Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы.
1.1. Клинико-эпидемиологические особенности болезни Паркинсона.
1.2. История изучения болезни Паркинсона.
1.3. Молекулярные основы болезни Паркинсона.
1.3.1. Аутосомно-доминантная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене PARK1.
1.3.2. Аутосомно-рецессивная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене PARK2 .
1.3.3. Аутосомно-доминантная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в генах PARK3 и PARK4.
1.3.4. Аутосомно-доминантная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене PARK5,
1.3.5. Аутосомно-рецессивный паркинсонизм, сцепленный с локусом 1р35-36 (PARK6).
1.3.6. Аутосомно-рецессивный паркинсонизм, сцепленный с локусом 1р36 (PARK7).
L3.7. Аутосомно-рецессивный паркинсонизм, обусловленный мутациями в локусе 12pll.2-ql3.1
1.4. Участие нарушений митохондриального генома в развитии болезни Паркинсона.
1.4.1. Разнообразие мтДНК в популяциях Западной и Восточной Евразии.
1.4.2. Нарушение дыхательной функции митохондрий.
1.4.3. МФТП и его связь с болезнью Паркинсона.
1.4.4. Окислительный стресс и болезнь Паркинсона.
1.4.5. Митохондриальные нарушения и гибель клеток. 1.5. Болезнь Паркинсона и факторы окружающей среды .
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования.
11. 1. Материал для исследования. ІІ.2. Методы исследования
11.2.1. Выделение геномной ДНК.
11.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. II.2.3.SSCP-анализ.
11.2.3. 1. SSCP со щелочной денатурацией. П.2.4. Полуколичественная ГЩР.
11.2.5. Определение последовательности нуклеотидов. II.2.6. Методы изучения полиморфизма мтДНК .
1.1.3. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
111.1. Анализ мутаций в генах PARK1, PARK2 у пациентов с болезнью Паркинсона и в контрольной группе.
111.2. Анализ мтДНК у пациентов с болезнью Паркинсона и в контрольной группе.
111.З. Анализ ассоциаций полиморфизма генов аполипопротеина Е (АРОЕ), Alu-инсерции (Yb8NBC36) гена калиевого канала KCNJ6, гена глутатион- S-трансферазы Ml (GSTM1), гена семейства цитохромов Р-450 (CYP1A1) с развитием БП.
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
- Аутосомно-рецессивная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене PARK2
- Аутосомно-рецессивный паркинсонизм, сцепленный с локусом 1р36 (PARK7).
- Митохондриальные нарушения и гибель клеток. 1.5. Болезнь Паркинсона и факторы окружающей среды
- Определение последовательности нуклеотидов. II.2.6. Методы изучения полиморфизма мтДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Болезнь Паркинсона (БП) -нейродегенеративное заболевание, манифестирующее чаще всего в возрасте старше 50 лет. Основными клиническими признаками БП являются брадикинезия, ригидность и тремор покоя, по мере прогрессирования заболевания присоединяются постуральная неустойчивость, вегетативные расстройства и когнитивные дисфункции. В основе заболевания лежат дегенеративные изменения, в основном, в дофаминергических нейронах компактной части черной субстанции ствола головного мозга, и, как следствие, - снижение поступления в них двигательного нейромедиатора дофамина.
Согласно современным представлениям, главным патогенетическим механизмом гибели дофаминергических нейронов является повышенный уровень апоптоза, обусловленный развитием в клетках окислительного стресса. Окислительный стресс, в свою очередь, может возникать здесь в результате двух основных патологических процессов - 1) нарушения внутриклеточной убиквитин-зависимой деградации поврежденных белков, что ведет к накоплению их оксидативно опасных форм; 2) блокады митохондриального комплекса I, приводящей к снижению содержания в клетках АТФ и последующему уменьшению образования глутатиона -универсального антиоксиданта ЦНС, что также ведет к накоплению в клетках свободных радикалов, источниками которых могут являться различные эндо- и экзонейротоксины.
Согласно данным эпидемиологических исследований, конец XX -начало XXI века характеризуется значительным ростом числа пациентов с болезнью Паркинсона. В вопросах этиологии и эпидемиологии болезни Паркинсона остается много неясных вопросов, что связано как с существованием нескольких форм заболевания, так и с трудностью его
первичной диагностики и смертности, обусловленной, в свою очередь, развитием болезни у лиц старшей возрастной группы, уже отягощенных разнообразной соматической патологией. В то же время паркинсонизм занимает одно из центральных мест среди заболеваний центральной нервной системы и в настоящее время является растущей национальной проблемой.
