичные гены и не подвержены влиянию внешних условий.
За последнее время был предложен ряд методов картирования и исследования QTL [Edwards et al. 1987; Lander and Botstein, 1989; Haley and Knott, 1992; Jansen and Stam, 1994; Zeng, 1994]. Относительно растений, существует большая потребность в оценке QTL, контролирующих большинство важных агрономических признаков. Развитие методов выявления молекулярно-генетических маркеров и использование их в QTL-анализе стали одним из главных подходов в изучении наследования сложных признаков [Edwards et al. 1987; Paterson et al. 1988].
Картирование QTL требует наличия генетической карты объекта, достаточно плотно заполненой молекулярными и другими маркерами. Картирование - это размещение маркеров (генов, QTL) в порядок, выявляющий относительные расстояния между ними в определенной группе сцепления на основе величины рекомбинации всех возможных пар маркеров. Известно, что для картирования необходимы условия сегрегации и рекомбинации. Метод включает поиск ассоциаций между сегрегирующими молекулярными маркерами и изучаемым признаком в экспериментальной популяции, для определения сцепления между маркерами и QTL. Исходными данными для анализа являются расщепляющиеся популяции F2, поколения возвратных скрещиваний (ВС), популяции рекомбинантных инбредных линий (РИЛ), полученные из единственного семени F2 и близкие к гомозиготности после 5-6 поколений самоопыления, а также серии двойных гаплоидных линий (ДГЛ) или любых расщепляющихся по количественным признакам и по маркерным локусам поколений [Paterson 1995]. Компьютерная программа (обычно Mapmaker/QTL, и другие программы, такие, как MapQTL, QTL Cartographer, MQTL, PLABQTL и MapManager) например Mapmaker/QTL [Lincoln et al., 1993], широко используются для интервального картирования. Эти программы сравнивают полученные расщепления и для каждого района хромосомы вычисляют «степень влияния» на количественный признак. В некоторых районах этот параметр может быть выше, достигая максимума в определенных точках. Если значение «степени влияния» в такой точке превышает порог достоверности, говорят о том, что в данной области располагается ген, влияющий на количественный признак. Обычно таких генов находят от 2 до 10, причем степень их воздействия на признак оказывается различной [Met et al., 2003].
ДГЛ и РИЛ, которые могут быть репродуцированы при помощи самоопыления чрезвычайно полезны для накопления маркеров в течение определенного времени. Эти линии могут быть сформированы в любое, удобное для эксперимента время, с целью получения ДНК, измерения количественных признаков и для завершения молекулярно-генетического картирования. Помимо этого, растения данных линий могут быть помещены в различные условия для анализа взаимодействия генотип-среда. Однако ни ДГЛ, ни РИЛ не могут быть использованы для оценки эффекта доминирования, тогда как простое поколение F2 и потомки возвратных скрещиваний (быстро получаемые в течение 2 генераций) легко позволяют изучать данный эффект.
Методы картирования QTL были успешно использованы на таких объектах, как томаты, кукуруза, арабидопсис, горох, несмотря на разную степень изученности их геномов и типы молекулярных маркеров, составляющих генетические карты данных объектов. Все это говорит в пользу того, что эти методы являются фундаментальным нововведением в генетический анализ.
Небольшое число работ по картированию QTL с применением молекулярных маркеров у гороха посвящены изучению веса семян [Timmerman-Vaughan et al, 1996] высоты и числа узлов на стебле [Irzykowska et al., 2002] и устойчивости к болезням [Timmerman-Vaughan et al., 2002; Pilet-Nayel et al., 2002].
Таким образом, картирование и анализ QTL служат важными моментами для получения новой информации о действии и взаимодействии отдельных генов, помогают улучшить оценки эффективности скрещивания [Mohammadi et al., 2002] и, в конечном счете, являются основой для селекции при помощи маркеров (MAS), при которой наиболее эффективным способом осуществляется перенос желательных генов от одной линии к другой.
