Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Влияние добычи и переработки угля на живые системы 19
1.2. Хромосомные аберрации в оценке цитогенетического статуса человека 23
1.3. Генетическая обусловленность цитогенетических эффектов воздействия факторов окружающей среды 34
1.3.1. Гены-кандидаты индивидуальной чувствительности человека к действию мутагенов окружающей среды 35
1.3.2. Вклад полиморфизма генов-кандидатов в реализацию генотоксических эффектов воздействия окружающей среды 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 69
2.1. Принципы организации цитогенетического обследования населения угольного региона 69
2.2. Характеристика обследованных групп 73
2.3. Методы исследования 86
2.3.1. Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека 86
2.3.2. Выделение геномной ДНК 87
2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 88
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 94
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 99
3.1. Хромосомные нарушения у населения угольного региона 99
3.1.1. Характеристика основных цитогенетических показателей у жителей Кемеровской области в целом по базе данных 99
3.1.2. Хромосомные аберрации у населения сельских районов Кемеровской области 107
3.1.3 Анализ динамики повреждаемости хромосом у жителей промышленного центра 113
3.1.4. Хромосомные аберрации у жителей районов с неблагополучной онкоэпидемиологической ситуацией 121
3.1.5. Хромосомные аберрации у жителей Кемеровской области, работающих на предприятиях угольного цикла 125
3.1.6. Хромосомные аберрации у жителей Кемеровской области, подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в бытовых условиях 133
3.1.7. Уровень и спектр повреждений хромосом в лимфоцитах крови у жителей г. Кемерово больных раком легкого 139
3.2. Анализ полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК,
антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза в этнических группах жителей Кемеровской области 156
3.3. Полиморфизм генов-кандидатов у жителей Кемеровской области больных раком легкого 168
3.4. Изучение ассоциаций полиморфизма генов-кандидатов и изменчивости частоты аберраций хромосом у жителей Кемеровской области
3.4.1. Однолокусные эффекты и комбинации генов, сопряженные с изменчивостью частоты хромосомных аберраций у больных раком легкого 181
3.4.2. Изучение роли полиморфизма генов в изменчивости частоты аберраций хромосом у детей, проживающих в условиях действия сверхнормативных доз радона 193
3.4.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с формированием хромосомных аберраций у рабочих теплоэлектростанций 213
3.4.4. Изучение полиморфизма генов-кандидатов и изменчивости частоты аберраций хромосом у жителей области, не имеющих онкологических заболеваний и профессионально не контактирующих с известными генотоксикантами 228
3.5. Поиск прогностических моделей риска формирования хромосомных аберраций у жителей угольного региона 247
3.6. Характеристика системы комплексной оценки генетического статуса населения угольного региона 252
Заключение 256
Выводы 271
Список литературы
- Генетическая обусловленность цитогенетических эффектов воздействия факторов окружающей среды
- Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека
- Хромосомные аберрации у жителей районов с неблагополучной онкоэпидемиологической ситуацией
- Однолокусные эффекты и комбинации генов, сопряженные с изменчивостью частоты хромосомных аберраций у больных раком легкого
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Глобальной проблемой современного общества является накопление потенциально опасных генетических изменений (повреждений ДНК, патологических проявлений экспрессии генов) при действии различных факторов окружающей среды, которые способны приводить к увеличению генетического груза и росту заболеваемости населения (Бочков и др., 2015). Особенно остро эта проблема стоит для жителей промышленно развитых регионов. Известно, что работа предприятий угольного цикла связана со значительным загрязнением воздушного и водного бассейнов, с изменением ландшафтов, нарушением земель и загрязнением их отходами, с появлением большого количества загрязнителей, способных непосредственно воздействовать на здоровье человека (Мун, Глушков, 2013; Fernndez-Navarro et al., 2012; Cabarcas-Montalvo et al., 2012). Наиболее опасные токсиканты, связанные с добычей и переработкой угля, это угольные пылевые частицы разного размера (преимущественно, от 20 до 50 мкм), кварц, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), тяжелые металлы. Кроме того, уголь содержит природные радиоактивные вещества уранового, актиноуранового и ториевого рядов, что определяет радиологическую ситуацию в регионе. Комплексное действие этих радиационных и химических факторов способно вызывать различные виды повреждений ДНК, возможно появление эпигенетических аномалий, изменение экспрессии генов, а на уровне популяции - повышение онкологической заболеваемости населения (Rohr et al., 2013; Guerrero-Castilla et al., 2014; Len-Mejaet et al., 2014). Это определяет необходимость разработки методов генетического мониторинга, учитывающих экологические, эпидемиологические факторы, этнические и молекулярно-генетические особенности населения.
Степень разработанности темы исследования. Важным внутренним фактором риска патологического изменения генома является наследственная предрасположенность. Она может обусловливать повышение уровня повреждений ДНК в результате действия мутагенов окружающей и производственной среды и в значительной мере определять риск развития злокачественной трансформации клеток. Одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения России и мира занимает рак легкого, этиологически связанный с особенностями
индивидуальной чувствительности к факторам окружающей и производственной среды, вредным привычкам, образу жизни (Чиссов, 2012; Кижаев и др., 2015). Фундаментальной научной проблемой является изучение роли наследственной предрасположенности к формированию повреждений хромосом и развитию рака легкого у жителей, проживающих в условиях высокой канцерогенной нагрузки.
