Молекулярно-генетический анализ наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости Джемилева, Лиля Усеиновна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 21

1. Медико-генетические особенности наследственных форм потери слуха 21

1.1. Медицинские и социальные аспекты врожденной тугоухости и глухоты 21

1.2. Распространенность врожденной несиндромальной и синдромальнои наследственной сенсоневральнои тугоухости и глухоты в различных популяциях мира 23

1.3. Диагностические критерии и классификация тугоухости 29

1.4. Гетерогенность наследственных форм тугоухости 31

2. Гены белков, участвующих в поддержании структуры, организации и гомеостаза клеток кортиева органа 44

2.1. Гены, участвующие в формировании пространственной организации стереоцилей волосковых клеток 45

2.2. Гены, регулирующие ионный гомеостаз К+ в улитке 52

2.3. Гены, обеспечивающие гомеостаз экстрацеллюлярного матрикса 58

2.4. Гены факторов транскрипции 59

2.5. Гены мтДНК 63

2.5.1. Ген 12SrRNA 65

2.5.2. Гены тРНК 72

3. Локус DFNB1 и общая характеристика генов коннексинов 77

4. Этико-правовые проблемы при генетическом тестировании 89

4.1. Биоэтика. История. Проблемы биоэтики 89

4.2. Моральные проблемы генетического тестирования 91

ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 96

2.1. Объекты исследования 96

2.2. Методы исследования 112

2.2.1. Молекулярно-генетические методы исследования 112

ГЛАВА III. Обсуждение результатов 135

3.1. Сегрегационный анализ и распространенность наследственной сенсоневральной тугоухости В РБ 135

3.1.1. Сегрегационный анализ 136

3.1.2. Распространенность НСНТ на территории РБ 143

3.2. Анализ спектра и частоты мутаций в генах коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6) И 31 (GJB3), пендрина (SLC26A4), престина (SLC26A5), неконвенциального миозина (my07a) у больных НСНТ из РБ 150

3.2.1. Анализ мутации c.35delG в гене GJB2 у больных НСНТ из

РБ 150

3.2.2. Поиск мутаций в гене GJB2 у больных НСНТ из РБ 155

3.2.3 Поиск мутаций в генах коннексина 30 (GJB6) и коннексина 31 (GJB3) у больных НСНТ из РБ 199

3.2.4 Поиск мутаций в гене неконвенциального миозина (MY07A)

у больных НСНТ из РБ 203

3.2.5. Спектр и частота идентифицированных мутаций в генах GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26A5 и MY07A у пациентов НСНТ из РБ 205

3.3. Анализ спектра и частоты мутаций в генах 12srrna и Trnaser(UCN) МТДНК у больных нснт из рб и других регионов РФ 210

3.3.1. Ген 12srrna 211 3.3.2. Ген trnaser(UCN) 226

3.4. Алгоритм днк-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в рб 229

3.5. Анализ гетерозріготного носительства мутаций c.35delg, c.235delc и c.l67delt в гене gjb2 в популяциях евразии 240

3.5.1. Мутация c.35delG 245

3.5.2. Мутация c.l67delT 249

3.5.3. Мутация c.235delC 250

3.6. Реконструкция гаплотипа основателя с мутацией c.35delg в гене gjb2, являющейся основной причиной НСНТВРБ 254

3.6.1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов трех высокополиморфных СА-маркеров: D13S141,D13S175HD13S143, фланкирующих ген GJB2 257

3.6.1.1. ЛокусОШШ 259

3.6.1.2. ЛокусБШШ 263

3.6.1.3. ЛокусЭШШ 268

3.6.2 Анализ распределения частот гаплотипов D13S141 D13S175-D13S143 на нормальных хромосомах и

хромосомах с мутацией c.35delG 273

3.6.3. Оценка «возраста» мутации c.35delG в гене GJB2 281

3.7. Разработка автоматизированного регистра для стандартизации, систематизации, обследования и учета больных с наследственными формами нарушения слуха 283

3.7.1. Разработка формализованной карты обследования больных с нарушениями слуха наследственной этиологии 288

3.7.2. Автоматизированный генетический регистр «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» в РБ 291

3.8. Биоэтические аспекты медико-генетического консультирования пациентов с наследственными формами нарушения слуха 299

3.8.1. Психологические и социальные аспекты рассматриваемой проблемы 300

3.8.2. Этические особенности медико-генетического консультирования семей с наследственными формами потери слуха 304

3.8.3. Анализ анкетирования семей пациентов с НСНТ по биоэтическим вопросам 309

Заключение 318

Выводы 334

Практические реккомендации 336

Список литературы 338

• Распространенность врожденной несиндромальной и синдромальнои наследственной сенсоневральнои тугоухости и глухоты в различных популяциях мира
• Этико-правовые проблемы при генетическом тестировании
• Анализ спектра и частоты мутаций в генах коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6) И 31 (GJB3), пендрина (SLC26A4), престина (SLC26A5), неконвенциального миозина (my07a) у больных НСНТ из РБ
• Автоматизированный генетический регистр «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» в РБ

