Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Эпидемиология РМЖ и РЯ 14
1.2. Факторы риска развития рака молочной железы и рака яичников 17
1.3. Генетические аспекты процессов репарации, пролиферации и миграции клеток, апоптоза в механизме канцерогенеза РМЖ и РЯ 26
1.4. Функциональная значимость метаболизма стероидных гормонов в развитии РМЖ и РЯ 44
1.5. Малые РНК и их биологическая роль в процессе развития опухолей молочных желез и яичников 52
1.6. Современные методы исследования РМЖ и РЯ 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
2.1. Материалы исследования 62
2.1.1. Характеристика выборки больных РМЖ 62
2.1.2. Характеристика выборки больных РЯ 65
2.1.3 Контрольная группа 66
2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 67
2.2.1 Выделение ДНК из периферической крови 67
2.2.2 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 68
2.2.3. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) 74
2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 75
2.2.5. Метод дискриминации аллелей TaqMan (Gene Expression Assays) 77
2.2.6. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов биосинтеза и предшественников микроРНК с использованием технологии чипа Quan tStudio12K Flex Realime PCR System 78
2.3. Статистические методы 82
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Анализ мутации c.1642 C T (p.Q548X) в гене BLM у больных раком молочной железы и раком яичников 84
3.2. Анализ мутаций c.509 510delGA и c.172-175delTTGT в гене PALB2 у больных раком молочной железы 87
3.3. Анализ мутации c.183delG в гене GPRC5A у больных раком молочной железы 92
3.4. Поиск структурных изменений в кодирующем регионе гена PTEN у больных РЯ и РМЖ из Республики Башкортостан 95
3.5. Изучение структурных изменений гена BRIP1 у больных РЯ и РМЖ 108
3.6. Изучение структурных изменений гена RFWD3 при раке молочной железы 116
3.7. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs7766585 в гене ESR1 с риском развития РМЖ и РЯ 125
3.8. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs741581 в гене PPARGC1B с риском развития заболевания у больных РМЖ и в группе здоровых лиц 138
3.9. Анализ ассоциации полиморфных локусов: rs11671784, rs7205289, rs12975333 в генах микроРНК-27a, микроРНК-140, микроРНК-125a с риском развития РМЖ 147
3.10. Анализ ассоциации полиморфных локусов генов биосинтеза и предшественников микроРНК с риском развития РМЖ и РЯ 151
3.11. Межгенные взаимодействия в формировании предрасположенности к онкологическим заболеваниям молочных желез и яичников 201
Заключение 208
Выводы 214
Список литературы 216
- Факторы риска развития рака молочной железы и рака яичников
- Малые РНК и их биологическая роль в процессе развития опухолей молочных желез и яичников
- Выделение ДНК из периферической крови
- Поиск структурных изменений в кодирующем регионе гена PTEN у больных РЯ и РМЖ из Республики Башкортостан
Факторы риска развития рака молочной железы и рака яичников
Важную роль в возникновении рака молочной железы и рака яичников играет наследственная предрасположенность к заболеванию. Так, до 20-30% всех случаев РМЖ и 5-10% РЯ обусловлено наличием мутаций в определенных генах (Имянитов, 2010; Macrae et al., 2013). Очень важным этапом в изучении молекулярно-генетических основ РМЖ и РЯ стало открытие генов - супрессоров опухолевого роста - BRCA1 (Breast cancer susceptibility gene 1) (Hall et al., 1990) и BRCA2 (Wooster et al., 1995) (Breast cancer susceptibility gene 2), ассоциированных с РМЖ (риск развития заболевания увеличиваются на 56-80% в течение жизни) и РЯ (20-50%) (Pruthi et al., 2010; Norquist et al., 2013; Laraqui et al., 2013). Описано более 1800 и 2000 различных мутаций, полиморфных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 соответственно. Частота и спектр патогенных вариантов варьируют среди населения в зависимости от географического места проживания и этнического происхождения. Приблизительно от 1/400 (1/40 у евреев Ашкенази) до 1/800 лиц в общей популяции могут быть носителями мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (Petrucelli et al., 2010; Brozek et al., 2012; Kluska et al., 2015). Для одних популяций определен широкий спектр структурных нарушений в генах BRCA1 и BRCA2, для других характерен "эффект основателя" (Judkins et al., 2012; Jackson et al., 2014; PDQ Cancer Genetics Editorial Board. Genetics of Breast and Gynecologic Cancers (PDQ): Health Professional Version, 2015). Риск развития злокачественных новообразований молочных желез и яичников у носительниц мутаций в генах BRCA1/2 сохраняется в течение всей жизни. Тем не менее, лишь 5-10% случаев рака молочной железы и случаев рака яичников обусловлены мутациями в этих двух генах (Michils et al., 2012; Oosterwijk et al., 2014).