Эти методы включают картирование отдельного маркера (single marker analysis) [Sax, 1923; Soller and Brody, 1976; Edwards et al, 1987], интервальное картирование и композитное интервальное картирование (composite interval mapping, СІМ) [Jansen and Stam, 1994; Zeng, 1994] и, таким образом, позволяют провести статистический анализ ассоциаций между фенотипом и генотипом с целью идентификации и понимания роли отдельных районов генома в формировании сложных признаков.
Интервальное картирование (Interval mapping) QTL является наиболее общим методом анализа локусов количественных признаков. Оно основано на методах максимального правдоподобия [Lander and Botstein 1989] или многократного регресса [Haley and Knott 1992]. Интервальное картирование для обнаружения предполагаемого QTL может быть применимо ко всем хромосомам с тем, чтобы выявить вероятность присутствия QTL в различных позициях генома. Компьютерная программа Mapmaker [Lander et al., 1987] широко используется для выполнения интервального картирования у растений. Интервальное картирование, теперь называемое простым интервальным картированием (SIM), ищет отдельные QTL во всем картированном геноме.
Метод максимального правдоподобия [Lander and Botstein 1989] заключается в следующем: если предположить, что QTL расположен между двумя маркерами, то каждый двухлокусный маркерный генотип (т.е. ААВВ, ааВВ, ААвв, аавв для поколения двойной гаплоидной линии) будет содержать смесь QTL-генотипов. Метод максимального правдоподобия включает поиск параметров QTL, которые составляют наилучшее приближение для распределения количественного признака, наблюдаемого для каждого маркерного класса. Модели оцениваются посредством вычисления правдоподобия наблюдаемых распределений с или без учёта QTL эффекта. Позиция QTL на карте определяется, как максимум правдоподобия из распределения значений правдоподобия, т. е. подсчитывают десятичный логарифм (Logarithm of odds, LOD - это отношение величины вероятности наблюдаемой при условии, что два гена сцеплены, к величине вероятности при отсутствии сцепления). Наиболее тесное сцепление между генами соответствует максимальному значению LOD.
Анализ средних значений в ряду поколений
Первоначальный поиск сцепления с интересующим геном велся путем массового сегрегационного анализа (bulked segregant analysis, BSA) [Michelmore et al., 1991]. Данный метод также может быть использован для поиска маркеров, тесно сцепленных с локусами количественных признаков [Wauge and Powell, 1992; Kesseli, Paran and Michelmore, 1993; Tanksley,1993]. BSA позволяет отнести обнаружимые полиморфные маркеры к так называемому "генетическому окну" с максимальным размером не больше чем 40 сМ вокруг интересующего гена [Stackelberg et al. 2003]. Массовый сегрегационный анализ проводили на сегрегирующих популяциях F2 (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман). Индивидуальные растения F2 разделяли на две группы, состоящие из восьми растений каждая. Группы растений различались между собой по аллелям исследуемого гена, распределение же остальных признаков в пределах группы было случайным. Суммарную ДНК каждой группы, а также ДНК родительских растений исследовали на наличие полиморфизма RAPD- и ISSR-методами. Если фрагмент присутствовал в одной смеси ДНК и в ДНК одного из родителей и отсутствовал в другой смеси ДНК и у другого родителя, то предполагалось потенциальное сцепление этого фрагмента с исследуемым геном. Сцепление также предполагалось, если фрагмент был полиморфным у родительских линий, а в разных смесях ДНК значительно различался по концентрации. Сцепление подтверждалось на основе анализа RAPD- и ISSR-методами ДНК индивидуальных растений F2 популяции.