Введение к работе

Актуальность темы: Изучение молекулярно-генетической природы наследственных заболеваний является основой для понимания их патогенеза, разработки методов ДНК-диагностики, профилактики и лечения. К настоящему времени идентифицировано более 17000 генов наследственных заболеваний из существующих, примерно, 25000 генов человека [OMIM]. Дефекты органов слуха занимают существенное место среди наследственной патологии. По статистическим данным ВОЗ на сегодняшний день в мире насчитывается порядка 300 млн человек, страдающих нарушением слуха различной этиологии (III-IV степени тугоухости). В Российской Федерации (РФ) эта цифра превышает 13 млн. человек, из которых более 1 млн. - это дети в возрасте до 18 лет. Общепопуляционная частота врожденной тугоухости и глухоты составляет 1 на 650-1000 новорожденных детей [Chaleshtori et. al., 2007]. По прогнозам ВОЗ к 2020 году более 30% всей популяции земного шара будут иметь нарушения слуха [Загорянская и др., 2003]. Данный прогноз указывает на отсутствие в перспективе снижения числа инвалидов по слуху в абсолютном и долевом выражении, как в РФ, так и в других странах, свидетельствуя о масштабе медицинской проблемы и ее социальной значимости [Дайхес и др., 2003]. В вопросах этиологии и патогенеза заболевания остается много неясных аспектов, но считается, что примерно половина всех случаев врожденной глухоты имеет наследственное происхождение. Как следствие, правильное консультирование семей таких пациентов практически невозможно без применения ДНК-диагностики. Большинство случаев генетически детерминированной потери слуха наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Однако выраженная клиническая и генетическая гетерогенность заболевания, а также большая ассортативность браков между глухими и слабослышащими зачастую не позволяет точно выяснить механизм наследования дефекта звуковосприятия, а также приводит к повышению случаев болезни среди потомков пробанда.

Известно более 60 ядерных и митохондриальных генов, мутации в которых являются причиной тугоухости и глухоты у человека [Van Camp et al., 2009]. Наиболее частая форма наследственной глухоты - несиндромальная сенсоневральная тугоухость/глухота (НСНТ). Среди всех идентифицированных генов, вовлеченных в функционирование системы звуковосприятия, наиболее значимыми являются гены белков-коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6) и 31 (GJB3), вклад которых в развитие несиндромальных и некоторых синдромальных форм, по данным различных авторов, достигает 80% [Petersen et. al., 2006].

Кроме генов белков-коннексинов, непосредственно участвующих в процессе звуковосприятия, рядом исследователей [Prezant et. al., 1993; Estivill et. al., 1998] показано, что некоторые мутации генов 12SrRNA и tRNASer^(UCN> митохондриальной ДНК могут являться причиной «гиперчувствительности» к ототоксическим лекарственным препаратам и вызывать потерю слуха. Поскольку применение антибиотиков из группы аминогликозидов широко распространено, изучение частот мутаций в генах 12SrRNA и tRNASer^(UCN является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях с отягощенным наследственным анамнезом, а также разработки схем дородовой диагностики повреждений генов 12SrRNA и tRNASer^(UCNN у плода. Благодаря работам многочисленных исследователей, работающих в области популяционной генетики, удалось установить, что каждая популяция имеет свою характерную генетическую структуру и генофонд. Поэтому и распространенность многих моногенных заболеваний, обусловленных мутациями в соответствующих генах, а также спектр и частота мутаций в этих генах, как правило, имеют неоднородный популяционный характер. Это определяет необходимость изучения молекулярно-генетических основ наследственных заболеваний в конкретных популяциях и регионах, что позволяет разрабатывать оптимальные для этих регионов алгоритмы их ДНК-диагностики.

Необходимость профилактики врожденных случаев потери слуха обусловлена значительными материальными затратами на выплаты по инвалидности, мероприятия по реабилитации, курсы специального обучения, слуховые аппараты и кохлеарные импланты. Однако, несмотря на острую социальную значимость проблемы, до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий, при этом, одновременно, отсутствует повсеместный мониторинг синдромальных и несиндромальных форм тугоухости и глухоты среди детского населения. Не разработаны четкие диагностические алгоритмы обследования пациентов с наследственными дефектами звуковосприятия, нет полных данных по спектру и частоте мутаций генов GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNASer^(UCN), SLC26A4, SLC26A5 и MYO7A у пациентов из различных этнических групп, проживающих на территории РФ и Республики Башкортостан (РБ). Нет полноценных данных о частоте гетерозиготного носительства мажорных мутаций гена GJB2 среди населения РФ.

В настоящее время допускается значительная гиподиагностика наследственных заболеваний, связанных с потерей слуха. Это связано с недостаточной информированностью оториноларингологов и сурдологов, отсутствием развитой программы генетического скрининга врожденной потери слуха и универсальных алгоритмов ДНК-диагностики наследственных форм потери слуха, оптимальных для различных этнических групп, проживающих на территории РФ.