Болезнь Паркинсона занимает второе место по распространенности среди нейродегенеративных заболеваний после болезни Альцгеймера. Его частота в разных странах неодинакова, может достигать иногда 1% населения, а среди лиц пожилого возраста - 2 - 4 % [Голубев В.Л. с соавт., 2000]. Распространенность БП в Башкортостане составляет 28,5:100 000 населения, что, в среднем, соответствует частоте заболевания в Европе. Общей тенденцией в наиболее крупных странах является увеличение за последнее десятилетие общего количества больных паркинсонизмом.
Медленный, но неуклонно продолжающийся рост заболеваемости, все еще недостаточная эффективность лечения, прогредиентное течение, а также тяжелая инвалидизация, наступающая в конце концов у большинства больных, - все это превращает паркинсонизм в серьезную социальную проблему, требующую всестороннего и интенсивного изучения.
Еще до недавнего времени болезнь Паркинсона не считалась наследственной, и исследования первоначально были фокусированы на факторах риска окружающей среды, таких как инфекции и нейротоксины. Однако в последние годы, на основании данных о семейной агрегации и близнецовых исследований, был подтвержден генетический вклад в этиологию болезни Паркинсона.
В большинстве случаев болезнь Паркинсона носит спорадический характер и имеет многофакторную природу с определенной генетической предрасположенностью. Существуют и моногенные формы заболевания. По различным оценкам, семейную историю имеют 10-20 % больных [Duvoisin
R, 1981, 1998; Gasser Т., 1998; Elbaz A et al., 1999], а вероятность развития БП у родственников больных с 1-й степенью родства в 2-3 раза выше, чем в общей популяции [Polymeropoulos М. et al., 1996].
В настоящее время картировано 11 генных локусов, связанных с отдельными наследственными формами БП, отличающимися по типу наследования, возрасту манифестации и характеру прогрессирования заболевания; в четырех из них идентифицированы гены [Polymeropoulos М.Н., 1996, 1997, 1998; Kitada Т., Asakawa S.,1998; Gasser Т. et al., 1998]. Кроме того, существуют семьи с наследственными формами БП, в которых связь заболевания с известными локусами исключена [Gwinn-Hardy K.A.et al.,2000]. Все идентифицированные гены, непосредственно или косвенно, связаны с функционированием системы убиквитин-зависимого протеолиза.
Среди известных наследственных форм БП несколько более изученными на сегодняшний день являются аутосомно-доминантная БП, связанная с геном а-синуклеина (PARK1), для которой пока известны только две мутации, обнаруженные в нескольких семьях греческого, итальянского и немецкого происхождения; и аутосомно-рецессивная ювенильная БП, обусловленная мутациями в гене белка паркина, обозначенного как PARK2. Спектр и частота мутаций в гене PARK2 в разных популяциях различны [Hattori N., Matsumine Н., Asakawa S. et al.,1998; Kitada Т., Asakawa S., Hattori N. et al., 1998; Lucking et al., 1998; Scott W.K., Rogala A.R., Rampersaud E. et al., 2000; Imai Y., Soda M., Hattori N. et al., 2001; Сломинский П.A., Милосердова O.B., Попова C.H. и др., 2003].
; При изучении генетической предрасположенности к спорадическим формам паркинсонизма рассматриваются гены, участвующие в детерминации процессов детоксикации различных эндогенных или экзогенных нейротоксинов (гены суперсемейства цитохрома Р-450 -CYP1A1, CYP2D6, глутатион-8-трансфераз (GSTM1), гены, участвующие в контроле дофаминового метаболизма (DRD2, DRD3, DRD4, DRD5), а также
генії, задействованные в устранении свободных радикалов (SOD1, SOD2) [Smjith С. et al., 1993; Armstrong M.et al., 1992; Kondo I. et al, 1993, 1998; Lucotte G. et al, 1996; Bandmann O. et al.,1998].
В соответствии с гипотезой о нарушении активности митохондриального комплекса I при БП исследуются гены мтДНК, кодирующие как субъединицы комплекса I, так и другие гены, связанные с функционированием системы окислительного фосфорилирования. Доказано, что! респираторная недостаточность приводит к образованию высркотоксичных свободных радикалов (ROS), которые повреждают митохондрии и мтДНК. Поскольку митохондрии обеспечивают клетки энергией, необходимой для их жизнедеятельности, а кроме того, являются главным источником высокотоксичных свободных радикалов, в результате действия которых возникает окислительный стресс, ускоряющий процесс разрушения клеток [Schulz J.B, Lindenau J, Seyfriend J. et al, 2000], считается, что митохондрии играют ключевую роль в развитии многих нейродегенеративных заболеваний и старения [Harman D, 1972; Richter С, Park J.W, Ames B.N, 1988; Wallace D.C.,1992; Wallace D.C, Shoffher J.M, Brown M.D.et al. 1999; Wallace D.C, Shoffher J.M, Watts R.L, 1992; Wallace D.C, Lott M.T, 2002]. Однако, эти исследования до сих пор остаются на стадии разработки и требуют дальнейшего продолжения, подразумевающего определение мутаций в генах мтДНК, характера распределения частот гапдогрупп мтДНК в различных этнических группах и в группах больных с учетом этнической принадлежности.