Данные для анализа коэффициентов путей были получены из экспериментов, проводимых в течение 2002 г. на Звенигородской биостанции Московского Государственного Университета. В работе использовали 7 различных генотипов гороха (LWI238, Люпиноид, LW1132, DTR, Флагман, Хамелеон и Chill5), 4 популяции F] (Хамелеон х СЫ115, DTR х Флагман, Флагман х LW1238, Люпиноид х LW1238) и 3 популяции F2 (LW1132 х Люпиноид, DTR х Флагман, Хамелеон х Chil 15). Для этого изучения был использован экспериментальный статистический план - полный рандомизированный блок с четырьмя повторениями. Десять растений в каждом участке (повторении) были случайно выбраны и у них измерены следующие количественные признаки (компоненты урожая гороха): число семян, размер семян (вес 100 семян), число семян на одном бобе, число бобов, число узлов, длина междоузлий и высота растения. Для анализа средних значений в ряду поколений, скрещивали растения LW1238 (Pj) и Chi 115 (Р2), затем растения Fi выращивали для получения F2 и беккроссов (BCiPj и ВСіРг). Полученные поколения выращивали в рамках плана полного рандомизированного блока с четырьмя повторениями в 2002 г. В каждой опытной делянке количество растений варьировало в зависимости от генетической изменчивости изучаемого поколения. Для статистического анализа применяли средние значения признаков в на опытных делянках. Данные анализировали при помощи статистического пакета "SPSS for windows 10". Путевой анализ (анализ коэффициентов путей) был сделан с данными на первичных, вторичных и третичных уровнях компонентов урожая (рис. 2.1).
На первичном уровне два фактора (число семян и размер семян) оказывают влияние на вес семян (следствие), на вторичном уровне зависимая переменная (число семян) определяется двумя причинами (число семян в одном бобе и число бобов). На третичном уровне, число бобов является следствием двух независимых переменных (числа узлов и высоты). В пределах каждого уровня, совместные уравнения были решены для прямых коэффициентов путей (direct path coefficients, PC) с помощью компьютерной программы "SPSS for Windows Ш" (прямые коэффициенты путей в путевом анализе являются стандартизированными коэффициентами в анализе регрессии), а косвенные коэффициенты путей определяли, умножая соответствующий г (коэффициент корреляции) на значение PC. Критерии для идентификации значимости определенного признака (компонент урожая) в воздействии на зависимую от него переменную (урожай) [Board and et al. 1999] заключались в следующем: 1. Наличие положительней корреляции между признаком и переменной ответа (зависимой переменной); 2. Наличие большого положительного прямого эффекта признака на переменную ответа (зависимой переменной); 3. Отсутствие компенсации компонентов урожая; Исследование средних значений признаков в ряду поколений было проведено для определения наследования компонентов урожая у гороха. Данные были проанализированы на основании учета индивидуальных растений при помощи компьютерной программы SPSS. Анализ средних значений признаков в ряду поколений был проведен по данным числа семян, числа бобов и высоты растения, с использованием модели, описанной Мазером и Джинксом [Mather and Jinks, 1977 and 1982]. Модель Мазера и Джинкса учитывает следующие показатели: среднюю величину родителей (ш), аддитивные эффекты (а), доминантные эффекты (d), аддитивные х аддитивные (і), аддитивные х доминантные (j), доминантные х доминантные (I) (таб. 2.7). Наследование рассматривалось в комплексе. Так как аддитивно-доминантная модель не была достаточно информативна, то была подобрана модель с шестью параметрами (рис. 2.2) [Mather and Jinks, 1982].
Анализ расщепления с использованием молекулярных маркеров
Генетический анализ полученных данных позволил выявить в районе гена chill5 десять RAPD-, два SCAR- и два ISSR-маркера (рис. 3.3). RAPD-маркеры К10#830 и К10#950 оказались локализованы близко от гена chill5, на расстояниях от него около 5.4 и 11.6 сМ соответственно. Остальные RAPD-маркеры, Р10#360, ВЗШ420, К10#300, QR2#350, ЕШ900, Е16#530 и R12#340, локализованы на расстояниях 10.1, 24.9, 14.6, 0.1, 2.8, 3.8 и 5.3 сМ друг от друга, соответственно, с той же стороны от chill5, что и RAPD-маркер К10#950. Три RAPD-маркера D6#550, Р1390#1200 и QR1#590 расположены на относительных расстояниях 6.3, 33.2 и 20.2 сМ друг от друга с другой стороны гена chill5 (рис. 3.3). Два тесно сцепленных RAPD-маркера К10#830 и К10#950, вошедших в скрещивание в состоянии отталкивания, в совокупности могут быть использованы как кодоминантный маркер, идентифицирующий гетерозиготный генотип (рис. 3.2). ISSR-маркеры М11#1200 и М9#480 картированы очень близко к RAPD-маркерам Е16#900 и R12#340, соответственно.