Известно, что ключевым моментом для формирования устойчивости организма к мутагенному и канцерогенному влиянию среды являются молекулярные особенности систем защиты генома. Полногеномные исследования ассоциаций (GWAS) выявили локусы, связанные с развитием рака легкого, молочной железы, колоректального рака и других форм (Peters et al., 2012; Poirier et al., 2015; Lindstrm et al., 2015 и др.). С использованием анализа генов-кандидатов выявлено достаточно большое количество маркеров, ассоциированных с формированием геномной нестабильности, в условиях действия генотоксических факторов химической и радиационной природы (Сальникова, 2011; Волков и др., 2013; Литвяков и др., 2013; Мейер и др., 2014; Kadioglu et al., 2012; Ada et al., 2013; Weinhold et al., 2013; Costa et al., 2014; Hemminki et al, 2014, 2015; Vodicka et al., 2015; Santovito et al., 2015). Была показана значимость полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксено- и эндобиотиков, антиоксидантного статуса, репарации ДНК, метилирования ДНК, контроля клеточного цикла, апоптоза. Однако эффекты данных локусов оказались крайне неоднозначными, что может быть связано с многообразием действующих факторов среды, расовыми и этническими особенностями, с генетической гетерогенностью популяций, с особенностями ген-генных и ген-средовых взаимодействий, с проблемой множественных сравнений (Barnett et al., 2012). В то же время выявление профилей генетического риска, основанных на анализе SNP, может помочь стратифицировать индивидов в группах с различными вариантами ответа на то или иное мутагенное воздействие, что важно как для фундаментального понимания процессов, так и для разработки индивидуальных профилактических программ. Не изучена роль наследственной предрасположенности в формировании геномной нестабильности у населения угольных регионов. Исходя из вышесказанного, были определены цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы: на основе комплексного анализа повреждений хромосом и полиморфных локусов генов-кандидатов охарактеризовать цитогенетический статус и
особенности формирования наследственной предрасположенности к цитогененетической нестабильности у населения угольного региона.
Задачи исследования:
-
Провести исследование уровня и спектра хромосомных аберраций у жителей промышленного центра и сельских территорий угольного региона (Кемеровской области) в период c 2001 по 2015 гг. Оценить динамику и верифицировать значения фоновых показателей хромосомной нестабильности в регионе.
-
Изучить уровень и спектр повреждений хромосом у рабочих угольных предприятий (шахты, угольные теплоэлектростанции).
-
Дать оценку цитогенетического статуса жителей Кемеровской области, контактирующих со сверхнормативными дозами радона в быту.
-
Проанализировать уровень и спектр хромосомных аберраций у населения территорий, отличающихся высокой частотой онкологических заболеваний и определить значимость показателей хромосомной нестабильности в клетках крови в качестве предикторов риска рака легкого.
-
Выполнить сравнительный анализ полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1 (del), GSTT1 (del), CYP1A1 (rs4646903 T>C; rs1048943 A>G), CYP1A2 (rs762551 C>A), GSTP1 (rs1138272 С>Т; rs1695 A>G), репарации ДНК (XRCC2 (rs3218536 G>A), XRCC3 (rs861539 C>T), XRCC1 (rs25489 G>A; rs25487 A>G; rs1799782 C>T), APEX1 (rs1130409 T>G), hOGG1 (rs1052133 C>G ), ADPRT (rs1136410 T>C), XPG (rs17655 G>C), XPD (rs13181 T>G), XPC (rs2228001 A>C); ATM (rs1801516 G>A), NBS1 (rs1805794 С>G)), антиоксидантной защиты (GPx1(rs1050450 C>T), SOD2 (rs4880 T>C), CAT (rs1001179 C>T)), контроля метилирования и метаболизма фолатов (MTHFR (rs1801133 C>T), MTR (rs1805087 A>G)), контроля клеточного цикла и апоптоза (ТР53 (rs1042522 G>C)) у жителей Кемеровской области, работающих на предприятиях угольного цикла; больных раком легкого и не имеющих онкологических заболеваний; подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в жилых помещениях с учетом этнической принадлежности индивидов.
-
Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с хромосомными аберрациями в клетках крови в группах больных раком легкого,
рабочих угольных теплоэлектростанций, детей, проживающих в условиях воздействия сверхнормативных доз радона, с учетом этнической принадлежности индивидов.
-
На основе изучения моделей взаимодействия генов ферментов репарации ДНК, биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза выявить ключевые полиморфизмы и оценить значимость их взаимодействия в формировании наследственной предрасположенности к накоплению повреждений хромосом у жителей угольного региона.
-
Разработать систему оценки генетического статуса населения угольного региона с учетом состояния окружающей среды, онкологической заболеваемости и молекулярно-генетических особенностей жителей.
Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ
хромосомных аберраций у населения угольного региона с учетом наследственной
предрасположенности к формированию повреждений хромосом. Впервые выявлено
снижение уровня аберраций хромосом у жителей промышленного центра
(г.Кемерово) в период 2005 - 2013 гг. по сравнению с 1986-2000 гг., что согласуется
со спадом производства, закрытием шахт и последовавшим снижением загрязнения
окружающей среды города. Установлено, что уровень и спектр повреждений
хромосом у жителей сельскохозяйственных территорий Кемеровской области,
удаленных от промышленных центров и угольных месторождений, в период 2001-
2011 гг. не отличался от данных, полученных в этом регионе ранее (1993-2000 гг.),
что позволило впервые верифицировать региональный фоновый уровень
хромосомных аберраций. Впервые у населения угольного региона проведено
сопоставление цитогенетических биомаркеров эффекта воздействия окружающей
среды (хромосомных аберраций) и стандартизованной онкологической
заболеваемости. В районах с высокой заболеваемостью злокачественными новообразованиями частота хромосомных аберраций у населения оказалась статистически значимо выше, чем у жителей территорий с благополучной онкоэпидемиологической ситуацией. Впервые на достаточно большой выборке жителей угольного региона (746 человек: 411 больных и 335 здоровых) изучены повреждения хромосом у больных раком легкого и показана предиктивная
значимость в отношении риска рака легкого цитогенетических показателей в клетках крови с учетом ведущих конфаундеров (возраста, курения, производственного стажа, хронических заболеваний дыхательной системы).
В результате молекулярно-генетического анализа получены новые знания о распределении полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК, антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза у жителей Кемеровской области с учетом этнической принадлежности. Впервые на основе анализа полиморфных вариантов генов у жителей г. Кемерова выявлена ассоциация локуса XPD (rs13181 T>G) с развитием плоскоклеточного рака легкого. Впервые показано, что ведущую роль в формировании повреждений хромосом при действии сверхнормативных доз радона в быту, играют полиморфные локусы CYP1A1 (rs1048943 A>G), GSTP1 (rs1695 A>G), XRCC2 (rs3218536 G>A), АТМ (rs1801516 G>A), TР53 (rs1042522 G>C) - у шорцев, XPD (rs13181 T>G) и TР53 (rs1042522 G>C) - у русских. Формирование повреждений хромосом в результате воздействия факторов производственной среды у рабочих теплоэлектростанций связано с полиморфными вариантами генов CYP1A1 (rs4646903 T>C), hOGG1 (rs1052133 C>G), XRCC1 (rs25489 G>A). У больных раком легкого, проживающих в угольном регионе, формирование повреждений хромосом связано с полиморфными вариантами генов XPD (rs13181 T>G), GSTM1 del и APEХ1 (rs1130409 T>G).
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы вносят вклад в общее представление об особенностях мутационного процесса у населения территорий с развитой угольной промышленностью. Полученные данные имеют важное значение при оценке токсико-генетических эффектов в других популяциях со сходным спектром действующих факторов окружающей и производственной среды. Полученные сведения вносят вклад в понимание структуры наследственной предрасположенности к формированию хромосомных повреждений при действии различных факторов окружающей и производственной среды. Результаты исследования структурных повреждений хромосом, генов-кандидатов, особенности их ассоциации с аберрациями хромосом в выборках, дифференцированных по полу и этнической принадлежности, целесообразно использовать в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска; полученные данные могут
быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования.
Методология и методы исследования. Методологическую основу работы составил системный подход, основывающийся на использовании комплекса методов цитогенетики, молекулярной генетики, онкоэпидемиологии, медицинской статистики, анализа результатов исследований ведущих отечественных и зарубежных ученых в области экологической и медицинской генетики. Единообразный подход к организации и проведению цитогенетических исследований позволил сопоставить параметры цитогенетического статуса у представителей различных групп жителей угольного региона. Были унифицированы все используемые лабораторные методы (условия культивирования клеток, подготовки препаратов, анализа хромосомных аберраций, верификации результатов). Цитогенетический анализ был дополнен изучением молекулярно-генетических особенностей индивидуумов, оказывающих существенное влияние на индивидуальную токсико-генетическую чувствительность к факторам среды. Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории цитогенетики ФИЦ УУХ СО РАН и на кафедре генетики КемГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Выраженные мутагенные эффекты у населения угольного региона обусловлены
воздействием факторов производственной среды угольных предприятий и
контактом со сверхнормативными дозами радона в быту. Наиболее высокая
частота клеток с хромосомными аберрациями отмечена у шахтеров - 5,21 ± 0,23%,
сотрудников угольных теплоэлектростанций - 3,91 ± 0,15% и у жителей,
подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона в домах (4,25 ±
0,13%).
2. Полиморфизм генов ферментов репарации ДНК, антиоксидантной защиты,
биотрансформации ксенобиотиков, метаболизма фолатов, контроля клеточного
цикла и апоптоза в этнических группах (русских, шорцев), проживающих в
Кемеровской области, характеризуется широким аллельным разнообразием.
Межэтнические различия выявлены по распределению полиморфных вариантов
генов hOGGl (rsl052133 C>G), ADPRT (rsll36410 T>C), XPG (rsl7655 G>C),
GSTM1 (del), GSTP1 (rs1138272 С>Т), CYP1A1 (rs1048943 A>G), АТМ (rs1801516 G>A), SOD2 (rs4880 Т>С).
3. С формированием хромосомных аберраций под действием сверхнормативных доз радона в быту у шорцев ассоциированы полиморфные варианты генов CYP1A1 (rs1048943 A>G), GSTP1 (rs1695 A>G), XRCC2 (rs3218536 G>A), АТМ (rs1801516 G>A), TР53 (rs1042522 G>C), а у русских - XPD (rs13181 T>G) и TР53 (rs1042522 G>C). У рабочих угольных теплоэлектростанций формирование хромосомных нарушений ассоциировано с полиморфными локусами CYP1A1 (rs4646903 T>C), hOGG1 (rs1052133 C>G) и XRCC1 (rs25489 G>A). Наследственная предрасположенность к формированию плоскоклеточного рака легкого и к накоплению хромосомных аберраций в клетках крови у больных связана с вариантами гена XPD (rs13181 T>G).