Нарушения в работе других генов, таких как TP53, CDH1, PTEN, STK11, RAD51C, RAD51D, CHEK2, BRIP1, PALB2, FGFR1, KRAS, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и др. могут также приводить к развитию РМЖ или РЯ (Craig et al. 2012; Mostowska et al. 2013). Продукты этих генов участвуют в процессах репарации, пролиферации, дифференцировки клеток, апоптоза. Большинство из представленных генов ассоциированы с развитием различных наследственных заболеваний, сопряженных с высоким риском возникновения онкопатологии, в том числе РМЖ и РЯ.
Так в семьях, отягощенных наследственными синдромами Ковдена, Баннаяна - Райтли - Рувалькаба, Протеуса, Лермитта-Дуклоса, обуславливаемых структурными нарушениями кодирующего региона гена PTEN - супрессора опухоли, риск возникновения РМЖ и РЯ значительно повышается (Tan et al., 2012; Busa et al., 2013). Дефект в гене PTEN сопровождается инактивацией обоих аллелей, что приводит к остановке синтеза кодируемой фосфатазы, которая является негативным регулятором фосфотидилинозитол-3-киназного пути (PI3K/Akt/mTOR), одного из основных механизмов клеточного метаболизма (Радзинский с соавт., 2012; Pradella et al., 2014).
При исследовании пациентов с редким аутосомно-доминантным заболеванием Ли-Фраумени также отмечается высокий риск возникновения онкологических заболеваний, в частности РМЖ и РЯ. Как известно, причиной развития синдрома Ли-Фраумени служат зародышевые мутации в гене TP53. Аберрации, амплификации, перестройки в данном гене способствуют нарушению синтеза белка, участвующего в клеточной пролиферации, поддержании гомеостаза, апоптозе, что наблюдается в 90% всех случаев возникновения серозных аденокарцином, в том числе РМЖ и РЯ (Shoji et al., 2012; McDade et al., 2014; Kappel et al.,2015).
Биаллельные мутации в гене ATM приводят к развитию наследственного синдрома Атакскии-Теленгиэктазии, для которого также характерен высокий риск возникновения злокачественных новообразований молочных желез и яичников, поскольку нарушаются механизмы репарации ДНК (McKinnon, 2012).
Как показали недавние исследования, высокий риск развития РМЖ и РЯ наблюдается и в семьях, отягощенных генетическим заболеванием - анемией Фанкони (ФА). На сегодняшний день идентифицировано 17 генов данного наследственного синдрома, структурные нарушения в которых приводят к инактивации аллелей, что и является причиной развития патологии (Panneerselvam et al., 2012; Wang et al., 2015; Sawyer et al., 2015). Ряд генетических факторов анемии Фанкони (FANCP/SLX4, FANCN/PALB2, FANCO/RAD51C, FANCJ/BRIP1, FANCG/XRCC9, FANCL/PHF9, FANCQ/ERCC4) обладают хеликазной и эндонуклеазной активностью, являются супрессорами опухолевого роста и вовлечены в процессы репарации двунитевых разрывов ДНК, посредством взаимодействия с BRCA1 и BRCA2, что позволяет рассматривать их в механизме общей сигнальной трансдукции (ФА-BRCA) при онкопатологии молочных желез и яичников (Kee and D Andrea, 2012; Kottemann and Smogorzewska, 2013; Shen et al., 2015).