Таким образом, найдено 14 RAPD и ISSR-маркеров, сцепленных с геном chill5 гороха. Все маркеры, кроме D6#550, Р1390#1200, К10#950, Р10#360, К10#300, и R12#340 находятся в фазе отталкивания с доминантным аллелем гена сЫ115.
При понижении порога LOD-балла до 2.00 ряд сцепленных с геном chill5 ДНК-маркеров оказался связан с маркерным геном Ь, находящимся в III группе сцепления и определяющим окраску цветка [Weeden et al., 1998]. Для доказательства предположения о принадлежности маркеров к III группе сцепления были использованы три STS-маркера, локализованные заранее в данной хромосоме [Brauner et al., 2002]. Для этих маркеров (Sodmt, TubAl и Rb) был выявлен полиморфизм, соответственно, по сайтам рестриктаз Ksp22I, TaqI и Rsal (таб. 2.6). Подтвержден кодоминантный тип наследования данных маркеров (рис. 3.4). Полученные данные о расщеплении CAPS-маркеров использованы в генетическом анализе популяции гибридов F2. По результатам анализа показано сцепление всех трех маркеров с геном сЫ115 и двух из них (Rb и TubAl) между собой (рис. 3.3).
Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что ген chill5 картирован в верхнем плече III группы сцепления и может быть нанесен на генетическую карту хромосом гороха. С успешной локализацией, данная мутация может быть использована в качестве нового маркера генома гороха в дальнейшей работе по картированию. Изученный фрагмент III группы сцепления занимает около 137.6 сМ со средним расстоянием между маркерами 8.1 сМ.
Два RAPD-маркера D6#550 и К10#950, тесно сцепленных с геном сМ115, ранее были превращены в нашей лаборатории в SCAR-маркеры (Ковеза, 2003). Полученные SCAR-маркеры были использованы в этой же работе (таб. 2.4), и наследовались так же, как и исходные RAPD, по доминантному типу. Для изучения наследования SCAR-маркеров во втором поколении были использованы те же самые индивидуальные растения F2, на которых изучалось наследование исходных RAPD-фрагментов. SCAR-маркеры присутствовали в ДНК тех же самых растений, что и исходные RAPD-маркеры (рис. 3.2 и 3.5).
Таким образом, нами локализованы SCAR-маркеры, которые дальше называются SD6#550 и SK10#950, сцепленные с доминантным аллелем гена сЫ115 в III группе сцепления гороха. Картированные SCAR-маркеры SD6#550 и SK10#950 могут быть использованы в качестве якорных маркеров в дальнейших исследованиях.
Исследованный в данной работе хлорофильный мутант chill5 по фенотипу сходен с описанными ранее мутантами Luml и Lum2, отличающимися от нормальных растений более светлой окраской тканей листа, по сравнению с жилками [Swiecicki 1987]. Гены luml и 1ит2 расположены в III группе сцепления гороха. Осуществленная в данной работе локализация гена chill5 почти совпадает с позицией гена 1ит2, что может свидетельствовать в пользу предположения, что исследованный нами мутантный ген является новым аллелем локуса 1ит2. Однако для подтверждения этого вывода необходим тест на аллелизм.
Идентификация и использование в данной работе новых молекулярных маркеров позволило локализовать их в определенном районе одной из хромосом гороха, который охватывает около 137,6 сМ. В этом районе нам удалось идентифицировать новый ген, обуславливающий хлорофильную недостаточность, 12 RAPD- и 2 ISSR -маркера. Среднее расстояние между идентифицированными маркерами составляет около 8,1 сМ. Такое насыщение отдельного района хромосомы молекулярными маркерами позволило определить сцепление гена chillS с другим морфологическим маркером (геном Ъ) и тем самым выйти на конкретную группу сцепления гороха, в которой расположен исследуемый нами ген и сцепленные с ним молекулярные маркеры. Таким образом, проведенное исследование подчеркивает значение молекулярных маркеров в детальном картировании хромосом гороха и показывает их важную роль в создании единой молекулярно-генетической карты хромосом гороха.