Степень достоверности и апробация результатов. Использование современных молекулярно-биологических, цитогенетических и биостатистических методов, большой объем выполненных лабораторных исследований подтверждает достоверность результатов проведенной работы. Полученные данные соответствуют результатам, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Статистический анализ подтверждает достоверность полученных результатов. Выводы полностью и в логической последовательности отражают полученные результаты.
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на собраниях европейского общества мутагенов окружающей среды (Annual Meeting European Environmental Mutagen Society: Salzburg, 1998; Budapest, 2000; Aberdeen, 2003; Maastricht, 2004; Oslo, 2010), 6th Conference of the Pan African Environmental Mutagen Society (Cape Town, South Africa, 2008), 10th International Conference on Enviromental Mutagens (Firenze, Italy, 2009), съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; г. Санкт-Петербург, 2015), V Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2009), съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009; Ростов-на-Дону, 2014), пленумах Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации (Москва,
2010, 2011), конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2011), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской генетики» (Барнаул, 2015), VI Международной научно-практической конференции «Aктуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на Дону, 2015), Петербургском онкологическом форуме «Белые ночи-2015» (Санкт-Петербург, 2015).
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №07-04-96026-р_урал_а ,
№12-04-32117 №13-06-98014 р-Сибирь-а, Государственных контрактов №
02.512.11.2233, №16.512.11.2062 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы», государственного задания Минобрнауки РФ №2014/64 и гранта РНФ № 16-15-00034.
Личный вклад автора. Автором исследования лично разработана идея и дизайн исследования. Все результаты генетических исследований, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора. Автор являлся организатором и непосредственным участником экспедиций по изучению генома жителей Кемеровской области. Автором самостоятельно осуществлен весь объем статистического анализа диссертационных материалов и выполнено обобщение полученных результатов. Переработан и значительно увеличен (на 1978 человек) банк цитогенетических данных (хромосомные аберрации) у жителей Кемеровской области. Проведен анализ динамики цитогенетических характеристик у населения Кемеровской области за период 1986 - 2015 гг. Собрана коллекция ДНК жителей Кемеровской области, стратифицированная по национальности, месту жительства, профессии, состоянию здоровья. Создан банк данных о распределении генетических маркеров у представителей коренного (шорцы) и пришлого (русские) населении Западной Сибири, содержащий информацию о распределении частот аллелей и генотипов полиморфных локусов, кодирующих белки репарации ДНК, антиоксидантной защиты, метаболизма ксенобиотиков и фолатов, контроля клеточного цикла и апоптоза. В сотрудничестве с коллегами (онкоэпидемиологи к.м.н. С.А. Мун, к.м.н. С.А. Ларин) сопоставлены показатели онкологической
заболеваемости и хромосомного мутагенеза у жителей различных территорий Кемеровской области.
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 46 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук и в том числе 19 статей, индексируемых в базах Web of Science или Scopus. По результатам работы был зарегистрирован патент РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационная работа «Молекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к формированию цитогенетической нестабильности у населения угольного региона» соответствует формуле специальности «03.02.07 – Генетика (биологические науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Генетика человека. Медицинская генетика».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 374 страницах, иллюстрирована 51 таблицей и 85 рисунками. Список литературы содержит 466 источников, из них 400 зарубежных.
Генетическая обусловленность цитогенетических эффектов воздействия факторов окружающей среды
Неорганические элементы угля могут посредством образования свободных радикалов индуцировать однонитевые разрывы (Rojas et al., 1996). Помимо этого, металлы способны модулировать экспрессию генов ферментов (Jomova, Valko 2011). ПАУ могут индуцировать формирование повреждений ДНК через другие механизмы, например, через образование аддуктов, через действие электрофильных метаболитов, способных после метаболической активации ферментным комплексом Р450, ковалентно связываться с пуринами (например, с гуанином). Международным агентством по изучению рака (The International Agency for Research on Cancer – IARC) признано существование достаточных доказательств канцерогенности кварца (основной составляющей угольной пыли) у экспериментальных животных и у людей (IARC, 2012). Канцерогенность кварца связывают с индукцией активных форм кислорода, которые вовлечены в различные механизмы развития окислительного стресса, такие как укорочение теломер, изменение генной экспрессии, воспаление, перекисное окисление липидов (Peluso et al., 2015).
Эксперименты показывают, что воздействие угольной пыли вызывает молекулярные, клеточные и гистопатологические изменения у животных (Caballero-Gallardo, Olivero-Verbel, 2016). В одной из работ для моделирования естественного воздействия, мышей содержали в течение восьми недель в коробках, содержащих смесь песка и частиц угольной пыли диаметром менее 38 мкм, полученных из минеральных образцов, собранных в крупнейшей угольной шахте в Южной Америке (Ла-Лома, Cesar, Колумбия). Методами ДНК-комет и микроядерным тестом были выявлены генотоксические эффекты в клетках крови мышей. Методом ПЦР в реальном времени было показано увеличение мРНК CYP1A1 и подавление мРНК SOD1, SCD1 и NQO1 печени у мышей, живущих на песке с концентрацией угольной пыли больше 2%, по сравнению с мышами, жившими на песке без угольной пыли. Данная модель наглядно выявила опасность для популяций диких животных угольной пыли, в изобилии оседающей на почвах угледобывающих регионов (Caballero-Gallardo, Olivero-Verbel, 2016). Исследования животных, отловленных в угледобывающих районах, указывают на формирование у них цитотоксических и генотоксических эффектов воздействия угольной пыли. Например, повышенная степень повреждения ДНК была зарегистрирована у диких грызунов и зеленых игуан из угледобывающих районов Бразилии и Колумбии (Len et al., 2007; Cabarcas-Montalvo et al., 2012).