Поскольку онкологические заболевания яичников и молочных желез являются гормонозависимыми, нарушения механизмов регулирования пула эстрогенов, прогестеронов могут способствовать развитию патологии. Эстрогены действуют в клетке опосредовано, путем взаимодействия с ядерными белками, называемыми рецепторами эстрогена (Estrogen receptors , (ER-, ER-)) и образования комплекса, который впоследствии димеризуется и транслокацируется в ядро. В результате происходит запуск транскрипции в ответ на сигнал гормонов, стимулируя процессы транскрипции генов-мишеней, участвующих в клеточной пролиферации и дифференциации (Ratanaphan, 2012; Tomita et al., 2015). Биологический эффект прогестеронов заключается в механизме активации родственных рецепторов (Progesterone receptors A,B (PR-A, PR B)), выступающих в качестве репрессоров лиганд-зависимой транскрипции эстрогеновых, андрогеновых и глюкокортикоидных рецепторов. Вследствие ядерного и цитоплазматического сигналинга генов прогестеронов происходит образование сложного комплекса, задействованного в работе генетических факторов метаболизма и апоптоза клетки (Brisken & O Malley, 2010; Brisken, 2013; Montazeri et al., 2015).
Существующие модели прогнозирования вероятности развития РМЖ и РЯ отмечают наличие взаимосвязи механизмов клеточного ответа на повреждение и уровня выработки гормонов. Так большая часть молекулярной сигнализации эстрогенов и прогестеронов включает факторы Src/Ras/Raf/MAPK и фосфотидилинозитол-3-киназного путей, первичных посредников роста и пролиферации клеток (Fu et al., 2014; Hayes and Lewis-Wambi, 2015). Структурные нарушения кофакторов, ферментов, а также самих генов эстрогенов и прогестеронов обуславливают накопление спонтанных ошибок в репарации ДНК, что приводит к потере сигнальной трансдукции, опосредованной гормонами и бесконтрольному росту опухоли (Knutson et al., 2012a; Dressing et al., 2014; Suba, 2014; Simes et al., 2015).
Малые РНК и их биологическая роль в процессе развития опухолей молочных желез и яичников
Определенные полиморфные варианты в генах предрасположенности к раку молочной железы, как сообщается, тесно связаны с изменением размеров опухоли и обладают прогностическим значением в маммографии (Liu et al., 2015). В частности, сообщается о полиморфных вариантах в генах, кодирующих белки и энзимы биосинтеза эстрогенов: AKR1C4, CYP1A1-CYP1A2, CYP1B1, ESR2, PPARG, PRL, SULT1A1-SULT1A2 и TNF, а также факторах :ZNF365, AREG, PRDM6, LSP1, TMEM, SGSM3 локализованных в области 12q24, 8p11.23 хромосомы, задействованых в модификации маммографической плотности молочной железы и ответа клеток при использовании гормональных препаратов (Ellingjord-Dale et al., 2012; Stevens et al., 2012; Lindstrom et al., 2013; Rudolph et al., 2015; Thompson et al., 2015).
В настоящее время применяется метод секвенирования нового поколения (NGS), позволяющий обнаружить редкие (специфичные) варианты структурных нарушений в генах- кандидатах предрасположенности к различным заболеваниям (Gorlov et al., 2011; Schaid et al., 2013; Duan et al., 2013). Недавние исследования продемонстрировали, что секвенирование нового поколения весьма полезно для детектирования мутаций в генах предрасположенности к РМЖ, связанных с лекарственной устойчивостью клеток (de Ronde et al., 2013; Lips et al., 2015). Так, при анализе опухолей молочных желез TNBC (Triple negative breast cancer) формы, были обнаружены редкие варианты в супрессорах опухоли TP53, TTN, PIK3CA, TTK, TP53BP2, MCL1, PTEN JAK2, DDR2, PYGO2 и SCYL3 (The Cancer Genome Atlas Project. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours, 2012; Balko et al., 2014; Severson et al., 2015). Практическая значимость NGS отмечается при изучении пациентов с обширными метастазами при РМЖ и РЯ, а именно поиск специфических структурных нарушений в генах HER2, HER3, обуславливающих приобретение клетками устойчивости к препаратам HER2-таргетной терапии (трастузумаба, пертузумаба) (Park et al., 2015; Gonzlez-Alonso et al., 2015). С применением секвенирования нового поколения обнаружены новые мутации в генах BRCA1(c.1952_1953insG) и BRCA2 (c.2547_2548insCC; p.I2675V) у пациенток с наследственными формами заболевания РМЖ из Японии (Hirotsu et al., 2015). Редкие новые генетические изменения были идентифицированы у пациенток с РМЖ из Испании (c.1792delA и c.5869dupA в гене BRCA2) (Hernan et al., 2015).