ІВ настоящее время интересным новым подходом является использование полиморфизма Alu-повторов в поиске генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям. Известно, что инсерции Alu-элементов в геноме человека являются причиной приблизительно 0,3% всех генетических заболеваний человека. Среди
многочисленных заболеваний, связанных с ретропозицией Alu-элементов можно выделить следующие: синдромы Леш-Нихана, Тея-Сакса, синдром XX у мужчин и многие другие [Deinenger P.L., Batzer М.А., 2002]. Ведется поиск Alu-элементов, которые могут быть задействованы в развитии нейродегенеративных заболеваний.
В целом, проблема генетической предрасположенности к БП еще далека от разрешения. Требуют дальнейшего изучения вопросы о числе и механизмах функционирования генов, детерминирующих наследственные формы заболевания, о спектре клинических симптомов при различных генетических нарушениях, а также о генах-кандидатах для спорадических форм БП. Учитывая, что спорадическая форма БП является преобладающей, поиск генов-кандидатов, причастных к ее развитию, особенно важен.
Исходя из имеющихся сведений о механизмах патогенеза заболевания, при поиске генов-кандидатов спорадической БП обоснованы такие подходы, как скрининг известных и поиск новых мутаций в генах, обусловливающих наследственные формы БП (т.к. до сих пор малоизученными являются вопросы, касающиеся механизмов функционирования выявленных генов, а также спектра и значения существующих в них мутаций, их свойств, таких, как доминирование и пенетрантность) и анализ ассоциаций с полиморфизмами других генов, связанных с различными специфическими для БП и универсальными системами функционирования клеток. При этом одним из важных требований к таким исследованиям является учет этнической принадлежности обследуемых групп.
Исходя из этого, целью нашей работы являлось определение роли ряда генов ядерного и митохондриального геномов в развитии спорадической БП.
В соответствие с целью были поставлены следующие задачи: 1. Провести скрининг мутаций Ala53Thr и АІаЗОРго в гене PARK1 у пациентов с БП из Башкортостана.
Провести поиск мутаций в гене PARK2 у пациентов с БП и в контрольной группе.
Провести анализ ассоциации БП с генами GSTM1, СУР1А1, АРОЕ.
Оценить частоту Alu-инсерции Yb8NBC36 в гене калиевого канала KCNJ6 у пациентов с БП и в контрольной группе.
5. Провести анализ мтДНК у пациентов с БП и в контрольной группе,
включающий:
а) определение гаплогрупп мтДНК у больных и в контроле;
б) поиск мутаций в гене цитохрома Ь.
Научная новизна исследования.
Впервые в республике Башкортостан создана коллекция ДНК пациентов с БП. Проведен анализ генов PARK1, PARK2, в результате которого у двух неродственных пациентов русского происхождения со спорадической БП впервые обнаружена делеция 12 экзона гена PARK2, не описанная ранее в литературе, а также в ряд нейтральных мутаций. Установлено, что полиморфизмы генов GSTM1, АРОЕ, Yb8NBC36 ассоциированы с БП. Впервые у пациентов с БП из Башкортостана проанализирована мтДНК и определена ассоциация заболевания с отдельными гаплогруппами мтДНК в зависимости от этнической принадлежности больных. Выявлено, что для татар гаплогруппой риска развития БП является гаплогруппа Н, гаплогруппа U представляет протективный фактор. При изучении мутаций в гене митохондриального цитохрома b установлено, что гаплотип 15693С-15218А-14793А, ассоциированный с гаплогруппой U, является протективным в отношении развития БП у татар. Практическая значимость работы.
Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярно-генетических механизмов возникновения БП, а также позволяют предложить новые направления в разработке подходов для оценки
групп риска БП. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников. Положения, выносимые на защиту.
Отсутствие мутаций Ala53Thr и АІаЗОРго в гене PARK1 у пациентов с БП из Башкортостана.
Гетерозиготное носительство функционально значимых мутаций в гене PARK2 - редкая, но возможная причина развития спорадической формы БП.