Таким образом, диагностика и профилактика наследственных форм потери слуха является актуальной медицинской и социальной задачей. Большинство подходов, применяемых для решения данной задачи, базируется на результатах биомедицинских исследований генома человека. Все вышеперечисленное и предопределило актуальность данного исследования.

Цель и задачи исследования Целью исследования является изучение молекулярно-генетических основ и популяционных механизмов распространения наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты и разработка оптимальных подходов ДНК-диагностики в различных регионах РФ.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сегрегационный анализ семей пациентов с наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ.

2. Изучить распространенность и популяционно-генетические факторы распространения наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ.

3. Определить характерные для РБ спектры и частоты мутаций в генах GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNA^Ser(UCN), SLC26A4, SLC26A5и MYO7A.

4. Провести сравнительный анализ частот гетерозиготного носительства трех мажорных мутаций с.35ёеЮ, с.167ёе1Т и с.235ёе1С в гене GJB2 в 17 евразийских популяциях.

5. Выявить популяционно-генетические механизмы накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты на основании гаплотипического анализа в локусе DFNB1 (13q 21.1) и оценить время, за которое произошла экспансия хромосом, несущих мутацию с.35ёеЮ в гене GJB2 в популяциях Волго-Уральского региона.

6. Разработать оптимальный для РБ алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты.

7. Создать национальный автоматизированный генетический регистр наследственных форм потери слуха в РБ.

8. Провести исследование биоэтических проблем, связанных с применением ДНК-тестирования наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты у пациентов с наследственной формой потери слуха из РБ.

9. Разработать биоэтические правила взаимодействия с тугоухими и глухими пациентами с учетом их психологических и социальных особенностей.

Научная новизна. Впервые получены данные по распространенности наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ, которая составляет 5,7 на 100000 (1:17543) населения, что сопоставимо с современными показателями в мире. Установлено неравномерное территориальное распространение заболевания с очагами накопления в центральных и юго-восточных районах республики.

Впервые изучена частота гетерозиготного носительства трех мажорных мутаций с.35de1G, a167delT и a235delC в гене GJB2 в 17 популяциях Евразии и показана гетерогенность по частоте гетерозиготного носительства мутаций с.35de1G и a235delC между славянскими, финно-угорскими, тюркскими, адыго- абхазскими, дагестанскими и нахскими этносами.

Впервые проведенный анализ мутаций генов GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNA^ber(UCN, SLC26A4 и SLC26A5 у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ позволил идентифицировать 57% всех мутантных хромосом и установить, спектр мутаций, приводящих к нарушению процесса звуковосприятия у пациентов из РБ.

Впервые установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей и генотипов микросателлитных маркеров D13S141, D13S175 и D13S143 гена GJB2 на нормальных хромосомах и хромосомах с мутацией с.35ёеЮ у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухостью/глухотой из РБ. Впервые выявлен мажорный гаплотип по локусам D13S141-D13S175-D13S143 125-105-130, достоверно чаще встречающийся на хромосомах с мутацией с.35ёеЮ в гене GJB2. Доля полностью информативных семей при анализе генов GJB2, GJB6, GJB3, 12SrRNA, tRNA^Ser(UCN), SLC26A4 и SLC26A5 по всем изученным мутациям составила 59%, что позволило разработать подходы ДНК-диагностики несиндромальной наследственной глухоты в РБ.

Впервые рассмотрен механизм накопления наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты, вызванной мутацией с.35delG в гене GJB2 в РБ на основании проведенного гаплотипического анализа и оценен возраст мутации a35delG в гене GJB2 в популяциях Волго- Уральского региона.

Впервые проведен анализ биоэтических вопросов при использовании ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в РБ с учетом социальных и психологических особенностей тугоухих и глухих индивидов. Выявлены неразработанные в практике лечебно-профилактической помощи этические вопросы: недирективность медико-генетического консультирования,

информированное согласие пациентов на проведение ДНК-диагностики, ДНК-тестирование детей, конфиденциальность генетической информации.

Разработаны новые подходы, качественно отличающиеся от традиционных, в области профилактики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты для совершенствования медико- генетической помощи пациентам с наследственной формой нарушения слуха в РБ. Решена важная для практического здравоохранения проблема: полученные в данной работе результаты используются для планирования исследований в области медицинской генетики, особенно для скрининга наследственных дефектов звуковосприятия у населения как РБ, так и населения РФ.

Практическая значимость работы. В рамках работ по государственному контракту № 02.442.11.7508 (Федеральная целевая научно- техническая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы») созданы уникальные патентно-чистые тест-системы экспресс-ДНК-диагностики

НСНТ на основе определения 19 наиболее частых мутаций в генах GJB2 и 12SrRNA (мтДНК).

На основании комплексного клинико-генетического и молекулярного обследования пациентов с НСНТ в практическое здравоохранение внедрены разработанный в ходе настоящего исследования, алгоритм ДНК-диагностики для профилактики рождения детей с наследственной формой потери слуха и научно обоснованная схема организации медицинской помощи семьям с высоким риском рождения детей с указанным заболеванием. Создан национальный автоматизированный генетический регистр наследственных форм потери слуха на базе Сурдологического центра ГУЗ Республиканской детской клинической больницы и Центра патологии речи, нейрореабилитации и реабилитации слуха ГУЗ Республиканской детской клинической больницы (г. Уфа).