Высокотехнологичными подходами в экспериментальных исследованиях, на сегодняшний день, являются экзомное секвенирование (ExoME) и анализ транскриптома (Whole Transcriptome Sequencing, WTS), направленных на массовый скрининг всевозможных генетических вариаций в кодирующей части генома (Thomas et al., 2013). Посредством секвенирования экзома производится идентификация структурных нарушений в уже известных генах кандидатах РМЖ и РЯ, а также ведется поиск новых потенциальных маркеров предрасположенности (Birkbak et al., 2013; Xiao et al., 2014; Banerjee and Brosh, 2015). В частности, отмечается вклад обнаруженных полиморфных вариантов гена FANCM в развитии рака молочной железы у пациентов финской этнической принадлежности (Kiiski et al., 2014). Исследования муцинозных опухолей яичников, с использованием данного типа секвенирования, позволили обнаружить специфические соматические мутации в онкогенах и опухолевых супрессорах: KRAS, BRAF, NRAS, TP53, ELF3, GNAS, RAS, p16, а также генетических факторов ремоделирования хроматина ARID1A и ARID2 (Dees et al., 2012; Jones et al., 2012; Sasaki et al., 2013; Jiang et al., 2014; Ellingson et al., 2015;Ryland et al., 2015).
Анализ транскриптома направлен на изучение всех транскрибируемых генов организма при помощи РНК-секвенирования. Метод используется для количественной оценки профиля транскрипции, при которой можно выявить уровни транскрипции "дефектных генов", а также определить аллель-специфичную экспрессию генов и обнаружить новые транскрипты (Romero et al., 2014; Picardi et al., 2015). Недавние исследования продемонстрировали применение РНК-секвенирования в систематическом обзоре генов лекарственной устойчивости опухолевых клеток молочной железы и яичников, идентификации тканеспецифических изоформ белков для диагностики и терапии РМЖ, РЯ (Addou-Klouche et al., 2012; Bakinde et al., 2014; Barrett et al., 2015; Sun et al., 2015). Для решения проблемы систематизации полученных массивов данных более точной детекции и оптимизации, создаются различные базы данных, применяется моделирование событий (Parnell et al., 2011; Gonzalez-Perez et al., 2013). Так одним из крупнейших проектов, на сегодняшний день, является система геномного моделирования (Genome Modeling System, GMS), разработанная на базе Университета Вашингтона (Griffith et al., 2013). Статистическая программа осуществляет анализ данных пациентов с онкологическими заболеваниями, в том числе РМЖ и РЯ, полученных от широкого спектра экспериментальных подходов (GWAS, NGS, анализ транскриптома, секвенирование экзома), включая интерпретацию результатов технологии "MedSeq" (Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma, 2011; Comprehensive molecular portraits of human breast tumours, 2012;Griffith et al., 2015). Основным преимуществом проекта в сфере здравоохранения, как отмечается, выступает "объединённая интеграция метаданных", поскольку программа обеспечивает хранение и индексацию результатов отдельных исследований больного, что позволяет сконструировать более полную картину возможного механизма развития опухоли (Danecek et al., 2011; Li , 2011; McGaugh et al., 2014).
