Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Классификация наследственных спастических параплегий. 14
1.2 Генетические формы наследственных спастических параплегий 17
1.3 Молекулярные механизмы патогенеза наследственных спастических параплегий
1.3.1. Гены и белки, формирующие мемебраны. 28
1.3.2. Белки, вовлеченные в регуляцию рецептор-опосредованного сигналинга 32
1.3.3. Белки, участвующие в аксональном транспорте 34
1.3.4. Белки, необходимые для метаболизма жиров
1.4. Патоморфологические изменения при наследственных спастических параплегиях 36
1.5. Клинические проявления и диагностика наследственных спастических параплегий 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Материал для исследования 53
2.2. Методы исследования 54
2.2.1 Молекулярно-генетические методы исследования 54
2.2.1.1. Выделение геномной ДНК из периферической крови 54
2.2.1.2 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 55
2.2.1.3. Метод электрофореза 56
2.2.1.4 Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализ) 63
2.2.1.5. Секвенирование 63
2.2.1.6. Рестрикционный анализ 64
2.2.1.7. Мультиплексная лигазозависимая амплификация проб (MLPA – анализ)
2.2.2. Статистическая обработка результатов 67
2.2.3. Предсказательные компьютерные программы. 68
Глава 3 Результаты исследования и обсуждение 69
3.1. Анализ гена SPAST у пациентов с НСП из Республики Башкортостан 69
3.2. Анализ гена ATL1 у пациентов с НСП из Республики Башкортостан 90
3.2. Анализ гена REEP1 у пациентов с НСП из Республики Башкортостан 93
3.4. Анализ гена NIPA1 у пациентов с НСП из Республики Башкортостан 101
3.5. Подходы ДНК-диагностики наследственных спастических параплегий в Республике Башкортостан 112
Заключение 116
Выводы 123
Список литературы
- Генетические формы наследственных спастических параплегий
- Патоморфологические изменения при наследственных спастических параплегиях
- Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализ)
- Анализ гена REEP1 у пациентов с НСП из Республики Башкортостан
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Наследственные спастические
параплегии (НСП) – это генетически и клинически гетерогенная группа
дегенеративных заболеваний нервной системы, обусловленных дистальным
поражением длинных аксонов кортикоспинального тракта (Finsterer, 2012).
Клинически НСП проявляются спастичностью мышц нижних конечностей;
спастические параличи могут сочетаться с различными дополнительными
симптомами - атрофией зрительных нервов, глухотой, атаксией, полинейропатией,
эпилепсией, нарушением когнитивных функций и др. В зависимости от того,
является ли основной симптом единственным или сочетается с другими
неврологическими или экстраневральными симптомами, выделяют неосложнённые
(«чистые») или осложненные формы заболевания (Hazan, 1999).
Распространенность НСП, по данным австралийского исследовательского фонда НСП (HSP Research Foundation), варьирует в разных популяциях от 0,5 до 12 на 100 000 населения ().
Чрезвычайная клиническая гетерогенность НСП связана с разнообразными
патогенетическими процессами, возникающими в нейронах: дефектами
формирования мембранных органоидов, молекулярного транспорта, нарушением
процессов миелинизиции, функций митохондрий, за которые ответственны мутации
в различных генах. В настоящее время известно более 70 генетических локусов (59
иденифицированных гена) (Klebe et al, 2015), связанных с различными типами
наследования (). По международной
номенклатуре, данные локусы и соответствующие генетические варианты НСП
нумеруются в хронологической последовательности с прибавлением аббревиатуры
SPG (Spastic Paraplegia Gene). Значительная генетическая гетерогенность НСП
сочетается с популяционной неоднородностью как по распространенности
заболевания, так и по спектру и частоте мутаций в ответственных генах. В связи с
этим, комплексные эпидемиологические, клинико-генеалогические и молекулярно-
генетические исследования НСП являются актуальными, направленными на
познание патогенеза заболевания, его геногеографии, разработку эффективных
подходов ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования,
оптимальных для конкретных регионов.
Разработанность темы исследования. В Республике Башкортостан –
многонациональном регионе России, - в последние годы были проведены
углубленные эпидемиологические и клинико-генеалогические исследования НСП.
Была установлена общая распространенность заболевания - 3,5 на 100000 населения,
выявлено преобладание аутосомно-доминантных форм НСП; показана
территориальная и этническая неоднородность распространенности заболевания (Магжанов и др., 2013).