Ассоциация спорадической БП с полиморфизмами генов GSTM1 (генотип «0/0» - генетический маркер повышенного риска развития БП), АРОЕ (є4 - генетический маркер повышенного риска), гена калиевого канала KCNJ6 (Alu- инсерция Yb8NBC36 — генетический маркер повышенного риска).
Спорадическая форма БП ассоциирована с гаплогруппами мтДНК. В популяции татар фактором риска развития БП является гаплогруппа Н. Гаплогруппа U представляет протективный фактор в отношении развития заболевания.
Ассоциация спорадической формы БП с мутациями в гене митохондриального цитохрома Ь: в популяции татар гаплотип 15693С- 15218А-14793А, сцепленный с гаплогруппой U мтДНК, является протективным в отношении развития БП.
Аутосомно-рецессивная болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене PARK2
Ювенильный паркинсонизм с аутосомно-рецессивным типом наследования (возраст манифестации заболевания 20-30 лет) был впервые описан в Японии [Ishikawa A et al., 1996; Yamamura Y et al., 2001]. Эта форма заболевания характеризуется сильной селективной дегенерацией дофаминергических нейронов и глиозисом в компактной зоне черной субстанции и в голубом пятне, а также наличием гипопигментированных нейронов. При данной форме заболевания не наблюдается образования телец Леви [Takahashi N et al, 1994].
Ген PARK2 был картирован на хромосоме 6q25.2- 27 в группе больных японского происхождения [Matsumine N. et al., 1997]. Кодирующая часть гена PARK2 содержит 12 экзонов, распределенных в 500 т.п.н. геномной ДНК. Белок, кодируемый геном PARK2, был назван паркином [Kitada Т., Asakawa S. et al., 1998]. Он состоит из 465 аминокислот. В японской семье у одного из пациентов были обнаружены делеции экзонов 3 - 7, а у четырех других больных - гомозиготные делеции экзона 4 гена PARK2. Детерминируемый геном белок паркин является убиквитинпротеинлигазой, одним из компонентов убиквитиновой системы внутриклеточной деградации поврежденных белков. Убиквитин - зависимая деградация белков играет центральную роль в контроле множества процессов, включая передачу сигнала, рецепторную регуляцию и регуляцию транскрипции, программированную гибель клеток и разрушение поврежденных белков, а нарушение работы этой системы, в свою очередь, может нарушать нормальное функционирование клетки [Shimura Н. et al., 2000].
Кроме того, было показано, что паркин отвечает за деградацию а-синуклеина, его О-гликозидной формы [Tassin J., Durr A., Broucker Т. Et al., 1998; Shimura H. et al., 2001]. Предполагают, что паркин играет важную роль в деградации а-синуклеина; считается, что он может подавлять фибриллизацию (олиголиризацию) а- синуклеина, но не напрямую, а путем уменьшения концентрации а-синуклеина в цитоплазме [Chung К.К., Zhang У., Lim K.L. et al, 2001; Fallon L. et al., 2002].
В настоящее время известно 4 субстрата белка паркина. Оказалось, что в мозге здоровых индивидуумов паркин входит в состав белкового комплекса. Данный комплекс содержит гликозилированную форму а -синуклеина - Sp22. Нормальный белок паркин, не содержащий мутаций, принимает участие в убиквитинизации Sp22. Мутированный же белок не способен образовывать связь с субстратом Sp22, это способствует накоплению гликозилированной формы а-синуклеина в цитоплазме нейронов [Shimura Н., Schlossmacher M.G. et al., 2001].
Второй белок, участвующий вместе с паркином в процессе убиквитинизации - это G-связанный трансмембранный белок (паркин-ассоциированный белок). Данный белок подобен рецептору эндотелина (Pael-R), При повышенной экспрессии белок становится нерастворимым и подвергается процесу убиквитинзависимого протеолиза. Если данного процесса не происходит, то клетка погибает. Нормальный белок паркин ускоряет деградацию Pael-R, нерастворимая форма накапливается в мозге пациентов, содержащих мутации гена PARK2.
Третий субстрат - пресинаптический белок CDCrel-І, который, главным образом, экспрессируется в ЦНС [Zhang Y., Gao J. et al., 2000]. Белок CDCrel-1 ингибирует процесс группировки пресинаптических везикул в цитоплазматической мембране и последующий экзоцитоз. Кроме того, паркин участвует в убиквитинизации белка синфилина-1, который взаимодействует с а - синуклеином [Пчелина С.Н. с соавтор., 2003] и способствует образованию цитоплазматических включений - телец Леви. Мутации же в гене PARK2 нарушают ферментативную активность паркина, процесс убиквитинизации синфилина-1 и предотвращают образование телец Леви.