Цитогенетические исследования у рабочих предприятий угольного цикла (добыча – обогащение - сжигание угля) свидетельствуют о значительном уровне повреждений ДНК у персонала, работающего в условиях воздействия высоких концентраций угольной пыли (Donbak et al., 2005; Kumar et al., 2011; Kvitko et al., 2012; Rohr et al., 2013; Len-Meja et al., 2014). Результаты исследований у рабочих угольных шахт и разрезов, выполненных в разных странах мира (Россия, Турция, Бразилия, Колумбия, Нидерланды, Перу, Индия) свидетельствуют о высоком уровне хромосомных нарушений у рабочих угледобывающей индустрии. Повреждения накапливаются в клетках разного типа (буккальный эпителий и лимфоциты крови) и выявляются методами учета ХА, сестринских хроматидных обменов, микроядер и ДНК-комет, что свидетельствует о сложной природе действующих генотоксикантов.
Результаты анализа взаимосвязи между цитогенетическими маркерами, возрастом и продолжительностью работы во вредных условиях противоречивы. Например, в исследовании индийских авторов было показано, что рабочие, контактирующие с каменноугольной смолой в возрасте 47–60 лет, характеризуются большей частотой повреждений хромосом, чем шахтеры моложе 47 лет (Kumar et al., 2011). Уровень микроядер в эксфолиативных клетках у рабочих со стажем более 25 лет был выше, чем у рабочих с меньшей продолжительностью стажа. В то же время в работах бразильских авторов не было обнаружено взаимосвязи между цитогенетическими маркерами, возрастом и стажем (Len-Meja et al., 2011; Rohr et al., 2013). В работе турецких авторов (Donbak et al., 2005) была выявлена значимая корреляция между частотой ХА, сестринскими хроматидными обменами и стажем, но не возрастом.
Хроническaя ингaляция сложной смесью веществ, тaких кaк ПАУ, тяжелые метaллы, рaдионуклиды и другие, может привести к формированию рaзличных легочных зaболевaний, тaких как хронический пылевой бронхит, пневмокониоз, эмфизема и рак легкого (Schins et al., 1999). Формирование профессионально обусловленной легочной патологии может сопровождаться в свою очередь индукцией цитогенетических повреждений (Ulker et al., 2008). Значительный уровень повреждений ДНК отмечается у рабочих коксохимического производства (Ada et al., 2013; Cheng et al., 2013; Sureshkumar et al., 2013). Контакт с высокими концентрациями ПАУ, образующимися при коксовании угля, обусловливает как накопление аберраций хромосом, так и рост онкологической заболеваемости (Минина и др., 2006). В единичных цитогенетических исследованиях в условиях теплоэлектростанций, работающих на каменном угле, также отмечался высокий уровень повреждений хромосом (Celic et al., 2007; Савченко и др., 2008).
Результаты масштабного цитогенетического мониторинга генотоксических эффектов среды у населения угольного региона, охватывающего локальные территории с различающимися параметрами экологического состояния среды, ранее были представлены в работе Дружинина (2003). Установлено, что максимальных значений частота ХА достигала у жителей городов, причем это было характерно как для крупных промышленных центров, так и для малых шахтерских городов. Значимо меньшие уровни ХА были зарегистрированы в лимфоцитах населения непромышленных населенных пунктов. Однако анализ состояния гигиенических параметров среды даже непромышленных населенных пунктов, изначально отнесенных в группу «базисного контроля», показал несостоятельность исходных представлений об этих территориях как «экологически чистых». В связи с этим сделано заключение о сложности поиска контрольных выборок из числа жителей промышленного региона и необходимости дифференцированного подхода при определении фонового регионального уровня (Дружинин, 2003).
Постоянное изменение уровня и спектра генотоксической нагрузки окружающей среды на организм человека обусловливает необходимость постоянного мониторинга генетических повреждений, особенно у жителей территорий, проживающих в условиях мощного антропогенного воздействия (Santovito et a., 2015). Поэтому периодическая верификация цитогенетических эффектов у населения угольного региона, проводимая с учетом генотоксической и канцерогенной нагрузки окружающей среды, с одной стороны, и особенностей индивидуальной чувствительности, с другой, представляется важной научной проблемой, имеющей медицинское и социально-экономическое значение.
Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека
Материалом для исследования хромосомных аберраций (ХА) служила цельная периферическая кровь (1мл), которая забиралась квалифицированным медицинским работником в асептических условиях в системы «Вакутейнер» с гепарином в качестве антикоагулянта. Культивирование клеток крови проводили по стандартному полумикрометоду (Hungerford, 1965). Смесь для культивирования готовили из расчета: среда RPMI–1640 с гентамицином (4,5 мл), эмбриональная телячья сыворотка (1 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко) и помещали в стерильные культуральные флаконы. Затем в каждый флакон добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Для каждого человека готовилось две культуры. Культуральные флаконы выдерживали при 370С в течение 48 ч. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки 0,55 % KCl (в течение 20 мин) и фиксации клеток в 3 сменах охлажденного метанол-уксусного фиксатора (3:1) суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали. Препараты окрашивали 1% красителем Гимза (Merk) и анализировали при помощи микроскопов Carl Zeiss: AxioImager M2, AxioScope.A1, Axioskop 2 plus.