Расположение гена сЫ115 и сцепленных с ним молекулярных маркеров в третей группе сцепления гороха было подтверждено использованием специфических CAPS-маркеров, созданных на основе точно охарактеризованных последовательностей ДНК в других лабораториях [Brauner et al., 2002]. Удачное использование CAPS-маркеров свидетельствует также о возможности успешного применения набора CAPS-маркеров, найденных в разных лабораториях на базе различных скрещиваний, что позволяет значительно расширить ассортимент точно определенных и общеизвестных маркерных локусов.
Приведенные данные позволяют сравнить генетическую длину конкретных участков III группы сцепления с консенсусной картой хромосом гороха [Weeden et al., 199S]. Найденное в нашей работе расстояние между наиболее отдаленными CAPS-маркерами, Rb и Sodmt, составляет 72.6 сМ, в то время как на консенсусной карте оно равно всего 30 сМ [Weeden et al., 1998; Brauner et al., 2002]. Такое большое расхождение в протяженности отдельных районов хромосом, определяемых разными исследователями, часто встречается в генетических исследованиях на горохе и требует специальной проверки.
Полученные результаты представляют определенную ценность как предпосылка для дальнейшего позиционного клонирования гена, участвующего в регуляции синтеза хлорофилла. Кроме того, эти данные дают возможность начать исследования по локализации в данном районе генов количественных признаков.
Сравнение маркерных локусов в каждой группе сцепления в двух скрещиваниях гороха
В результате проведенной работе были созданы генетические карты сцепления для двух популяции F2 (WL1238 х Chi 115) и (WL1238 х Флагман). Эти карты могут быть использованы для дальнейших генетических исследований. По сравнению с опубликованной обобщенной картой мы обнаружали общее увеличение генетических расстояний между отобранными якорными маркерами в данных скрещиваниях (рис. 3.9, ЗЛО и 3.11). Известно, что два основных фактора влияют на фактическую длину карты. Во-первых, это -скрещивание, выбранное для построения карты (чем отдаленнее скрещивание, тем меньше будет общий размер карты). Во-вторых, это и сегрегирующие популяции, или экспериментальные поколения, используемые для создания генетической карты. Кроме того, в построенных картах наблюдали неравномерное распределение районов рекомбинации. Можно предположить, что рекомбинация чаще всего происходит в участках расположения структурных генов [Gill et al., 1996]. Далее описаны результаты сравнения каждой из семи групп сцепления:
Группа сцепления I (LGI): Эта группа включает в себя 12 маркеров (6 RAPD, 2 ISSR, 2 AP-PCR, 1 CAPS и 1 морфологический) в скрещивании (WL1238 х СЫ115), и 17 маркеров 12 RAPD, 1 ISSR, 2 AP-PCR, 1 CAPS и 1 морфологический) в скрещивании (WL1238 х Флагман) (рис. ЗЛ2). Эта группа была отнесена к группе сцепления I консенсусной карты сцепления гороха благодаря якорным локусам СОР-J (CAPS-маркер) и і (морфологический маркер). Однако якорные локусы не были связаны друг с другом. Важно отметить, что порядок расположения общих маркеров (V03#250, АРК1#390, СОР-1 и морфологический маркер і) остается одним и тем же в двух скрещиваниях, за исключением одного ISSR-маркера (М2#400). Кроме того можно сделать вывод, что уровень рекомбинации в верхнем участке этой группы сцепления больше, чем в нижнем. Размеры картируемых популяций вполне достаточны, и это позволяет ожидать достаточно точного определения порядка расположения маркеров и генетических расстояний. Более 80% и 54% интервалов карт в этой группе были короче, чем 10 сМ в скрещиваниях (WL1238 Chi 115) и (WL1238 х Флагман), соответственно. В скрещивании (WL1238 х Chi 115) был найден один RAPD-маркер (Q20#9Q0), сцепленный с геном /, который также был идентифицирован в этой группе сцепления Laucou и Rameau [Laucou et al. 1998; Rameau et al., 1998]. Группа сцепления II (LGII): Эта группа разделена на два участка в каждом скрещивании. После анализа сцепления к этой группе отнесены 21 маркер (16 RAPD, 1 ISSR и 4 морфологических маркера) и 15 маркеров (11 RAPD и 4 морфологических маркера), в скрещиваниях (WL1238 х Chi 115) и (WL1238 х Флагман), соответственно (рис. 3.13). Полученный в результате порядок морфологических маркеров (а, к, wb и s) внутри группы сцепления II, в основном, остался таким же, как и в консенсуснои карте, и расстояния между этими маркерами в обеих картируемых популяциях приблизительно одинаковы.