Согласно литературным данным, наиболее частыми причинами НСП являются мутации в генах, кодирующих белки внутриклеточного транспорта, а также белки локализации и формирования мембранных органоидов (Blackstone, 2011). В частности, мутации в генах спастина (SPAST), атластина (ATL1) и белка REEP1 обнаруживаются у пациентов с АД НСП соответственно в 40% (Fonknechten et al., 2000), 10% (Namekawa et al., 2006) и 2,4% - 6,5% случаев (Zuchner et al., 2006; Beetz et al., 2008; Hewamadduma et al., 2009; Schlang et al., 2008). Белки, кодируемые этими генами, локализуются в мембране трубочек эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и, взаимодействуя между собой, обеспечивают формирование сети ЭПР, а также взаимодействие последней с микротрубочками цитоскелета, регулируя транспорт поляризованных мембран и белков вдоль микротрубочек к удаленным частям клеток (Park et al. 2010). Наряду с функциями формирования и функционирования мембранных органоидов (ЭПР и КГ) и молекулярного транспорта, белки спастин и атластин-1 вовлечены в регуляцию рецептор-опосредованного сигналинга. Эти белки, а также белки спартин и NIPA1 (nonimprinted in Prader-Willi/Angelman syndrome-1) являются ингибиторами сигнального пути костного морфогенетического белка (BMP), важного для многих процессов развития, в том числе - для аксонального роста и функционирования синапсов (O'Connor-Giles, 2008; Tsang, H., 2009; Fassier, C. et al, 2010). Мутации в гене NIPA1 (15q11.2) обусловливают форму НСП SPG6, встречающуюся в различных популяциях Европы и Азии (Rainier et al., 2003, Chen et al., 2005, Klebe et al, 2007, Liu et al, 2008 Du et al, 2011, Svenstrup, 2011, Svenstrup, 2013).
Таким образом, на основании частоты встречаемости генетических форм в общей структуре НСП, а также морфологического и функционального
взаимодействия соответствующих белков, указанные выше гены были выбраны для
молекулярно-генетического исследования НСП в РБ.
Соответственно, были поставлены следующие цель и задачи исследования: Целью работы являлось определение генетической природы нарушений,
приводящих к развитию наследственных спастических параплегий у пациентов из
Республики Башкортостан, и оптимизация подходов ДНК-диагностики данной
группы заболеваний в исследуемом регионе. Задачи исследования:
-
Провести поиск изменений нуклеотидных последовательностей в генах SPAST, ATL1A, REEP1 и NIPA1 у пациентов со спастическими параплегиями из Республики Башкортостан.
-
Установить характер наследования и клинические признаки заболевания в семьях пациентов с выявленными мутациями в исследованных генах.
-
Определить вклад наследственных форм спастических параплегий, связанных с мутациями в исследуемых генах, в общую структуру данной группы заболеваний в Республике Башкортостан.
-
Разработать оптимальные для населения РБ подходы ДНК-диагностики наследственных спастических параплегий.
Научная новизна исследования. Впервые у больных наследственными
спастическими параплегиями из Республики Башкортостан изучен спектр и частота
мутаций и полиморфных вариантов в генах SPAST, ATL1, REEP1, NIPA1. В гене
SPAST выявлено пять мутаций: делеция 1-го экзона, дупликация 1-го экзона, с.
322del29 (p.Val108SerfsX18), с.885del10 (p.Thr295ThrfsX16), c.1114A>G
(p.Arg372Gly), три последние из которых идентифицированы нами впервые; четыре
известных полиморфных варианта. В гене ATL1 обнаружена ранее неописанная
мутация - дупликация 3-го экзона. В гене REEP1 идентифицированы две мутации:
с.225G>A (p.Trp75*) и с.606+43G>T, первая из которых ранее не описана; два
известных полиморфных варианта. В гене NIPA1 выявлены два редких
полиморфных варианта, которые, предположительно, могут оказывать
модифицирующее влияние на клиническую картину НСП: с.21A>G (rs749414711), приводящий к образованию нового сайта сплайсинга в первом экзоне гена, и редкий
аллель с увеличенным числом повторов (GCG)10. У пациентов с выявленными мутациями описаны клинические особенности и генеалогические данные.