Учет аберраций хромосом проводили на зашифрованных препаратах. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Бочков и др., 2001; Carrano, Natarajan, 1988). На каждого человека анализировали 100-1000 метафаз (в среднем, 200 клеток). Долю аберрантных метафаз определяли как отношение числа клеток c аберрациями хромосом к общему числу изученных клеток. Учитывали аберрации хроматидного (одиночные фрагменты и межхроматидные обмены) и хромосомного типов (парные фрагменты, дицентрические хромосомы с фрагментами и без, кольцевые хромосомы, атипичные моноцентрики). Ахроматические пробелы в число аберраций не включали. Мультиаберрантные, rogue cells в общий анализ не включали, а учитывали отдельно. Верификацию спорных вариантов осуществляли путем повторного анализа разными исследователями. Результаты анализа ХА заносили в электронную базу данных. 2.3.2. Выделение геномной ДНК
ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Кровь 4 мл набирали в системы «Вакутейнер» с антикоагулянтом 0,25 мМ ЭДТА-Na, затем переносили в пробирки типа Эппендорф. Из отстоявшейся крови забирали надосадочный слой (плазму) и кольцо лейковзвеси, которые переносили в чистую пробирку и центрифугировали (2000 об/мин, 5 мин). Плазму удаляли, а к осадку добавляли 500 мкл NH4Cl, ресуспендировали, отстаивали 10 мин и вновь центрифугировали. Вновь вносили 500 мкл NH4Cl и повторяли процедуру до получения белого осадка лейковзвеси, который далее хранили при -200С.
Пробирки с клиническими образцами центрифугировали 5 минут на максимальной скорости (14 т. о./мин.). Осадок ресуспендировали в 300 мкл. раствора № 1 (100mM Tris HCl pH = 8, 100mM NaCl, 10mM EDTA). Добавляли 40 мкл. раствора № 2 (10% додецил сульфат натрия (SDS) и 10 мкл. протеиназы К (10 мг/мл). Хорошо перемешивали и инкубировали при 55 С, 1 час. Добавляли 200 мкл. фенола и 200 мкл. хлороформа. Интенсивно перемешали и центрифугировали 10 минут на максимальной скорости. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, не трогая лишнего и интерфазу. Добавляли 400 мкл. хлороформа. Перемешивали и центрифугировали 5 минут на максимальной скорости (14 т. о./мин.). Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку. Добавляли 10 мкл. ЛПААГ, 40 мкл. 3М АсNa pH = 5,4, перемешивали. Добавляли 800 мкл. 96% этанола, перемешивали. Инкубировали ночь на +4 С. Центрифугировали 15 минут на максимальной скорости. Супернатант удаляли, осадок промывали 400 мкл. 75% этанола. Сушили пробирки с открытыми крышками в термостате для микропробирок при 37 С в течение 15 минут до исчезновения запаха спирта. Осадок растворяли в 300 мкл. ТЕ-буфера (10mM Tris HCl pH = 8, 0,5 mM EDTA). Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 С. Проверку качества выделенной ДНК (концентрацию в базовых и рабочих растворах) проводили при помощи NanoPhotometer p330 (Implen). 2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Анализ полиморфных локусов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторах: CFX96 (Bio-Rad, США), iCycler iQ5 (Bio-Rad, USA), «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для различных методов ПЦР-анализа представлены в табл. 13-15.
Типирование локусов XRCC2 (rs3218536), XRCC3 (rs861539), GPx1 (rs1050450), SOD2 (rs4880), MTHFR (rs1801133), MTR (rs1805087), GSTP1 (rs1695, rs1138272), ТР53 (rs1042522), CYP1A1 (rs1048943), CYP1A2 (rs762551) проводили методом realime ПЦР с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов с использованием наборов реактивов СибДНК (СибДНК, Новосибирск). Каждый образец амплифицировался с использованием пары специфических праймеров и двух зондов, несущих «гаситель» на 3 -конце (BHQ) и флуоресцентных красителей (FAM и R6G) на 5 -конце (таблица 13).
Хромосомные аберрации у жителей районов с неблагополучной онкоэпидемиологической ситуацией
В изученных районах базовой отраслью экономики является сельское хозяйство (животноводство, растениеводство) и вследствие этого уровень хромосомных мутаций у населения статистически значимо ниже, чем у жителей промышленных городов или шахтерских поселков Кемеровской области. Так, ранее было показано, что у жителей г. Новокузнецка частота ХА- 4,56 ± 0,22%, г. Мыски - 6,62±0,53%, г. Таштагола -4,53±0,11% (Дружинин, 2003). Однако, несмотря на отсутствие техногенных воздействий, на отдельных изученных территориях наблюдался повышенный уровень ХА. Например, у детей в с. Красное Ленинск-Кузнецкого района - 3,45%, а у взрослых - 4,14%, у взрослых в п. Ленинский и п. Юрты-Константиновы Яшкинского района -4,46 % и 3,93% соответственно. Вместе с тем, согласно сведениям областного комитета природных ресурсов, Яшкинский район практически не испытывает техногенной нагрузки. В районе развито животноводство, ведется добыча щебня, песка и других дешевых строительных материалов. В связи с этим, в качестве возможной гипотезы можно рассматривать влияние повышенного уровня пыли (кремниевых частиц), способных индуцировать мутагенез (Дурнев, 2008).