Некоторые новые молекулярные маркеры (V03#600, D6#790, OS# 1100 и OS#950) были найдены в обеих исследуемых популяциях. Эти локусы, кроме OS#950, расположены в одинаковых позициях на картах для двух скрещиваний. В скрещивании (WL1238 х СЫ115) RAPD-маркер V20#1100, полученный также Laucou и Rameau (1998), находится на расстоянии около 35 сМ от гена а. Группа сцепления Ш (LGIII): В скрещивании (WL1238 х Chi 115) в этой группе сцепления расположены два участка, имеющих 26 маркеров (16 RAPD, 2 ISSR, 2 SCAR, 3 CAPS и 3 морфологических), а во второй карте 13 маркеров (8 RAPD, 1 ISSR, 1 SCAR, 2 CAPS и 1 морфологический) находятся в трех участках (рис. 3.14). Морфологический маркер 1е не показал сцепление в картируемых популяциях, а морфологический маркер Ъ обнаруживал сцепление только в популяции (WL1238 х СЫ115). Порядок расположения новых одинаковых (Р10#360 и QR2#1000) и якорных (Rb, TubAI, Sodmt, b и CipPor) маркеров сохранялся неизменным в обоих изученных скрещиваниях. В этой группе были локализованы два новых гена (chill5 и deh) и три новых SCAR-маркера (SD6#550, SK10#950 и SP474#470). Около 70% и 50% интервалов карт в этой группе были меньше 10 сМ для скрещиваний (WL1238 х Chi 115) и (WL1238 х Флагман), соответственно. Порядок расположения и место RAPD-маркеров Е16#530 и R12#340 на карте (WL1238 х Chi 115) и карте, полученной Laucou и Rameau 1998г. почти одинаковы. Группа сцепления IV (LGIV): В этой группе использовали только один якорный локус (CAPS-маркер, Ssyri), с которым сцеплены три ISSR-маркера (Ml#500, М6Я1400 и М2#300) и два RAPD-маркера (VI#730 и Q20#1550) в скрещивании (WL1238 х Флагман) (рис. 3.15). Рис. 3.15. Сравнение группы сцепления LGIV в двух исследуемых скрещиваниях гороха. Якорные локусы.
Группа сцепления V (LGV): В этой группе сцепления были найдены два и три участка, содержащих 18 маркеров (11 RAPD, 3 ISSR, и 4 морфологических) и 21 маркер (15 RAPD, 1 ISSR, 1 AP-PCR и 4 морфологических), для скрещиваний (WL1238 х Chill5) и (WL1238 х Флагман), соответственно (рис. 3.16). Морфологические локусы г, tl, gp и te использовали в качестве якорных локусов для привязки новых молекулярных маркеров к пятой группе сцепления. Порядок расположения совместных (Q20#420 и В318#150) и якорных маркеров сохранялся неизменным в двух скрещиваниях и соответствовал консенсусной карте. В верхнем конце этой группы находится RAPD-маркер Q20#I 100, который был также найден в том же месте Rameau [Rameau et al.1998]. Одно найденное исключение заключается в том, что RAPD-маркер Х15#800 локализован Laucou et al. в шестой группе [Laucou et al., 1998], но в данной работе он попал в пятую группу сцепления гороха. Значительный интервал между морфологическими маркерами 11 и gp в этой группе сцепления присутствует в обеих исследуемых популяциях и даже увеличивается в размере, по сравнению с консенсусной картой. Этот разрыв, вероятно, связан с недостаточным количеством полиморфных маркеров любого типа в этом районе.