Научно-практическая значимость. Полученные новые данные о мутациях и полиморфных вариантах в генах SPAST, ATL1, REEP1 и NIPA1, в сочетании с клиническими особенностями вызываемых ими форм НСП, вносят вклад в познание механизмов патогенеза данной группы заболеваний. Определение спектра и частоты мутаций в этих генах у пациентов из Республики Башкортостан расширяет сведения о геногеографии наследственных спастических параплегий. Разработанные на основе полученных результатов подходы ДНК-диагностики НСП, оптимальные для населения РБ, способствуют повышению эффективности медико-генетического консультирования в семьях пациентов.
Материалы диссертации могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Методология и методы исследования. Методология проведенного исследования состоит в использовании системного подхода на основе комплекса генетического, клинического, генеалогического анализов, а также изучения литературных данных по проблеме наследственной спастической параплегии.
Для молекулярно - генетического исследования были выбраны следующие методы: выделение геномной ДНК фенольно-хлороформной экстракцией, полимеразная цепная реакция синтеза ДНК, рестрикционный анализ, SSCP-анализ, MLPA-анализ, прямое секвенирование по Сенгеру.
Положения, выносимые на защиту:
-
Особенности спектра и частоты мутаций в генах SPAST, ATL1, REEP1, NIPA1 у больных НСП из РБ. Новые мутации p.Val108SerfsX18, p.Thr295ThrfsX16, p.Arg372Gly в гене SPAST; dup 3 ex - в гене ATL1, p.W75* - в гене REEP1.
-
Вклад генетических форм НСП, обусловленных мутациями в генах SPAST, ATL1 и REEP1 в общую структуру заболевания составил 14,2%, 1,8%, 3,6% соответственно.
-
Клинико-генеалогическое описание пациентов с выявленными мутациями в генах SPAST, ATL1, REEP1.
4. Подходы молекулярно-генетической диагностики НСП, оптимальные
для жителей РБ, разработанные на основе исследования генов SPAST, ATL1, REEP1и NIPA1.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов подтверждается проведением исследований на
репрезентативных выборках семей пациентов и контрольных групп, применением
современных молекулярно-генетических и биоинформатических методов.
Результаты соответствуют данным, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Выводы полностью и в строгой логической последовательности отражают полученные результаты.
Основные результаты исследования были представлены на Международной конференции Европейского общества генетики человека «European Human Genetics Conference» (Глазго, 2015), Международной научной конференции Научного Парка СПбГУ «Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспекте внедрения в практическую медицину» (Санкт-Петербург, 2015), VII Съезде российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015), XVII Зимней молодежной школе по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 2016), Двенадцатом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2016), Всероссийской конференции «Современная нейробиология» (Уфа, 2015), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы экологии человека» (Уфа, 2015), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы фундаментальной и экспериментальной биологии» (Уфа, 2016).
Личный вклад автора в проведенные исследования. Определение темы
диссертационной работы, цели и задач исследования проводились автором
совместно с научным руководителем д.б.н, проф. Хидиятовой И.М. Автор
самостоятельно изучил отечественную и зарубежную литературу по теме
диссертации и лично написал рукопись данной работы. Автор непосредственно
участвовал в подготовке материалов к публикациям и их написании. Основная часть
экспериментальной работы: выделение ДНК, амплификация, рестрикционный
анализ, проведение SSCP-анализа, MLPA-анализа выполнены автором
самостоятельно. Суммарный личный вклад автора составляет более 80%.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, 4 из которых в журналах из Перечня ВАК.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Диссертационная работа «Молекулярно-генетическое исследование спастических параплегий в республике Башкортостан» соответствует формуле специальности 03.02.07 – «Генетика». В диссертационной работе исследованы молекулярно-генетические основы наследственной спастической параплегии у пациентов из Республике Башкортостан, что необходимо для разработки оптимального алгоритма ДНК- диагностики НСП в РБ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 33 рисунка, 352 источника литературы.
*** Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета д.м.н„ профессору Магжанову Риму Валеевичу и к.м.н., доценту Сайфуллиной Елене Владимировне за консультативную помощь и организацию забора материала для исследований.
Генетические формы наследственных спастических параплегий
Мутации в генах спастина (SPAST), атластина-1 (ATL1), белка, усиливающего экспрессию рецептора (REEP1), штрюмпеллина ответственны за 60% НСП в Северной Европе и Северной Америке (Blackstone et al., 2011).