Основные экологические проблемы Яшкинского и Ленинск-Кузнецкого районов (с.Красное) могут быть связаны с использованием ядохимикатов в хозяйственной деятельности; с загрязнением поверхностных и подземных вод хозяйственно-бытовыми и ливневыми стоками из-за отсутствия очистных сооружений, отсутствия системы канализования, отсутствия полигонов по захоронению и складированию отходов. Данная ситуация может считаться одной из основных причин периодического повышения генотоксического давления среды на сельских территориях. Обследование жителей Яшкинского района в 2008 г. (с. Пача) не показало повышенного уровня хромосомных нарушений. Для проверки предположения об эпизодичности выбросов генотоксикантов, конечно, следует провести мониторинг ХА у населения с повышенной частотой хромосомных нарушений на протяжении как минимум нескольких лет.
Частота встречаемости клеток с хромосомными аберрациями в изученных группах жителей Кемеровской области не зависела от пола (2,97 ± 0,13% - у женского пола и 2,74 ± 0,14%- у мужского). Различия между детьми и взрослыми не достигали статистической значимости, хотя средние значения (табл.20) и медианы (рис.9) у взрослых демонстрировали смещение в сторону больших значений.
Частота клеток с хромосомными аберрациями у детей и взрослых, проживающих в сельскохозяйственных районах Кемеровской области. Примечание. по оси абсцисс - группы взрослые и дети, по оси ординат - частота метафаз с хромосомными аберрациями, %
У детей повышенный уровень ХА был отмечен в с.Красное (4,14 %) и значительно более низкий - в с.Раздолье (1,89 %). У взрослых наименьшая частота ХА отмечена у жителей с.Зарубино Топкинского района, что статистически значимо ниже, чем у жителей с.Красное, с.Юрты-Константиновы, п.Ленинский и с.Раздолье.
Этническая принадлежность обследованных не оказывала модифицирующего влияния на цитогенетические характеристики. Все обследованные жители с. Беково Беловского района были телеутами (коренной малочисленный народ Кемеровской области). Частота повреждений хромосом у них (2,74 ± 0,25%) не превышала средних значений у русских из сельских районов области (2,91 ±0,12%). Среди обследованных жителей Яшкинского района были татары (N=24) и русские (N=8). Частота аберрантных метафаз у них также значимо не различалась (4,27 ± 0,59% у татар и 4,90 ±0,90% у русских). Статус курения влияние на частоту ХА оказывал только на уровне тенденции (рис.10). Ill Рисунок 10. Частота хромосомных аберраций у курящих и некурящих сельских жителей Примечание. по оси абсцисс - группы курящих и некурящих, по оси ординат - частота метафаз с хромосомными аберрациями, % Установлено, что преобладающим типом повреждений хромосом у обследованных жителей сел Кемеровской области являются аберрации хроматидного типа - 2,12± 0,08%. Нарушения, захватывающие обе хроматиды - аберрации хромосомного типа, встречались в среднем, с частотой 0,84 ± 0,05% (табл. 21).
Результаты, полученные в данном исследовании, хорошо согласуются с оценками ХА, полученными в Кузбассе 1986-2000 гг. Тогда, в результате обследования ПО человек, проживающих в сельских районах Кемеровской области (п.Крапивинский, с.Тараданово, д.Усманка, Топки); суммарно 95 детей, 15 взрослых), было установлено, что частота аберрантных метафаз составила, 2,86 ± 0,26% (Дружинин, 2003). Учитывая воспроизводимость результатов, полученных в разные десятилетия и довольно большой объем выборки (суммарно N=501), можно определить региональный фоновый уровень хромосомных повреждений в Кемеровской области. В результате объединения результатов всех цитогенетических исследований за период 1990 -2011 гг., было установлено, что у детей сельских районов Кузбасса среднее значение частоты аберрантных метафаз составило- 2,72 ± 0,11% (N=362; ДИ:2,51-2,93), а у взрослых -3,22 112 ± 0,20 % (N=139; ДИ:2,82-3,63). Суммарно у детей и взрослых за все периоды - 2,86 ± 0,09 % (ДИ: 2,67-3,05).
Однолокусные эффекты и комбинации генов, сопряженные с изменчивостью частоты хромосомных аберраций у больных раком легкого
Наблюдаемые неблагоприятные эффекты у шахтеров и рабочих ТЭС могут быть связаны с воздействием специфического комплекса факторов производственной среды, включающего в себя: угольную пыль в высоких концентрациях, сверхнормативное воздействие радона, присутствие тяжелых металлов, ПАУ и других летучих опасных соединений, изменение газового состава воздуха; а также производственный шум, вибрацию, неблагоприятный микроклимат, физические нагрузки (Панаиотти, 2009; Агафонов, 2013). Среди химических веществ генотоксическую опасность могут представлять полициклические ароматические углеводороды, фенол, сероводород, окислы азота, аэрозоли масел. Особое значение для предприятий угольного цикла имеет воздействие пыли, содержание которой в воздухе рабочих зон многократно превышает ПДК. С особенно высокими концентрациями угольной пыли сталкиваются, конечно, шахтеры. Известно, что пылевые частицы способны аккумулировать на своей поверхности молекулы бензо(а)пирена, а также альфа-частицы радона, переносить их на большие расстояния и при вдыхании, попадать внутрь организма. В клетках легких частицы пыли способны вызывать образование активных форм кислорода (АФК), вызывающих повреждение оснований ДНК, повреждение дезоксирибозы, появление новых ковалентных связей («сшивок») и другие изменения. Воздействие неорганических компонентов угля способно вызывать изменение генной экспрессии многих ферментов систем защиты генома, укорачивание теломер, воспаление, образование вторичных реактивных продуктов, таких как липидные пероксиды, диеновые кетоны, диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, которые, в свою очередь, тоже инициируют свободнорадикальные процессы. Гипоксические состояния, обусловленные пониженным содержанием кислорода в воздухе забоев и нарушением вентиляции легких, усугубляют деструктивные процессы в клетках.