Материалы диссертации используются в работе медико-генетической консультации при ГУЗ: «Республиканский перинатальный центр» РБ, а также включены в учебный процесс для студентов, в программу обучения ординаторов, интернов, врачей на кафедрах детских болезней, педиатрии, курса пропедевтики детских болезней лечебного и педиатрического факультетов ГОУ высшего профессионального образования «Башкирский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Данные исследования имеют большое практическое значение и для здравоохранения как РБ, так и РФ, поскольку они позволят планировать объем медицинской помощи населению, а также существенно снизить распространенность наследственных форм потери слуха.

Положения, выносимые на защиту.

9. 1. Преобладание среди наследственных форм НСНТ у пациентов из РБ аутосомно-рецессивной формы заболевания (89%).

   2. Неравномерное территориальное распространение НСНТ в РБ с очагами накопления в центральных и юго-восточных районах республики. Распространенность наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты в Республике Башкортостан составляет 5,7 на 100000 (1:17543) населения, что сопоставимо с таковой в европейских популяциях.

   3. Спектр мутаций генов GJB2 (с.35ёеЮ (34%), c.35dupG (0,5%), c.167delT (2%), c.235delC (0,74%), q.-3179G>A (1,23%), c.358_360delGAG (0,5%), c.302A>G (0,25%), c.290_291insA (0,25%), c.299_300delAT (1%), c.333_334delAA (0,5%), c.312_325del14 (0,5%), c.314_327del14 (3%), c.101T>C (1%), c.109G>A (0,5%), c.139G>T (0,25%), c.380G>A (0,25%), c.224G>A (0,5%), c.95G>A (0,25%), c.551G>C (0,5%), c.250G>C (0,25%), c.79G>A+c.341A>G (0,25%)), 12SrRNA (m.961msC_(n) (0,25%) и m.961delTinsC_(n) (0,74%)), tRNA^Ser(UCN) (m.7444G>A (0, 25%)), SLC26A5 (q.-53- 2A>G) (0,25%) и SLC26A4 (q.919-2A>G) (0,25%) у больных несиндромальной наследственной глухотой и у членов их семей из Башкортостана.

   4. Неоднородность 17 евразийских популяций по частоте гетерозиготного носительства мутаций с.35delG, a^delT и a235delC гена GJB2.

   5. Эффект основателя - основной популяционный механизм накопления несиндромальной наследственной глухоты в популяциях Волго-Уральского региона. Время экспансии гаплотипа основателя с мутацией с. 35delG в популяциях Волго-Уральского региона составляет ~ 10000 лет.

   6. Республиканский генетический регистр наследственных форм потери слуха в Республике Башкортостан, созданный в ходе исследования, позволяет решать задачи накопления эпидемиологической информации о нозологической структуре несиндромальной наследственной потери слуха, диспансеризации семей высокого риска, пре- и постнатальной диагностики и профилактики наследственных форм тугоухости/глухоты у детей, а также проводить генетический мониторинг населения.

   7. Разработанный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной тугоухости/глухоты, позволяет

   8. Недостаточная информированность тугоухих и глухих индивидов о современных методах дородовой ДНК-диагностики по данным проведенного социологического опроса.

   9. Биоэтические правила взаимодействия с тугоухими и глухими пациентами, позволяющие повысить уровень медико-генетического консультирования пациентов с наследственными формами потери слуха.

   Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликована 60 работ, из которых 19 статей в журналах, рекомендованных для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук, 2 статьи в зарубежной печати, 2 главы в иностранных монографиях, 38 публикаций - в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций, 2 патента РФ на изобретения. Результаты исследования были представлены на международных и российских конференциях: «Биоразнообразие и динамика экосистем северной Евразии» (Новосибирск, 2001), IV Международном симпозиуме «Современные проблемы физиологии и патологии слуха» (Суздаль, 2001), Юбилейной научной конференции «Молодые ученые Волго- Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), Inherited disorders and their genes in different European populations, exploring human genetic variability - a Euroconference (San Feliu de Guixols, Spain, 2001), Human Genome Meeting (Shanghai, China, 2002), European Human Genetics Conference (Strasbourg, France, 2002), V Съезде Российского общества медицинских генетиков (2005), Eropean Society of Human Genetics conference (Prague, the Czech Republic 2005), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино. 2006), 7th Balkan Meeting of Human Genetics (Skopje, Macedonia, 2006), European Society of Human Genetics, Amsterdam (Amsterdam, The Netherlands, 2006), European Association for Vision and Eye Research Congress (Portugal, 2006), Школе молодых ученых им. Вавилова «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2006), International Society of Ocular Cell Biology (Cambridge, United Kingdom, 2006), XIIth International Symposium on Retinal Degeneration, (San Carlos de Bariloche, Argentina 2006),

   Научно-практической конференции «Человек и его здоровье» (Санкт- Петербург, 2006), International Congress of Human Genetics (Brisbane, Australia 2006), Asia ARVO (Singapore, 2007), European Society of Human Genetics conference (Nice, France 2007), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), II Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 50- летию высшего медицинского образования Республики Саха (Якутия) «Экология и здоровье человека на Севере» (Якутск, 2007), Newborn Hearing Screening (Cernobbio, Italy, 2008), ESF Research Conference on Rare Diseases (Sant Feliu de Guixols, Spain, 2008), European Society of Human Genetics conference (Wien, Austria 2009), European Society of Human Genetics conference (Gothenburg, Sweden 2010), IV Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Human Genome Meeting (Dubai, UAE, 2011).