Клинические признаки пациентов с мутациями в гене PARK2 довольно разнообразны, но чаще всего заболевание характеризуется ранним началом (до 40 лет) и очень медленным прогрессированием, хотя в литературе описан случай с возрастом манифестации заболевания в 64 года [Klein С et al., 2000]. Для больных характерны предрасположенность к дофа-индуцируемой дискинезии и двигательной флюктуации в сочетании с L-ДОФА чувствительным паркинсонизмом [Scott W.K., Rogala A.R., Rampersaud Е. et al., 2000]. Предполагают, что патологический процесс при AR-JP может отличаться от такового при идиопатической БП [Takahashi et al., 1994; Van de Warrenburg et al., 2001], поскольку при посмертных исследованиях мозга пациентов с мутациями в гене PARK2 обнаруживают не только потерю дофаминергических нейронов в черной субстанции и отсутствие телец Леви, но также дегенерацию некоторых частей спиноцеребеллярной системы [FarrerMetal, 2001].
Спектр мутаций гена PARK2 насчитывает около 60 различных изменений, включая делеции и дупликации экзонов, а также точковые мутации [Hattori et al, 1998; Kitada et al, 1998; Leroy et al., 1998; Lucking et al., 1998; Abbas et al., 1999; Rlin et al. 2000; Maruyama et al, 2000; Munoz et al, 2000; Yamamura et al., 2000]. Частота мутаций в гене PARK2 составляет около 50 % в семьях с аутосомно-рецессивным типом наследования и ранним началом заболевания, и около 18 % у пациентов с возрастом манифестации БП около 45 лет [Lucking et al., 2000].
Аутосомно-рецессивный паркинсонизм, сцепленный с локусом 1р36 (PARK7).
На хромосоме 1р36, на расстоянии 25 сантиморганид от локуса PARK6, был картирован локус PARK7 [Bonifati V., 2003]. Для пациентов характерен аутосомно-рецессивный тип наследования заболевания с ранним началом. Индивидуумы проживали в генетически изолированных сообществах. Подтверждение сцепления данного локуса с заболеванием было получено в двух семьях из Италии и Нидерландов [Van Duijn CM et al., 2001; Miano M.G et al., 2000]. Возраст манифестации заболевания у пациентов составлял 27-40 лет, а клинические симптомы были схожи с таковыми при мутациях в генах PARK2 и PARK6, но с более частой дистонией.
В локусе PARK7 был обнаружен ген белка DJ-1, мутации в котором сегрегировали с БП в вышеупомянутых семьях. В итальянской семье была выявлена миссенс-мутация, приводящая к замене аминокислот с лейцина на пролин (L166P), а в семье из Нидерландов - делеция, приводящая к полному отсутствию белка DJ-1 [Bonifati V., Rizzu P., van Baren MJ. et al., 2003]. Функция данного белка до сих пор неизвестна, но доказано, что он обладает антиокислительными свойствами, а кроме того, предполагают, что белок DJ-1 участвует в процессах транскрипции и протеасомной деградации белков [Пчелина С.Н. с соавтор.,2003].
Анализ сцепления БП с локусом PARK8 проводился в большой японской семье, состоящей из 15 пациентов с аутосомно-доминантным типом наследования болезни Паркинсона [Funayaama М., Hasegawa К., Kowa Н. et al., 2002]. Возраст начала заболевания у пациентов составлял 51±6 лет.
Все пациенты показывали хорошие результаты при лечении препаратами L-ДОФА. Гаплотип, сегрегирующий с заболеванием, был выявлен также и у пяти носителей, не имеющих клинических симптомов БП, двое из них были старше, чем средний возраст начала заболевания, что может быть связано с пониженной пенетрантностью. При данной форме заболевания нейродегенеративные процессы в черной субстанции мозга больных не связаны с образованием телец Леви. Но поскольку на предмет сцепления с PARK8 было изучено небольшое число семей, его относительная частота к настоящему времени неизвестна.
В последнее десятилетие обнаружены многочисленные мутации в митохондриальной ДНК, связанные с развитием таких дегенеративных заболеваний, как глухота, деменция, миопатия, эндокринные заболевания, слепота, кардиомиопатии, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и flp.[Shofrher J.M., Watts R.L., Juncos J.L. et al., 1991; Wallace D.C., 2001].
Существует поразительная черта, характерная для всех заболеваний, связанных с митохондриальным геномом - поздний возраст начала заболеваний и их прогрессирующее течение. Кроме того, многие симптомы, характерные для пациентов с митохондриальными болезнями, часто встречаются и в процессе обычного старения. Это позволило сделать вывод о том, что дефектом дегенеративных заболеваний с поздним началом является нарушение митохондриального энергетического пути - окислительного фосфорилирования (OXPHOS) [Wallace 1992,1994,1995,1997,2000,2001; Ugalde С, Janssen R.J., van den Heuvel et al., 2004], в процессе которого митохондрии производят большое количество энергии, необходимой для жизнедеятельности клетки.