Выделение ДНК из периферической крови
PALB2 (Partner and localizer of BRCA2) - партнер и локализатор BRCA2 играет центральную роль в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК, путем гомологичной рекомбинации, устранении ошибок репликации (Xia et al., 2006). Протеин PALB2 непосредственно взаимодействует с продуктами генов BRCA1 и BRCA2, формируя белковый комплекс, необходимый для восстановления ДНК (Sy et al., 2009). Первоначально, изучение функций гена PALB2 в клетке позволило установить, что зародышевые мутации в нем встречаются крайне редко, и приводят развитию наследственного заболевания- анемии Фанкони формы N (FANKN) (Xia et al., 2007). Данная форма патологии фенотипически схожа с клиническим проявлением анемии Фанкони типа FANKD1, развитию которой способствуют структурные нарушения гена BRCA2 в гомозиготном состоянии, что объясняется, непосредственно, близким расположением обоих белков (Reid et al., 2007). Кроме того, у носителей мутаций в гене PALB2 в гетерозиготном состоянии, также как и в гене BRCA2, увеличен риск возникновения различных онкологических заболеваний, в том числе РМЖ и РЯ (Poumpouridou & Kroupis, 2011). Экспрессия протеина PALB2 оказывает влияние на работу BRCA2, а нарушения в его функционировании, связаны с нестабильностью генетического аппарата клетки, процессами бесконтрольной пролиферации, лежащей в основе механизма онкогенеза (Frankenberg-Schwager & Gregus, 2012; Pauty et al., 2014).
В настоящее время опубликовано большое количество работ, результаты которых свидетельствуют о наличии 2-9 кратного риска развития онкопатологии молочных желез, связанного с повреждением гена PALB2 (Obermeier et al., 2015; Li et al., 2015). Так, изучение гена PALB2 в развитии рака молочной железы у больных финской этнической принадлежности позволило идентифицировать делецию c.1592delT у 1% женщин. Пациентки не имели положительной семейной истории заболевания. В группе пациенток с наследственной формой РМЖ частота данной мутации составила 2,7%. Было показано, что риск развития рака молочной железы у носительниц мутацией c.1592delT в гене PALB2 увеличивался в 6 раз и был сопоставим с таковыми показателями для мутаций гена BRCA2, идентифицированных в Финляндии (Erkko et al., 2008). В работах канадских исследователей, также выявлена ассоциация мутации c.2323C T (p.Glu775X) гена PALB2 с риском развития РМЖ у женщин без наследственной предрасположенности (Foulkes et al., 2007). Исследования, направленные на обнаружение мутаций, связанных с потерей функции белка PALB2 продемонстрировали существование повышенного риска развития рака молочной железы у пациенток с семейной историей заболевания из разных стран. Частоты патогенных вариантов в гене PALB2 в разных популяциях варьирует от 0,6% до 3,9% (Antoniou et al., 2014).
Мутации в гене PALB2, обнаруженные у больных РМЖ, были также идентифицированы у женщин с РЯ. В работе Erkko с соавт. мутация c.1592delT в гене PALB2 выявлена у больных раком яичников из Финляндии (0,5%). В финской популяции частота данной мутации составляет 0,2% (Erkko H. et al., 2007).
Обнаружена делеция двух нуклеотидов c.509_510delGA в гене PALB2 у больных РЯ из Польши. Данная мутация обуславливает преждевременное образование стоп-кодона в 4 экзоне гена PALB2, в результате нарушается синтез белка, в области C-концевого домена, главной особенностью которого является наличие WD40 мотивов, необходимых для формирования белок-белкового взаимодействия PALB2/BRCA2 для определения локализации последнего в местах двунитевых разрывов ДНК. Частота c.509_510delGA в гене PALB2 в группе польских больных РЯ составила 0,6%, в контрольной выборке – 0,1%. Примечательно, что одна из носительниц делеции c.509_510delGA, также имела герминальную мутацию в гене BRCA2 (Dansonka-Mieszkowska et al., 2010). Большинство изученных мутаций в гене PALB2 у больных раком, приводят к потере своей активности белка (Rahman et al., 2007; Bogdanova et al., 2011).
В нашей работе проведен анализ мутации c.509_510delGA в гене PALB2 у больных раком молочной железы (n=1060) и в группе здоровых лиц (n=1069). Для исследования использован метод анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью. Образцы, с изменениями в кривых плавления в дальнейшем были секвенированы (рисунок 25, 26).
