Введение к работе
Актуальность проблемы. Под влиянием повреждающих факторов внешней среды может произойти нарушение гомеостаза живого организма. Это может привести либо к гибели, либо к адаптации организма к изменившимся условиям и установлению нового гомеостаза. Физиологические изменения в клетках организма могут стать предпосылкой и условием возникновения генетических изменений, то есть мутаций. Эта гипотеза была предложена М.Е.Лобашевым в 1947 году (Лобашев, 1947) и в последующем стала основой для развития генетических исследований на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Одним из направлений этих исследований стало изучение влияния белков теплового шока (БТШ) на мутационный процесс (Тихомирова и др., 1994). Перспективным подходом к исследованию этой проблемы является использование мутантных линий дрозофилы с нарушенным синтезом БТШ. Такая мутация l(l)ts403 была получена Р.Аркингом (Arking, 1975). Она была локализована в районе 9F Х-хромосомы Drosophila melanogaster (Zhimulev et al., 1981). Мутация l(l)ts403 принадлежит локусу sbr (ее синонимом является sbr10), однако между аллелями этого локуса существуют непростые аллельные отношения (Zhimulev et al., 1981). Было показано, что мутация l(l)ts403 обладает широким спектром плейотропных эффектов и после температурного воздействия затрагивает такие функции клетки и организма, как синтез БТШ (Evgen'ev et al., 1979, Евгеньев, Денисенко, 1990), расхождение половых хромосом в мейозе у самок мутантной линии, конденсацию хроматина и пролиферативную активность в митотических клетках, раннее эмбриональное развитие, морфогенез (Мамон и др., 1999). Подобные гены, как правило, являются консервативными в эволюции. Обнаружение гомологии между клонированными генами дрозофилы и генами человека, в свою очередь, открывает широкие возможности для всестороннего изучения структуры и функции гомологичных генов человека, т.к. дрозофила представляет собой удобную экспериментальную модель для молекулярно-генетических исследований. Изучение структуры и функции таких
генов у модельных объектов имеет значение не только для развития фундаментальных исследований, но и способствует всестороннему изучению функции гомологичных генов человека. Цель и задачи исследования:
Цель данной работы состоит в исследовании молекулярной структуры жизненно важного гена l(l)ts403, вовлеченного в контроль важнейших клеточных процессов, в том числе реакцию клеточного стресса. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Используя серию перекрывающихся делеций, определить локализацию гена,
мутация которого приводит к нарушению картины синтеза БТШ после ТШ в
линии дрозофилы l(l)ts403.
2. Определить характер доминирования для мутантного аллеля l(l)ts403 и
нормального аллеля данного гена по признаку нарушения синтеза БТШ после
ТШ.
-
Клонировать последовательность ДНК Х-хромосомы Drosophila melanogaster, содержащую ген l(l)ts403.
-
Методом гибридизации РНК-ДНК по Нозерну проверить, влияет ли мутация I(l)ts403 на сплайсинг мРНК гена Hsp83.
-
Секвенировать фрагменты нуклеотидной последовательности ДНК в области локализации гена l(l)ts403 и установить их гомологию с опубликованными в Интернете последовательностями генома дрозофилы.
6. Дать молекулярно-генетическую характеристику района ДНК, в котором
локализуется ген l(l)ts403.
Научная новизна и значимость работы.
Впервые клонирован в виде серии перекрывающихся фаговых клонов участок X-
хромосомы D. melanogaster протяженностью более 60 т.п.о., и в его составе ген
l(l)ts403.
Впервые выявлены 2 перекрывающихся транскрипта, считывающиеся с участка
ДНК, содержащего ген l(ljts403.
Впервые для нескольких линий Drosophila melanogaster описан межлинейный
полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, образуемых при гидролизе
эндонуклеазой рестрикции Hindlll и выявляемых при гибридизации с зондом из
области локализации reual(l)ts403.
Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные результаты
используются для дальнейшего исследования структуры и функций гена
l(l)ts403.
Полученные нами клоны были использованы в работе Е.Б.Кокоза (Kokoza,
Zhimulev, 1994) для выявления в геноме дрозофилы диспергированных повторов,
специфичных для половой хромосомы.
Фаговые и плазмидные клоны, полученные в данной работе, используются в
учебном процессе на кафедре генетики и селекции СПбГУ в практических
курсах для студентов и магистрантов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих
конференциях: на Лобашевских чтениях, посвященных 90-летию М.Е.Лобашева
(Санкт-Петербург, 1997); на семинарах лаборатории генетики животных БиНИИ
СПбГУ и специализации генетика животных кафедры генетики и селекции
СПбГУ; на Первой Всесоюзной конференции по генетике насекомых (Москва,
1991); на 37-й (Сан Диего, 1996), 38-й (Чикаго, 1997), 39-й (Вашингтон, 1998) и
41-й (Питтсбург, 2000) Международных конференциях по дрозофиле; на II
Съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 160 страницах, состоит из