Спастин был первым идентифицированным геном, ответственным за НСП. С мутациями в гене SPAST (2p22.3) связаны не только аутосомно-доминантные, но и спорадические случаи спастических параплегий. Ген SPAST кодирует четыре изоформы белка, образующиеся за счет инициации трансляции с двух разных стартовых кодонов и альтернативного сплайсинга. В результате синтезируются длинная изоформа М1, короткая изоформа М87 и варианты этих изоформ, не содержащие 32 -х аминокислот, соответствующих 4-му экзону гена (Lumb et al., 2012). В различных экспериментах (сверхэкспрессия и нокдаун на клеточных линиях млекопитающих, in vitro исследования, структурные исследования, на моделях животных) было показано, что спастин осуществляет разборку микротрубочек нейронов. Эти белки образуют внутренние бреши в микротрубочках, таким образом, регулируя процессы, зависимые от этих структур. На С-конце спастина расположен ААА АТФазный домен (аминокислоты 342-599). АТФазный домен имеет целое семейство так называемых ААА-белков, которые используют энергию расщепления АТФ для конформационных изменений в белках-мишенях (White et al., 2007). Связавший АТФ спастин формирует шестичленное кольцо с центральной порой, через которую он (спастин) вытягивает С-конец тубулина, дестабилизируя микротрубочки. N-конец спастина содержит последовательности, связывающие его с другими адаптерными белками, привлекающими спастин к участию в разных клеточных процессах. Многие из этих адаптеров являются интегральными мембранными или ассоциированными с мембранами белками. Это доказывает, что микротрубочки разбирающая активность спастина направлена на определенные мембраны. Показано, что спастин обнаруживается и на ЭПР (M1), и в эндосомах (М87). N-концевой регион спастина содержит два хорошо охарактеризованных домена. Гидрофобный домен (HD) взаимодействует с тремя группами белков раннего секреторного пути (атластины, REEP-белки, ретикулоны). Этот домен отсутствует у изоформы М87. MIT (микротрубочки связывающий и транспортирующий) домен имеется у всех изоформ спастина, он обеспечивает взаимодействие с так называемыми заряженными мультивезикулярными белками (CHMPs) (Ciccarelli et al, 2003). Эти белки формируют эндосома-сортирующий комплекс, необходимый для транспорта III (ESCRT-III). Функцией этого комплекса является формирование различных мембран: при отпочковывании вирусов, эндоцитозе рецепторов, последней стадии цитокинеза (Babst et al, 2002).
В исследованиях на клеточных культурах было показано, что спастин также взаимодействует с другим эндосомальным белком - протрудином (ZFIVE27) (Mannan et al., 2006). Хотя их взаимодействие с участием эндогенных белков в нейронах не доказано, интересен факт, что отсутствие протрудина в культуре клеток ингибирует удлинение нейрита. Функция протрудина по удлинению нейрита осуществляется его взаимодействием с ГДФ-связывающим белком Ras-семейства Rab 11, который осуществляет направленный перенос мембран (Shirane and Nakayama, 2006). Значение спастина в этих процессах непонятно, но возможно их координирование происходит через спастин.
Атластин-1 – трансмембранный белок, кодируемый геном ATL1 (14q22.1), принадлежит подсемейству динаминов больших ГТФаз. Миссенс мутации в атластине - 1 являются второй по частоте причиной развития аутосомно-доминантных НСП и наиболее распространенной причиной рано начинающихся НСП (Zhao et al., 2001, Tessa et al., 2002; Abel et al., 2004; Durr et al., 2004; Hedera et al., 2004; Sauter et al., 2004). Атластин-1 - один из трех белков семейства атластинов, представляющих собой функциональные паралоги. Только атластин-1 экспрессируется в ЦНС (Blackstone et al., 2011). Атластин-подобные ГТФазы присутствуют во всех эукариотических клетках и имеют N-концевой ГТФ-связывающий домен и два близкорасположенных гидрофобных сегмента на С-конце, которые формируют трансмембранный домен (Rismanchi et al., 2008; Hu et al., 2009).