Поиск структурных изменений в кодирующем регионе гена PTEN у больных РЯ и РМЖ из Республики Башкортостан
Данный тип взаимодействия группы протеинов PIWI (известны до 4 белков) и малых РНК, чаще всего идентифицируются в клетках зародышевой линии, однако, совсем недавно была описана функциональная роль данных белков PIWI в развитии рака (Esteller, 2011; Mei et al., 2013). В частности, сообщается о коррелировании уровня экспрессии протеинов PIWIL1 (p=0.0228), PIWIL2 (p=0.0015), и PIWIL4 (p=0.0028) с клинической стадией рака почки. Низкие уровни экспрессии данных генов в клетке обуславливают ухудшение общей выживаемости у пациентов с карциномой почек (Iliev et al., 2016). Кроме того, недавнее изучение биогенеза PIWI- взаимодействующих РНК в клеточных линиях рака молочной железы, продемонстрировало специфичную экспрессию более чем 100 видов пиРНК (Hashim et al., 2014). Экспериментальные исследования клеточных линий в норме и патологии показали, что значительная часть пиРНК реагирует на изменения уровня гормонов, а именно экспрессия некоторых из них сопряжена с выработкой рецептора эстрогена (Er),-фактора транскрипции, контролирующего пролиферацию и другие ключевые функции в клетках молочной железы (Paris et al., 2011;Grober et al., 2011). Другим участником механизма регуляции процессинга микроРНК, в качестве "белка группы AGO" является продукт гена DDX20, также известный как GEMIN3. Белок DDX20 принадлежит к семейству семейству DExD/H белков (Dhx9, Ddx20, Ddx5 и Ddx17), отличается наличием нескольких консервативных мотивов, которые включают характерную последовательность DExD/H . Данный протеин содержит в себе консервативную область из аминокислот Asp-Glu-Ala-Asp, позволяющую ему взаимодействовать РНК, с последующим изменением вторичной структуры последней на стадиях инициации и трансляции, обеспечивать процесс правильной сборки сплайсом (Mourelatos et al., 2002). В настоящее время, также сообщается о гене RAN (RAS-related nuclear protein), кодирующим небольшой белок G, необходимый для образования специфического протеинового комплекса транслокации микроРНК из ядра в цитоплазму клетки. Белок RAN обладает GTP-зной активностью, и посредством рецепторного механизма воздействует на уровень экспорта микроРНК (Sazer & Dasso, 2000). Поэтому, вполне возможно, что мутации в гене RAN играют существенную роль в развитии патологии, и связаны с изменением уровня экспрессии микроРНК. Последние исследования продемонстрировали участие RAN в качестве модулятора сигнального пути PI3K, который опосредует инвазию раковых клеток и процесс метастазирования опухоли. Так, результаты изучения клеточных линий колоректального рака показали, что высокий уровень экспрессии белка RAN способствует агрессивному течению заболевания, путем образования метастаз с участием лимфатической системы, увеличением инвазии (Fan et al., 2013; Cho et al., 2015).
Результаты ассоциативных исследований с онкологическими заболеваниями широко представлены в литературе. Например, Hu с соавт. сообщают, что полиморфный локус rs11614913 (n.78C T), находящийся в области предшественника микроРНК -196A2, является маркером повышенного риска возникновения рака легких у китайцев. Отмечается, что у больных раком легких с генотипом C C полиморфного варианта rs11614913 риск летального исхода значительно увеличивается (hazard ratio HR = 1.76; 95% CI: 1.34–2.32) (Hu et al., 2008). Генотип C C локуса rs11614913 также выступает в качестве маркера повышенного риска агрессивного течения рака глотки, толстого кишечника и молочной железы (Hu et al., 2009; Christensen et al., 2010; Min et al., 2012).