   Структура и объем работы. Диссертация изложена на 435 страницах машинописного текста. Данные проиллюстрированы таблицами (28), рисунками (78) и приложениями (2). Библиографический указатель включает 657 источников литературы, из них 80 работ отечественных авторов.

   Распространенность врожденной несиндромальной и синдромальнои наследственной сенсоневральнои тугоухости и глухоты в различных популяциях мира

   Число больных с нарушениями слуха в Российской Федерации превышает 13 млн. человек, более 1 млн. - это дети. Из 1000 новорожденных 1 ребенок рождается с тотальной глухотой. Кроме того, в течение первых 2-3 лет жизни теряют слух еще 2-3 ребенка. У 14% индивидов в возрасте от 45 до 64 лет и у 30% лиц старше 65 лет имеются нарушения слуха. По данным ВОЗ к 2020 году более 30% всей популяции земного шара будут иметь нарушения слуха [Таварткиладзе и др., 2006].

   При целенаправленном скрининге детского населения, на основе полного аудиологического обследования, в ряде стран (Англия, Германия, Италия, Испания, Швеция, Финляндия, США) был выявлен, в среднем, 1 случай глухоты на 650 новорожденных [Snoeckx et al., 2005]. По данным различных авторов отмечается, что в США, по меньшей мере, 1 ребенок на 1000 живых новорожденных детей рождается с двухсторонней сенсоневральной тугоухостью средней и тяжелой степени, включая 4 полностью глухих ребенка на 10000 населения, что, например, в три раза чаще синдрома Дауна, в шесть раз чаще spina bifida и в 50 раз чаще фенилкетонурии [Cryns et. al., 2004; Smith et al., 2005; Petersen et. al., 2006].

   Анализ возрастной характеристики детей на момент постановки диагноза в сурдологопедических кабинетах регионов России показал, что диагностика тугоухости и глухоты проводится несвоевременно: дети до года составляют лишь 5% от общего числа обследованных; от 1 года до 3 лет - 14%; около трети детей (28%о) берется на диспансерный учет в возрасте от 3 до 7 лет; у 30% детей нарушение слуха выявляется в возрасте от 7 до 14 лет; от 14 до 18 лет - у 23% [Таварткиладзе и др. 2006].

   Получить полное представление о частоте нарушений слуха среди детей, в целом, достаточно трудная задача, поскольку должны быть учтены многочисленные критерии: характер патологии, возраст манифестации, степень тугоухости, возраст ребенка, семейный анамнез, характер протекания и различные осложнения во время беременности и родов у матери, перенесенные заболевания, место учебы и др. Дети с тяжелыми формами потери слуха изначально выделены в особую группу и доступны для учета распространенности нарушений слуха из-за возможности обучения в специализированных коррекционных учреждениях, тогда как дети с легкими и средними формами СНТ часто не попадают под наблюдение сурдологов, поскольку могут учиться в общеобразовательных школах и не предъявлять жалобы на снижение слуха во время медицинских осмотров. Для выявления таких форм детской тугоухости, развивающейся, в основном, на первом году жизни, необходимы особые диагностические и скрининговые программы, включающие в себя генетическое тестирование.

   На практике зачастую достаточно сложно дифференцировать врожденную тугоухость от нарушений слуха, возникающих после родов в первый год жизни ребенка, особенно если степень нарушения звуковосприятия незначительна и прогрессирование процесса медленное [Cryns et. al., 2004; Таварткиладзе и др. 2006].

   До настоящего времени в России нет единого систематизированного подхода к учету лиц, страдающих несиндромальными формами тугоухости и глухоты. Это объясняется тем, что учет, как правило, производится по обращаемости пациентов в специализированные кабинеты. Профилактические осмотры для выявления лиц с нарушениями слуха не проводятся, что исключает возможность обнаружения лиц с небольшими потерями слуха, а, следовательно, и проведения им своевременных реабилитационных мероприятий, предотвращающих в ряде случаев прогрессирование процесса и, в итоге, их инвалидизацию.