Атластины участвуют в формировании ЭПР и располагаются в отдельных участках вдоль ее сети (Rismanchi et al., 2008; Hu et al., 2009; Orso et al., 2009). Атластин-1 также присутствует в других клеточных компартментах: на поверхности клеток, аксонах и дендритах (Zhu et al., 2003; Namekawa et al., 2007; Rismanchi et al., 2008), особенно в конусах роста нейронов, и нокдаун экспресии атластина-1 повреждает рост аксона (Zhu et al., 2006). Этот факт подтвердили в исследованиях с ортологом атластина RHD3 на корневых волосках Arabidopsis thaliana. Длинные выросты клетки, будь то корневые волоски или аксоны нейронов, сильно зависят от динамики морфологических изменений трубчатого ЭПР (Ridge et al., 1999). Эксперименты на дрозофилах подтвердили, что аталастин-1 может быть необходим для формирования синапсов (Lee et al., 2009), причем эта функция атластина зависит от его способности напрямую связываться со спастином (Evans et al., 2006; Sanderson et al., 2006). Учитывая гомологию с семейством динаминов, можно предположить участие атластина и в транспорте белков (Praefcke and McMahon, 2004).
Атластин-1 играет важную роль в развитии ЭПР и Комплекса Гольджи (КГ), где он взаимодействует с REEP1 и спастином (рис.1), координирует морфогенез ЭПР и динамику микротрубочек (Zhu et al., 2003; Namekawa et al., 2007; Rismanchi et al., 2008; Hu et al., 2009; Orso et al., 2009; Park et al., 2010). Нарушения в формировании трубчатого ЭПР и взаимодействии компонентов сети являются одним из главных механизмов аксональной дегенерации при НСП, вызываемой мутациями в ATL1 (Park and Blackstone, 2010).
Для формирования мембраны ЭПР необходимыми являются несколько классов белков, среди которых особенно важны белки семейств REEP и ретикулонов, обеспечивающие структурное удлинение. В поляризованных клетках, таких как нейроны, распределение доменов ЭПР контролируется динамикой микротрубочек. Атластины напрямую взаимодействуют со спастином через его гидрофобный домен, который есть только у М1 изоформы (Sanderson et al., 2006; Evans et al., 2006; Park and Blackstone, 2010). Также атластин и спастин М1 взаимодействуют с семейством белков REEP. Это взаимодействие через гидрофобную шпильку – механизм соединения моделирования мембраны ЭПР с динамикой цитоскелета.
Патоморфологические изменения при наследственных спастических параплегиях
Патологоанатомические исследования при НСП постоянно выявляют дегенерацию аксонов бокового кортикоспинального тракта, наиболее выраженную в дистальных концах (грудном отделе спинного мозга), и менее выраженную в шейном отделе (White et al., 2000; Deluca et al., 2004). Также наблюдается дегенерация аксонов в тонком пучке, максимальная в шейном отделе. Дегенерация аксонов спинного мозга может быть достаточной, чтобы вызвать атрофию шейного и грудного отделов (Hedera et al., 2005; Sperfeld et al., 2005). В некоторых случаях дегенерация кортикоспинального тракта растягивается в ростральном направлении и включает Варолиев мост, ножки мозжечка, продолговатый мозг и внутренние капсулы. Часто отмечается демиелинизация дегенерирующего кортикоспинального тракта и волокон тонкого пучка, и как правило, считается, что она согласуется со степенью дегенерации аксона, а не является первичным процессом демиелинизации.
Существует несколько статей о патологоанатомических исследованиях у пациентов с аутосомно-рецессивными НСП. Например, Kuru с соавт. (2005) описал пациента с возможной аутосомно-рецессивной спастической параплегией, осложненной истончением мозолистого тела. В данном случае нейродегенерация охватывала кортикоспинальный тракт, таламус, белое вещество мозжечка и черную субстанцию, передний рог и задний канатик спинного мозга. Был широко распространен нейрональный липофусцин и эозинофильные гранулы, а также наблюдался глиоз белого вещества и черной субстанции. Nomura с соавт. (2001) описал случай возможной рецессивной спастической тетраплегии, дизартрии, деменции, приведший к смерти в 50 лет. Патологические структуры включали серьезную атрофию мозга, диффузные изменения, нейрональную атрофию из-за липофусциноза, дегенерацию заднего спиномозжечкового и кортикоспинальных путей, сопровождающуюся потерей клеток переднего рога и нейронов ядра тонкого пучка и, очевидно, митохондриальными нарушениями скелетных мышц. Wakabayashi с соавт. (2001) рассмотрел пациента с возможной аутосомно -рецессивной НСП, ассоциированной с истончением мозолистого тела, нарушением чувствительности и амиотрофией. Патологические изменения включали нейрональную потерю и глиоз в верхних и нижних моторных путях, таламусе, латеральном коленчатом теле, зубчатых ядрах, заднем канатике спинного мозга; многие оставшиеся нейроны содержали убиквитированные гранулы липофусцина и уменьшенное количество пигментированных нейронов черной субстанции. В целом, такие разрозненные данные пока трудно поддаются обобщению.