Данный процесс включает пять ферментных комплексов, каждый из которых, в свою очередь, состоит из большого количества субъединиц. Митохондриальные комплексы I и II принимают электроны от NADH и сукцината и переносят их к коэнзиму Q10 (CoQ). Затем электроны проходят через комплекс Ш, цитохром С (cyt С), комплекс IV, а вслед за этим переходят к кислороду, образуя воду. В результате реакции освобождается энергия, которая используется для проталкивания протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, создавая тем самым электрохимический потенциал [Corral-Debrinski М, Horton Т., Lott M.T.et al.,1994; Mizuno Y., Ikebe S., Hattori N. et al., 1995; Coskun P.E., Beal M.F., Wallace D.C.,2004].
Каждая клетка содержит в цитоплазме несколько сот митохондрий и несколько тысяч митохондриальных ДНК, способных к хранению информации. Митохондриальная ДНК (мтДНК) представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, содержащую 16,569 пар нуклеотидов. В молекуле мтДНК различают 2 цепи: богатую гуанином тяжелую цепь и богатую цитозином легкую цепь [Wallace D.C., Brown M.D., Lott М.Т., 2002]. Митохондриальная ДНК кодирует большую (16S) и малую (12S) субъединицы митохондриальной рРНК (MTRNR.1 и MTRNR2, соответственно), 22 тРНК и 13 полипептидов, которые являются составными компонентами комплекса окислительного фосфорилирования.
Митохондриальная ДНК обладает уникальными особенностями. Она наследуется по материнской линии, через цитоплазму ооцитов [Giles, Blanc et al.,1980]. Вследствие наследования мтДНК по материнской линии и отсутствия рекомбинации, эффективный размер митохондриального генома меньше по сравнению с аутосомными локусами [Olivo et al., 1983; Merriwether et al., 1991]. Кроме того, митохондриальная ДНК эволюционирует гораздо быстрее, чем ядерная, и мутации в ней происходят почти в 10 раз чаще [Shoffher J.M., Brown M.D., Torroni A. et ah, 1993;
Wallace, Lott et al., 2002]. Когда мутации затрагивают мтДНК внутри клетки, образуется смешанная популяция мутантных и нормальных молекул, известная как гетероплазмия, которая может варьировать от 1 до 99%.Мутантные и нормальные мтДНК случайно распределяются в дочерние клетки во время цитокинеза, что приводит к разделению генотипов мтДНК дочерних клеток.
Митохондриальные нарушения и гибель клеток. 1.5. Болезнь Паркинсона и факторы окружающей среды
Анализ митохондриальной функции в скелетных мышцах у пациентов с врожденными ошибками дыхательной цепи (митохондриальные миопатии) обнаружил спектр биохимических нарушений, коррелирующий с уровнем клинических проявлений. У некоторых больных активность комплекса I снижалась на 80-90% (уровень активности митохондриального комплекса I составлял 10-20%), но такие пациенты все еще сохраняли способность к самостоятельному передвижению. Пациенты с нарушением активности митохондриального комплекса I проявляли слабость мышц, усталость, лактозный ацидоз.
Степень ингибирования дыхательной цепи, вызывающая гибель клеток, варьирует от одной ткани к другой и зависит от того, в какой степени данная ткань зависит от процесса окислительного фосфорилирования как источника энергии. Уровень, при котором развивается нарушение работы дыхательной цепи, возможно, определяет способность ткани к компенсации. В моделях, созданных на животных, нарушение функции клеток PC 12, индуцированное железом, приводило к 20% редукции активности комплекса IV и 11 % редукции активности комплекса I, что приводило к замедлению роста клеток, но не являлось причиной их гибели. Этот факт является важным для понимания того, насколько значителен 35% дефицит активности митохондриального комплекса I для гибели дофаминергических нейронов в черной субстанции при болезни Паркинсона.
Огромное внимание в последнее время уделяется апоптозу при нейродегенеративных заболеваниях [Bredesen, 1995]. К настоящему времени описана апоптозная гибель клеток и при болезни Паркинсона [Zhang С.А. etal., 1992]. Процесс гибели клеток в результате апоптоза — процесс быстрый.
Возможно, он завершается в течение нескольких часов. Теоретически,
существует несколько факторов, которые потенциально могут индуцировать апоптозную гибель клеток при болезни Паркинсона - это L-ДОФА, ингибиторы активности комплекса I и свободные радикалы [Yoneda et al., 1995]. Группой исследователей было показано, что МФП+ вызывает ДОФА-зависимый апоптоз в клетках РС12. Увеличение концентрации МФГҐ приводит к тому, что апоптоз переходит в некроз [Hartley et al., 1994].