   Данные по распространенности доречевой несиндромальной сенсоневральной тугоухости в мировой литературе достаточно скудны. Так, по данным Gallaudet Encyclopedia of Deaf People and Deafness 1986 г и Encyclopedia of Deafness and Hearing Disorders 2004 г распространенность врожденной глухоты составляет 50 на 100000 в США, 47 на 100000 во Франции, 46 на 100000 в Великобритании. В Европе частота врожденной аутосомно-рецессивной глухоты составляет в среднем 1:5000 новорожденных, аутосомно- доминантной 1:10000, Х-сцепленной 1:100000 мальчиков [del Castillo et al., 2002; Griffith et al, 2001; Petersen et al., 2006; Alvarez et al., 2010]. По данным1 регистра Британской Колумбии1 (Канада) частота доминантной формы потери слуха составляет. - 0,19, а рецессивной - 0,25 на 10000 новорожденных [Denoyelle et al., 1997; Piatto et al., 2005; Petersen at al., 2006; Alvarez et al, 2010; Vivero et al., 2010].

   В ряде европейских и азиатских стран, а также в Соединенных Штатах Америки проводятся диагностические скрининговые программы, позволяющие оценить частоту врожденной тугоухости у новорожденных [Finitzo et al., 1998; Ayache et al., 2001; Anderssen et al., 2002; Smith et al., 2002, 2003; Lim et al., 2003; del Castillo 2003; Fernandez-Burriel et al, 2003; Fitzgerald et al., 2004; Roux et al., 2004; Tekin et al., 2007; Niceta et al., 2007; Samanich et al, 2007; Yanakakis et al, 2009; Tsukada et al., 2010].

   В период с 1983 по 1989 г. было проведено исследование по распространенности, этиологии и клиническим особенностям сенсоневральных нарушений слуха у детей Республики Узбекистан [Агзамходжаев, 1989]. Было показано, что частота НСНТ у детей на территории Республики Узбекистан составляет 9,7 на 10000. Наследственная природа заболевания установлена в 44% случаев. Изолированные нарушения слуха выявлены у 94,8% детей, синдромальные - в 5,2% случаев.

   Исследования по эпидемиологии наследственных форм тугоухости проведены ряде областей РФ в рамках комплексного медико- и популяционно-генетического обследования региона, предусматривающего выявление широкого спектра наследственных заболеваний (включая различные формы тугоухости) наряду с изучением особенностей генетической структуры, что дало возможность объяснить механизм, лежащий в основе распространения наследственной тугоухости по районам области. В данных исследованиях было показано, что территориальные различия в частотах тугоухости по различным регионам обусловлены особенностями генетической структуры исследованных популяций, в частности, уровнем генетической подразделенности и действием дрейфа генов [Шокарев и др., 2002; Панахиан 2004, 2005; Маркова и др., 2005; Зинченко и др. 2007; Шокарев и др., 2005].

   В таблице 2 представлена распространенность несиндромальной сенсоневральной тугоухости с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным "типом наследования в российских популяциях [Пузырев и др., 1999; 2000; Шокарев и др., 2002; Маркова и др., 2005; Зинченко и др. 2007, 2009; Шокарев и др., 2005]. Данные получены в процессе проведения комплексных генетико-эпидемиологических исследований по изучению распространенности широкого круга моногенной наследственной патологии (более 2500 нозологических форм), проводимые лабораторией генетической эпидемиологии Медико-генетическим центром РАМН (МГНЦ) и Томским институтом медицинской генетики.

   Этико-правовые проблемы при генетическом тестировании

   Республика Башкортостан (площадь 143600 км2) расположена на рубеже Европы и Азии в переходной полосе от Восточно-Европейской равнины к Уральским горам и от них - к Западно-Сибирской равнине. По данным Всероссийской переписи населения 2002 года, численность постоянного населения РБ составила 4104336 человек. Административно-территориальное деление республики включает в себя 54 района и 21 город, в их числе и столица РБ, город Уфа, с населением 1049479 человек. Башкортостан - многонациональная республика, где основные национальности представлены русскими (1490715 человек, 36.32%), башкирами (1221302 человек, 29.76%), татарами (990702 человек, 24.14%), чувашами, марийцами, украинцами, мордвой, удмуртами и другими этносами [Всероссийская перепись населения 2002 года]. Специализированную сурдологическую помощь населению РБ оказывает Республиканский сурдологический центр Республиканской детской клинической больницы.

   Для оценки распространенности НСНТ на территории РБ, без дифференциации на типы, использовались: материалы комплексного сплошного медико- и популяционно-генетического исследования населения семи районов РБ, проведенного в период с 2005 по 2008 гг. совместно с Медико-генетическим научным центром РАМН (г. Москва); сведения о всех известных больных с врожденной потерей слуха, проживающими на территории РБ, полученные из базы данных Республиканского сурдологического центра, где состоит на учете большинство семей с наследственной потерей слуха; документы МСЭК по освидетельствованию глухих и слабослышащих за 2000 -2009 г.г.; протоколы осмотров в школах глухих и слабослышащих РБ (Государственное образовательное учреждение Стерлитамакская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат I вида, Государственное образовательное учреждение Уфимская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат I вида, Государственное образовательное учреждение Уфимская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа № 138 I-II видов, Государственное образовательное учреждение Бакалинская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат II вида, Государственное образовательное учреждение Уфимская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат № 30 II вида, Государственное образовательное учреждение специальный (коррекционный) для сирот и детей, оставшихся без попечения» родителей, дошкольный детский дом № 6 для детей с отклонениями в развитии (глухих), Государственное образовательное учреждение Бакалинская специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат 2 вида (для слабослышащих), Негосударственное общеобразовательное учреждение Специальная (коррекционная общеобразовательная) школа 1 и 2 вида (для глухих и слабослышащих), Специальная коррекционная школа-интернат № 18 2 вида (для слабослышащих) г. Октябрьский, Муниципальное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа № 21» г.Салават, Средняя общеобразовательная школа № 3 г.Нефтекамска, Муниципальное общеобразовательное учреждение средняя школа № 10 г. Белорецк)