Ye с коллегами оценили влияние 41 полиморфного варианта (в 26 микроРНК) на развитие рака пищевода. Обнаружена ассоциация полиморфного варианта rs6505162 (c.-49+302A C) с пониженным риском развития рака пищевода. Аддитивная модель продемонстрировала, что аллель С встречается в меньшей степени у больных с онкопатологией пищевода, нежели в группе контроля (OR = 0.64; 95% CI: 0.51–0.80, P 0.0001) (Ye et al., 2008). В исследовании пациенток с раком молочной железы из Австралии, также была выявлена ассоциация локуса rs6505162 с пониженным риском развития заболевания (OR = 0.50; 95% CI: 0.27–0.92) (Smith et al., 2010). Полиморфный вариант rs6505162 расположен в области предшественника малой РНК 423-5p, локализация которого совпадает с первым интроном гена NSRP1 (nuclear speckle splicing regulatory protein 1), в котором также находятся предшественник микроРНК-3184-3p. «Ядерные вкрапления», как известно, представляют собой хранилища регуляторных факторов сплайсинга мРНК, в связи с чем, уделяется особое внимание исследованию полиморфных локусов предшественников микроРНК в данных регионах. Так, в работе Miyamoto с соав. описано взаимодействие малых РНК-423-5p и -3184-3p с возможным образованием паттернов, взаимостабилизирующих друг друга при сердечно-сосудистых заболеваниях (Miyamoto et al., 2015).
Наряду с изучением SNP в области предшественников микроРНК, большое количество работ направлено на изучение ассоциации полиморфных локусов генов биогенеза микроРНК. Проведен мета-анализ по изучению мутаций в генах Drosha, DGCR8, XPO5, RAN, DICER1, TARBP2, AGO1, AGO2, GEMIN3, GEMIN4 и HIWI (PIWIL1) у больных онкопатологией почек (Iuliano et al., 2013). При анализе 41 полиморфного варианта при изучении рака почки статистически достоверные результаты были получены для SNP- rs7813 и rs910925, расположенных в области гена GEMIN4, связанных с повышенным риском летального исхода (в 1,74% раз, 95% CI: 1.15–2.62), в то время как полиморфный локус rs3744741 был ассоциирован с пониженным риском смерти пациентов от рака почки (HR = 0.39; 95% CI: 0.19–0.77) (Lin et al., 2010).
Проведены исследования, по изучению связи между 41 полиморфными локусами генов биогенеза микроРНК и общей выживаемостью пациентов с раком молочной железы. Обнаружены полиморфные варианты rs1057035 в гене DICER1, rs11786030 и rs2292779 в гене AGO2, ассоциированные выживаемостью женщин с патологией молочных желез, а также локусы rs4759659 и rs11060845 в гене PIWIL1, вариант rs9606250 гена DGCR8, ассоциированные только с безрецидивной выживаемостью пациента. rs874332 в гене DROSHA и rs4968104 в гене GEMIN4 вовлечены только в общий прогноз для больного (Liu et al., 2012).
Ассоциативные исследования полиморфных локусов генов биогенеза и предшественников микроРНК были проведены при изучении рака яичников. Осуществлен мета-анализ 238 полиморфных локусов, расположенных в 8 генах биосинтеза малых РНК и 134 микроРНК, содержащих сайты связывания с генами системы репарации ДНК, обуславливающих возникновения рака яичников (Liang et al., 2010). Выявлены полиморфные локусы rs2740351 и rs7813 в гене GEMIN4, ассоциированные с низким уровнем риска возникновения РЯ (OR = 0.71; 95% CI, 0.57–0.87) и (OR = 0.71; 95% CI, 0.57–0.88), соответственно. Необходимо отметить, что область локализации rs2740351 (c.409-319G A) находится отдаленно от 5 -UTR региона гена GEMIN4 и совпадает с областью интрона гена FAM57A (family with sequence similarity 57 member A), продукт которого вовлечен в канцерогенез легких (Liang et al., 2010).
Таким образом, изучение роли полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК в развитии онкологических заболеваний представляется актуальной задачей исследований.
Совершенствование технологий детектирования генетических изменений позволяют нам применять чип-системы со специфичным набором полиморфных вариантов для их анализа с высокой точностью и производительностью.
С использованием технологии Quant Studio12K Flex Realime PCR System нами генотипирован 31 полиморфный вариант, которые представлены в таблице 20 (рисунок 65). Выборка больных РМЖ составила 823 человек, пациентов с РЯ - 274 и контрольной группы - 785.