Интересно отметить, что МФГҐ индуцирует апоптоз в малых концентрациях, при которых не происходит изменения уровня АТФ. Существующее предположение о том, что апоптоз может быть вовлечен в процесс потери дофаминергических нейронов в черной субстанции при болезни Паркинсона, хорошо согласуется с этиологией заболевания.
После открытия недостаточности митохондриального
электронпереносящего комплекса I при болезни Паркинсона, исследования были направлены на идентификацию какой-либо мутации, которая могла бы лежать в основе этого дефекта. Т.к. комплекс I состоит из 41 субъединнцы, 7 из которых кодируются мтДНК, основное внимание было уделено мутациям в митохондриальных генах. С помощью блот-гибридизации по Саузерну исследователи не обнаружили крупных делеций или дупликаций в мтДНК, значимых для развития заболевания [Lestienne et al., 1990, 1991; Schapira et al., 1990]. Вскоре Ozawa et al. при помощи ПЦР идентифицировали пятикилобазную делецию у многих пациентов с болезнью Паркинсона [Ozawa et al., 1990], но последующий анализ показал, что в контрольной группе, которая по полу, возрасту и этнической принадлежности соответствовала изучаемым пациентам, частота делеций оказалась практически такой же [Mann et al., 1992a,b]. Позже, в группе пациентов с болезнью Паркинсона была обнаружена замена аденина на гуанин (A4336G) в 4336 положении митохондриального генома, кодирующего глициновую т-РНК [Simon D.K. et al., 2000].
Таким образом, с этого времени стали предприниматься попытки определить молекулярные основы митохондриальных нарушений при БП, классифицировать митохондриальные гаплогруппы у пациентов и БП стала рассматриваться в контексте генетической теории, ее связи с окружающей средой.
Известно несколько химических веществ, индуцирующих развитие болезни Паркинсона - это МФТП, марганец, медь, угарный газ и некоторые другие. Например, марганец может вызывать БП при хронической болезни печени, а медь - при болезни Вильсона [Huang et al.,1993]. Существует большое количество эпидемиологических исследований, проведенных для выяснения влияния факторов окружающей среды на развитие заболевания. Показано, что риск развития БП возрастает при длительном контакте с пестицидами (гербицидами, инсектицидами) [Humble J.P., Сао Т., Hassanein R.E.S., 1993; Seidler A., Hellenbrand W., Robra B.P., 1997]. Так, например, американские исследователи, наблюдающие за лицами, применяющими в хозяйстве гербициды и пестициды, обнаружили, что риск развития для них БП возрастает на 70%, а у лиц, применяющих инсектициды для борьбы с домашними насекомыми - в 2 раза [Stephenson J. et al., 2000].
Болезнь Паркинсона имеет неравномерный характер распределения в различных географических регионах, что может быть связано как с трудностью диагностики заболевания в развивающихся странах, так и с условиями окружающей среды. Cumming et al. (1999) наблюдали более высокий уровень заболеваемости БП в сельской местности, что, по-видимому, могло быть связано как с применением различных удобрений, (паракват, ротенон), так и с длительным потреблением родниковой воды, насыщенной соединениями железа. Эти химические соединения, как известно, способствуют уменьшению активности процессов окислительного фосфорилирования, возникновению окислительного стресса, и гибели дофаминергических нейронов [dimming J.L. et al., 1999]. Доказано, что важную роль при окислительном стрессе играет эффективность устранения супероксидных радикалов, которая может определяться генетической предрасположенностью.
Определение последовательности нуклеотидов. II.2.6. Методы изучения полиморфизма мтДНК
У 200 больных со спорадической формой болезни Паркинсона и у пяти неродственных больных с наследственными формами БП проведен скрининг мутаций Ala53Thr и АІаЗОРго в гене альфа-синукленина (PARK1). Данные мутации у обследованных больных, в том числе с аутосомно-доминантной формой, не выявлены. Этот результат был ожидаемым, т.к. указанные мутации являются на сегодняшний день единственными обнаруженными функционально значимыми нарушениями в гене альфа-синуклеина при редких наследственных формах БП. Известно, что в результате ряда исследований, посвященных молекулярному изучению БП в различных европейских популяциях, в том числе и в российской, мутаций в гене альфа-синуклеина не выявлено [Gasser Т., Muller-Myhsok В., Wszolek Z. et al., 1998; Scott W., Stajich J., Yamaoka L. et al., 1997; Vaughan J.R., Farrer M.J., Wszolek P. et al, 1998; Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., 2002].