   Обследование пациентов осуществлялось на базе МГК РПЦ, Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова, Республиканского сурдологического центра Республиканской детской клинической больницы, а также в ходе экспедиционных выездов в районы РБ. Полученные таким образом сведения дополнительно уточнялись на момент исследования как путем целенаправленного запроса в центральные городские и районные больницы, специализированные школы и коррекционные детские сады, так и в процессе экспедиционных выездов 2000 - 2009гг., проводимых нами совместно с сотрудниками Республиканского сурдологического центра с целью дополнительного клинического осмотра больных и членов их семей, и забора крови для ДНК-анализа. Для клинико-эпидемиологического исследования были собраны данные о каждом пациенте, проживавшем или проживающем на территории РБ за исследуемый период времени с 1 января 2000 по 1 января 2010 года.

   В процессе проведенной организационной и консультативной работы было выявлено следующее - у 40 пациентов нам не удалось подтвердить диагноз НСНТ, установленный ранее оториноларингологами. В анализ распространенности также не были включены 15 пациентов со смешанной формой тугоухости и 6 пациентов с кохлеарными невритами, в настоящее время находящиеся под наблюдением. Выбыли из РБ 4 больных.

   Определены показатели распространенности НСНТ суммарно для всей популяции РБ и в отдельности для районов Республики, исходя из численности населения по данным МЗ РБ за 2008 год [МЗ РБ, Осн. показатели мед. обслуживания за 2008г.].

   Расчет отягощенности/распространенности, производился как отношение реального числа больных с определенным типом наследования к "численности обследованной популяции. Анализировалась распространенность наследственной тугоухости в следующих группах: 1. для всего населения РБ; 2. для населения районов РБ. Распространенность наследственных форм нарушений слуха далее приводится в расчете на 100000 обследованного населения. Данные о каждом пациенте, собранные из всех возможных источников, заносились в специально разработанную нами формализованную карту (ФК), на основании которой создана автоматизированная база данных. ФК заполнялась индивидуально на каждого пациента, впоследствии данные заносились в генетический регистр «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота».

   Выяснение семейного анамнеза с последующим уточнением клинических признаков и составлением генеалогического дерева проводилось во всех семьях. Для каждого из обследованных больных составлялась родословная по общепринятым правилам с использованием стандартной символики.

   Критерием включения в исследование был диагноз «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» (G11 по МКБ-10), установленный на основании клинических, лабораторно-инструментальных и молекулярно-генетических методов исследований в соответствии с современными диагностическими критериями, предлагаемыми Институтом глухоты и коммуникативных расстройств (г. Омаха, США) и рекомендованных в 2003 г. Европейской рабочей группой по наследственным нарушениям слуха GENDEAF [Stephens et al., 2001; Mazzoli et al., 2003].

   Анализ спектра и частоты мутаций в генах коннексинов 26 (GJB2), 30 (GJB6) И 31 (GJB3), пендрина (SLC26A4), престина (SLC26A5), неконвенциального миозина (my07a) у больных НСНТ из РБ

   Таким образом, наиболее частой мутацией, идентифицированной с частотой 42,8% на хромосомах носителей русской этнической принадлежности, была делеция c.35delG в гене GJB2. С частотой более 1 % встречались мутации c.314_327dell4 (2,5%), c.l67delT (1,5%), g.-3179G A (1,02%) и c.224G A (1,02%). Частота остальных мутаций не превышала 0,5%.

   На хромосомах пациентов НСНТ, татар по этнической принадлежности, были идентифицированы следующие мутации: c.35delG (27,8%), c.314_327dell4 (6,67%), c,167delT (3,33%), g.-3179G A (3,33%), c.235delC (2,22%), c.358_360delGAG (2,22%),- c.333_334delAA (2,22%), c.310_325dell4(2,22%), c.35dupG (1,11%), и два полиморфных варианта c.79G A (6,67%) и c.457G A (1,1%) в гене GJB2 и мутация g.919-2A G (1,1%) в гене SLC26A4. Среди больных, башкир по этнической принадлежности, были найдены мутации c.35delG (13,3%), c.235delC (1,67%) и p.Val27Ile (c.79G A)+p.Glull4Gly (c.341G A) (1,67%) и с.101Т С (3,33%). Наиболее частым полиморфным вариантом, встречающимся у башкир, оказался p.Val27Ile (c.79G A), частота которого на хромосомах больных с потерей слуха составила 15%. Небольшой вклад мутаций гена GJB2 в развитие несиндромальной глухоты у башкир (35%), возможно, связан с наличием мутаций в других генах, участвующих в процессе звуковосприятия. Следует отметить, что низкий вклад мутаций гена коннексина 26 (GJB2) (менее 30%) был отмечен при изучении больных несиндромальной глухотой алтайцев [Posukh et. al, 2005], японцев [Abe et al., 2007], китайцев [Yuan et al., 2009b], тайцев [Wattanasirichaigoon et al., 2004], монголов [Dai et al., 2008], корейцев [Han et al., 2008; Choi et al., 2009] и др. Однако спектр мутаций у пациентов башкир отличен от спектра, характерного для индивидов с нарушенным слухом из азиатских популяций. Так, например, почти во всех популяциях Азии преобладающей является c.235delC, тогда как у башкир с врожденной потерей слуха наследственной этиологии наиболее частой является c.35delG, не обнаруженная на хромосомах пациентов НСНТ, алтайцев, японцев, китайцев, корейцев и монголов по этнической принадлежности, что возможно, связано с эффектом основателя.