НСП в большинстве случаев не сокращают продолжительность жизни, и вскрытия при НСП могут раскрыть детали, связанные с возрастом или с совместно появившимися несхожими возраст зависимыми заболеваниями (такими как болезни Альцгеймера или Паркинсона). Был описан случай патологоанатомического исследования у пациента с мутацией в гене SPAST (White et al., 2000), у которого кроме прогрессирующей спастической слабости нижних конечностей присутствовали деменция, лицевая брадикинезия и тремор. Дегенерация кортикоспинального тракта была максимальна в грудных и поясничных отделах и связана с бледностью миелина. Кроме того, гибель нейронов отмечалась в гиппокампе и энторинальной коре. Было отмечено умеренное уменьшение пигментированных дофаминергических нейронов и увеличение количества телец Леви и бледных телец в черной субстанции. Хотя эти последние находки характеризуют клинический паркинсонизм, невозможно было определить связь между ними и мутациями в гене SPAST.
Дегенерации аксонов преимущественно затрагивает дистальные концы кортикоспинального тракта и пучка Голля, из чего следует, что 1) НСП выявляют особую ранимость самых длинных моторных и чувствительных аксонов ЦНС; 2) НСП представляют первичную аксонопатию. Каждое из этих утверждений неполное в следующих отношениях. Во-первых, все больше и больше осознается, что нейропатология при многих типах НСП выходит за пределы кортикоспинального тракта, волокон спинного мозга и даже центральной нервной системы. Например, SPG3 форма, хотя и считается относящейся к неосложненной НСП, иногда сочетается с мотосенсорной аксональной периферической нейропатией (Ivanova et al., 2007). Периферическая нейропатия описана либо как редкий, либо как общий признак в более чем 12 генетических типах НСП. Вовлечение нижних мотонейронов, проявляющееся слабостью дистальных мышц – характерный признак многих генетических типов НСП, особенно SPG10, SPG20, SPG39, SPG17. В случае с SPG39 - присутствует моторная нейропатия. Вовлечение нижних моторных нейронов можно заметить при НСП SPG11, хотя мутации в этом гене (SPG11) вызывают еще ювенильный боковой амиотрофический склероз (БАС) (Orlacchio et al., 2010). Во-вторых, при НСП необязательно случаются нейродегенерации только самых длинных аксонов. Например, у SPG4 пациентов выявлялось вовлечение в дегенерацию мозжечка и базальных ганглиев (White et al., 2000). В-третьих, при некоторых формах НСП наблюдаются нарушения миелинизации из-за нарушений в олигодендроглии. Примерами являются SPG2 и SPG42 формы, развивающиеся из-за мутаций в генах, экспрессирующихся именно в олигодендроглии (Suzuki et al., 2011).
Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализ)
Материалом для исследования послужила геномная ДНК, выделенная из венозной крови пациентов с клиническим диагнозом наследственная спастическая параплегия, и членов их семей. Клинический осмотр пациентов и забор крови проводился сотрудниками кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета. Все пациенты состоят на диспансерном учете в Медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра (МГК РПЦ) г. Уфы. На данный момент наша выборка пациентов с НСП представлена 120 индивидами из 56 неродственных семей, что составляет около 60% всех зарегистрированных в Республике Башкортостан больных НСП. По этнической принадлежности выборку составляют 16 татарских семей, 12 – русских, 6 – башкирских, по 1 семье – чувашской, украинской, марийской; 12 метисных семей: 3 башкирско-татарских, 3 -татарско-русских, 1 - русско-башкирская семья, по одной семье русско-болгарской, татарско-узбекской и татарско-мордовской; две многонациональные семьи: русско-белорусско-украинская, русско-украинско-татарско-еврейская, а также 7 семей неизвестной национальности.
Критерием включения в исследование был диагноз спастическая параплегия, поставленный на основе клинико-неврологического обследования.