Средние значения ХА, полученные у угольщиков в данном исследовании, оказались близки к значениям, установленным у шахтеров и рабочих ТЭС в Турции (Donbak et al., 2005; Celic et al., 2007). Анализ качественного спектра нарушений структуры хромосом (табл.26-27) позволил установить, что у угольщиков Кемеровской области повышена частота встречаемости аберраций как хромосомного, так и хроматидного типов. Отличия в частоте ХА между шахтерами и рабочими ТЭС складываются преимущественно за счет аберраций хромосомного типа. Этот тип повреждений, включающий маркерные для радиационных воздействий дицентрические и кольцевые хромосомы, регистрировался у шахтеров в 3 раза чаще, чем у рабочих ТЭС.
При изучении шахтеров удалось минимизировать влияние на результаты цитогенетического анализа таких факторов как: пол (все мужчины) и возраст (все старше 40 лет, значимо по возрасту не различаются). У курящих шахтеров отмечалось повышение частоты аберраций хромосомного типа (1,95 ± 0,13% - у курящих против 1,56 ± 0,14% - у некурящих, р=0,04). Однако даже при отсутствии влияния фактора курения, нарушения подобного типа у шахтеров встречались чаще, чем в контроле (1,56 ± 0,14% против 0,26 ± 0,04 %, р=0,00001). У значительной части обследованных шахтеров был зарегистрирован хронический пылевой бронхит (N=58). Частота ХА у них статистически значимо не отличалась от значений, полученных в группе шахтеров без хронических заболеваний (5,52 ± 0,34% против 5,21 ± 0,38%, N=42, р 0,05). В группе рабочих ТЭС было установлено, что пол, возраст и статус курения статистически значимо не модифицировали частоту клеток с ХА (рис.22).
Зарегистрированных случаев профессионально обусловленной патологии в обследованной группе рабочих ТЭС отмечено не было. Оценка повреждений хромосом в зависимости от хронических заболеваний (их наличие против отсутствия) не показала статистически значимых отличий в исследуемых группах (р 0,05). Наиболее часто встречались две основные группы заболеваний: болезни органов дыхания и органов пищеварения. У рабочих ТЭС с заболеваниями органов дыхания частота ХА была статистически значимо выше, чем у больных группы контроля (5,45 ± 0,71% (N=22) против 1,90 ± 0,37% (N=21, р=0,0003). У рабочих с заболеваниями пищеварительной системы частота ХА была статистически значимо выше, чем у больных группы контроля (5,00 ± 0,56% (N=33) против 2,76 ± 0,47% (N=17), р=0,01). Таким образом, пол, возраст, статус курения и хронические заболевания значимо не модифицировали повреждаемость хромосом у обследованных угольщиков.
Вместе с тем прослеживалось значимое влияние на цитогенетические параметры производственных условий. Среди обследованных угольщиков самые высокие значения ХА отмечались у шахтеров - проходчиков (5,76 + 0,51%), машинистов горновыемочных машин (5,20 + 0,76), электрослесарей (5,26 + 1,15%), горнорабочих очистного забоя (4,29 + 0,525). Все данные профессии связаны с работой под землей в течение полной смены. Концентрации угольной пыли в воздухе рабочих мест у них достигали 180 мг/м3 , что в 45 раз превышает ПДК. У двух рабочих горноочистного забоя помимо повышенной средней частоты клеток с ХА (4,5%) были дополнительно выявлены roque-клетки со множественными повреждениями хромосом обменного типа. Природа roque-клеток пока вызывает дискуссии, но многие сходятся в том, что существует значимый вклад радиационного фактора в их формирование, в частности high LET - радиации с внутренним облучением организма -частицами (Асеева и др., 2010).
В условиях ТЭС наиболее высокие значения частоты клеток с хромосомными нарушениями отмечались у рабочих топливно-транспортного цеха (4,19 + 0,19%), химического (3,86 ±0,42%), электрического (3,77 ± 0,53%). Тогда как у работающих в ремонтных цехах индивидов частота повреждений хромосом составила в среднем, 3,02 + 0,30%). Так, у машинистов топливно-транспортного цеха уровень ХА составил 4,55 ± 0,24%, тогда как у слесарей - ремонтников - 3,70 ± 0,32% (р=0,004). Динамика данных по частоте ХА по мере увеличения продолжительности трудового стажа представлена на рисунках 23-24. При дифференциации на стажевые группы отличий частоты ХА как у шахтеров, так и у рабочих ТЭС не наблюдалось. Статистически значимой корреляции между параметрами: стаж работы во вредных условиях и частота ХА также выявлено не было. Хотя, в целом, можно было отметить тенденцию к повышению частоты метафаз с ХА по мере возрастания стажа работы во вредных условиях.