По-видимому, в описанных мутациях, найденных ранее в трех итальянских, греческой (А1а53 Thr) [Polymeropoulos М., Lavedan С, Leroy Е., 1997] и в немецкой (АІаЗОРго) [Kriiger R., Kuhn W., Muller T. et al.,1998] семьях, имеет место эффект основателя, кроме того, они являются сравнительно новыми, не получившими широкого распространения в мире. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене альфа-синуклеина, имеет и некоторые характерные клинические особенности; в частности, возраст начала заболевания меньше (46+13; при спорадической форме - 59 лет) и длительность заболевания короче (в среднем 9 лет).
Частым осложнением при болезни являлась деменция [Polymeropoulos М., Lavedan С, Leroy Е., 1997]. В наших же пяти семьях с аутосомно-доминантной болезнью Паркинсона возраст начала заболевания составлял 56, 66 и 68 лет; деменции у этих больных не наблюдалось, что также позволяет предполагать другую генетическую причину их заболевания. Следовательно, мутации в гене альфа-синуклеина представляют собой редкую причину развития болезни Паркинсона у пациентов из Башкортостана.
С целью изучения роли структурно-функциональных изменений гена белка паркина (PARK2) в патогенезе спорадической формы болезни Паркинсона, нами был проведен поиск мутаций в его кодирующих областях (12 экзонов). Согласно литературным данным, при аутосомно-рецессивной ювенильной форме болезни Паркинсона нарушения в гене PARK2 могут быть представлены либо крупными делециями, что особенно характерно для популяций Азии [Kitada Т., Asakawa S., Hattori N. et al., 1998], либо различными точковыми мутациями, чаще встречающимися среди европейских больных [Abbas N., Lucking СВ., Ricard S.et al., 1999]. Поэтому обоснованным было проведение анализа всех типов мутаций в исследуемом гене.
Для проведения полуколичественного анализа дозы отдельных экзонов гена паркина, проведенного нами на базе Института молекулярной генетики РАН, был использован метод, основанный на мультипраймерной ПЦР групп экзонов гена PARK2 (рис.2).
Амплификация при этом проводилась с использованием небольшого числа циклов ПЦР - с тем, чтобы для каждой из использованных пар праймеров не была достигнута стадия насыщения. В результате, количество ПЦР амплифицированного фрагмента ДНК оказывается достаточо мало для его визуализации при помощи окраски бромистым этидием или нитратом серебра, и амплификацию проводили с мечеными по у32Р-АТФ праймерами. Подбор групп экзонов для мультипраймерноЙ амплификации при этом был основан на температуре отжига праймеров, размере амплифицированных фрагментов ДНК и минимальной кросс-амплификации различных фрагментов. После амплификации проводилась радиоавтография и интенсивность амплификационного сигнала сравнивали после сканирования радиоавтографа при помощи пакета программ "Image Quant". На рисунке 3 приведены результаты одного из таких экспериментов при проведении мультипраймерноЙ ПЦР на экзоны 4, 1, 8, 11 (рис. За) и 5, 6, 10 (рис. 36) гена PARK2 у трех неродственных здоровых лиц и трех больных спорадической болезнью Паркинсона.
В использованных условиях амплификации соответствующие этим экзонам пики составляют в среднем от общего амплификационного сигнала 22.42+1.79%, 38.98+1.86% и 38.67±2.42% - причем это соотношение не зависит от общей величины амплификационного сигнала и не отличается у здоровых лиц (дорожки 1-3) и у пациентов с БП (дорожки 4-6). Пример сканирования и обсчета радиоавтографа с использованием программы «Image Quant» представлен на рис. 4
Предложенный полуколичественный метод оценки дозы отдельных экзонов гена паркина путем сопоставления амплификационного сигнала для различных экзонов гена позволяет выявлять не только гомозиготные, но и гетерозиготные делеции отдельных экзонов или групп экзонов этого гена. Впервые такой подход к полуколичественному анализу дозы отдельных экзонов гена паркина был использован Lucking et al. для изучения мутаций у больных с аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом [Lucking СВ., Abbas N., Durr A. et al., 1998]. Однако, в предложенном ими варианте метода не удается анализировать дозу экзона 1 гена PARK2.
В последнее время появились работы по точной оценке дозы гена паркина с использованием методов ПЦР в реальном времени (realime PCR) с применением систем TaqMan и LightCycler [MaruyamaM., Ikeuchi Т., Saito М. et al., 2000, Hedrich К., Каші JVL, Lanthaler AJ. et al 2001] - но в предложенных протоколах удается анализировать только часть экзонов гена паркина.