Выборка здоровых индивидов (150 человек), использованная в качестве контроля для скрининга впервые выявленных у пациентов изменений нуклеотидных последовательностей генов, была представлена жителями Республики Башкортостан: по 50 человек башкирской, татарской, русской этнических принадлежностей. У всех обследуемых лиц кровь была получена с их информированного согласия. Исследования были одобрены биоэтическим комитетом.
Выделение ДНК проводили из лейкоцитов периферической венозной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Matew et al, 1984). Кровь набирали в пробирки с консервантом глюгицир в соотношении с кровью 1:4. Тщательно перемешивали и хранили при 4С не более двух недель. Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера: 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl, pH 7,6 и центрифугировали при 4С и 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали. К осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при 4С и 4000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость снова сливали и к осадку добавляли 800 мкл буфера Soline ЭДТА: 25 мМ ЭДТА, pH 8, 75 мМ NaCl. Полученный раствор ресуспензировали, переносили в 2 мл стерильные пробирки, добавляли 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы K (10мг/мл) и инкубировали при 37С в течение 16 часов.
Очистку ДНК от белков проводили в три этапа раствором фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола – Трис-HCI, pH 7,8) объемом 1000 мкл, смесью фенола (500 мкл) и хлороформа (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) (500 мкл) (1:1), и хлороформом (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -20С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, SSCP-анализа (анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК), секвенирования, рестрикционного анализа, анализа методом MLPA (мультиплексной лигазозависимой амплификации).
Амплификацию исследуемых локусов проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторах T100 Thermal Cycler (BioRad, США) и Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, США). Проведен анализ экзонов с прилегающими интронными областями: 17 экзонов - гена SPAST, 14 экзонов - гена ATL1, 7 экзонов - гена REEP1, 5 экзонов - гена NIPA1. Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в табл. 3. Реакцию амплификации проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10хTaq-буфера (67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5мМ MgCl2, 0,01% Тween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Cилекс», г.Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация (95С, 4 мин.), 27-32 циклов амплификации: денатурация – 95С, 45 сек.; отжиг праймеров – 53-69С, 45 сек.; синтез – 72С, 60 сек., завершающий синтез (72С, 7-10 мин.). В дальнейшем продукты амплификации использовались в проведении SSCP- анализа, рестрикционного анализа, секвенирования.
Результаты амплификации и рестрикции оценивались методом вертикального электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1). Электрофорез проводили в 1ТБЕ буфере (0,089 М трис-HCl; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0) при напряжении 300В. Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция).
Анализ гена REEP1 у пациентов с НСП из Республики Башкортостан
Согласно опубликованным данным, дупликации являются более редкими изменениями нуклеотидной последовательности гена SPAST, по сравнению с делециями, но также выявляются в различных популяциях. Так, Proukakis с соавт. (2003) выявили дупликацию 19 пн в первом экзоне гена SPAST у пациентов из Европы. Протяженные дупликации с 10 по12 экзоны и с 14 по15 экзоны были идентифицированы соответственно в бразильской (Mitne-Neto et al., 2007) и польской семьях (Sulek et al., 2013). Во всех описанных семьях дупликации гена SPAST приводили к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. В большой бразильской семье тяжесть заболевания варьировала у носителей мутации: некоторые члены семьи не имели никаких клинических симптомов, у других – клиническая картина была представлена разной - от легкой до средней степени спастичности, гиперрефлексией нижних конечностей, потерей вибрационной чувствительности, у некоторых – деформацией стоп, и почти у всех, также как у пациента из данного исследования – различными нарушениями мочеиспускания. Возраст манифестации НСП в бразильской семье варьировал от 1 до 54 лет (Mitne-Neto et al., 2007). Что касается атаксии, она описана и у пациентов в выборках других исследователей, но с миссенс-мутациями в гене SPAST (Nielsen et al., 2004; Elert-Dobkowska et al., 2015). В целом, хотя SPG4 форма определяется как «неосложненная НСП», существуют данные о ее клиническом разнообразии: кроме атаксии, у пациентов встречаются когнитивные нарушения (Fonknechten et al., 2000), эпилепсия (Mead et al, 2000).
Таким образом, в нашем исследовании анализ гена SPAST позволил определить генетическую причину НСП в 6-ти семьях с установленным семейным характером заболевания и в 2-ух семьях со спорадической формой НСП. В указанных семьях были выявлены 1 миссенс - мутация, 2 микроделеции, 1 протяженная делеция, 1 протяженная дупликация. Только протяженная делеция всего первого экзона была идентифицирована в четырех неродственных семьях; остальные мутации были обнаружены не более чем в одной семье. Общий вклад формы SPG4, обусловленной мутациями в гене SPAST, в общую структуру НСП в РБ составил 14,3%.
Клинический эффект НСП, обусловленный мутациями в гене спастина, может быть связан либо с уменьшением экспрессии белка (гаплонедостаточность) (Fonknechten et al., 2000; Burger et al., 2000), либо с потерей его функции (Namekawa et al., 2001). Исследования роли спастина в динамике микротрубочек доказали, что при мутациях, приводящих к преждевременному окончанию синтеза спастина, НСП развивается из-за недостатка количества нормально функционирующего белка (Errico et al., 2002), о чем говорит и отсутствие детектируемых уровней количества укороченных спастинов в клеточных линиях (Solowska and Baas, 2015). Но в случае с миссенс-мутациями нужно принимать во внимание и доминантно-негативный механизм (Errico et al., 2002). Миссенс-мутации приводят к синтезу стабильных мутантных мРНК и белков, которые могут снижать активность спастина, кодируемого «диким» аллелем. Таким образом, возможно, что разные типы мутации в гене SPAST могут индуцировать НСП через свой патогенетический механизм. Идентифицированные нами мутации приводят либо к синтезу укороченного белка, не содержащего АТФазный домен, теряющего функциональную активность (различные типы делеций, дупликация), либо белка с измененными свойствами (миссенс - мутация).
Клинические симптомы в большинстве обследованных нами семей с идентифицированными мутациями соответствуют типичному неосложненному фенотипу, характерному для НСП формы SPG4. Только в двух семьях присутствуют дополнительные симптомы: это глухота неясной этиологии у пациентки из семьи К.1. с делецией первого экзона и атаксия у пациентки со спорадической формой с дупликацией части первого экзона гена. На настоящий момент данных о зависимости тяжести или возраста манифестации заболевания от типа мутации не существует (Fonknechten et al., 2000; Hentati et al., 2000; Lindsey et al., 2000), но возраст манифестации SPG4 формы, по литературным данным, сильно варьирует от раннего детства до 60 лет, и может отличаться даже у членов одной семьи (Fonknechten et al., 2000). У пациентов из данного исследования с идентифицированными мутациями возраст начала проявления симптомов заболевания в среднем составил 35-45 лет (13-70 лет), и не зависел от типа мутации. Однако, семье К.2. с делецией первого экзона можно отметить внутрисемейные различия по возрасту манифестации заболевания: у сестры пробанда заболевание манифестировало позже, а у дочери и племянника – раньше, в конце третьего и начале второго десятилетия жизни соответственно. Таким образом, наблюдается явление антиципации, описанное при SPG4 НСП (Burger et al., 2000). В семье Х.3. с мутацией с.321del29 (p.Val108SerfsX18) у матери пробанда заболевание проявилось в несколько более позднем возрасте. А в семье И.3. с мутацией с.885del10 (p.Thr295ThrfsX16) у сестры пробанда наблюдаются более легкие клинические симптомы. Возможно, здесь уже имеет место явление половых различий в пенетрантности SPAST мутаций. По этому поводу существуют сведения, что среди женщин встречается больше ассимптомных носителей, чем среди мужчин (Morita et al., 2002; Starling et al., 2002). В исследовании эпидемиологических характеристик наследственных спастических параплегий в Республике Башкортостан было установлено соотношение больных мужчин и женщин, равное 1,6:1. Подобные данные представлены и в работе Proukakis et al. (2011), доказывающей, что пенетрантность зависит от пола, и НСП более распространена среди мужчин.
Мутации в гене SPAST при спорадических случаях НСП не редки и встречаются в выборках почти всех исследователей (Braschinsky et al., 2010; Fei et. al., 2011), при этом в таких случаях именно миссенс-мутации являются более частыми, характеризующимися неполной пенетрантностью (Lindsey et al., 2000; Depienne et al., 2005; Elert- Dobkowska et al., 2015). По данным других исследователей, пенетрантность заболевания при мутациях в гене SPAST возраст зависимая, но может быть неполной даже в довольно зрелом возрасте (Fonknechten et al., 2000; Aridon et al, 2007).