   На хромосомах пациентов НСНТ, метисов, были идентифицированы следующие мутации: c.35delG (34%), c.l67delT (4,55%), c.551G C (4,55%), c.299_300delAT (2,27%), c.314_327dell4 (2,27%), C.109G A (2,27%), c.95G A (2,27%), с.101Т С (2,27%) и полиморфный вариант c.79G A (4,55%). Мутации c.35delG (39%), c.299_300delAT (5,56%) и полиморфный вариант c.79G A (11,1%) были выявлены в группе пациентов НСНТ, украинцев, армян, и мари. Таким образом, все мутации и полиморфные варианты, обнаруженные в генах GJB2, GJB3, GJB6, SLC26A4, SLC26A5 и MY07A у пациентов из РБ, характерны, в основном, как для больных НСНТ из европейских, так и из азиатских популяций [Kelley et al., 1998; Park et al., 2000; Abe et al., 2000; Rabionet et al., 2000; Lerer et al., 2000; Hamelmann et al., 2001; Loffler et al., 2001; Liu et al, 2002; Ohtsuka et al, 2003; Yan et al., 2003; Minarik et al, 2003; Uyguner et al., 2003; Yan et al., 2003; Posukh et al., 2005; Ruszymah et al., 2005; Propst et al., 2006; Chaleshtori et al., 2007; Bajaj et al., 2008; Dai et al., 2008; Ammar-Khodja et al., 2009; Batissoco et al., 2009; Bhala et al., 2009; Bonyadi et al., 2009; Cama et al., 2009; Dietz et al, 2009; Fischer et al., 2009; Bevilacqua et al., 2010; Chora et al, 2010].

   Наиболее распространенной мутацией, идентифицированной на 34% хромосом пациентов с НСНТ из РБ оказалась мутация c.35delG, что соответствует литературным данным о высокой частоте встречаемости данной делеции среди населения Европы и Ближнего Востока [Gasparini et al., 1997; Zelante et al., 1997; Morell et al., 1998; Antoniadi et al., 1999; Gasparini et al., 2000; Tekin et al., 2001; Lucotte and Pinna, 2003; Mercier et al., 2005; Lucotte et al., 2007; Mahdieh et al., 2009]. Доля хромосом с мутациями c.314_327dell4 и c.299_300delAT составила 3,94%. Мутация c.314_327dell4 является второй по распространенности мутацией в гене GJB2 среди больных РБ (в основном, среди больных татарской этнической принадлежности). Также с частотой более 1% у пациентов с НСНТ из РБ были выявлены мутации c.l67delT и c.235delC. Мутации в генах MY07A, GJB3 и GJB6 у пациентов НСНТ из РБ являются достаточно редким событием.

   Достаточно высокая частота мутации c.35delG у пациентов с нарушением слуха, русских и татар по этнической принадлежности, из РБ предполагает возможность проведения прямой ДНК-диагностики, а также проведения скрининга среди широких групп населения. Учитывая полиэтнический состав населения республики, можно отметить, что проведение скрининговых программ, направленных на раннее выявление делеций c.35delG и c.314_327dell4 в гене GJB2, является обоснованным и необходимым условием при проведении дифференциальной и пренатальной ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты в РБ.

   Автоматизированный генетический регистр «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» в РБ

   Основу регистра составляет формализованная карта. Данные, содержащиеся в карте, строго структурированы и вносятся врачом-сурдологом и врачом-генетиком по результатам клинического, генеалогического и молекулярно-генетического обследования, со слов пациента, а также посредством выкопировки из медицинской документации путем заполнения существующих полей или выборе одного из предложенных вариантов ответа. Часть полей содержит неизменяемую информацию о пациенте, другая же часть изменяется при каждой встрече и новом обследовании пациента. Количество изменяемых записей не ограничено и существует возможность просмотра данных всех предыдущих встреч с пациентом, что позволяет наблюдать динамику течения заболевания и оценивать терапевтические возможности используемых методов лечения.

   Главная форма «Регистр» содержит список пациентов, обращение к которому открывает форму «Паспортные данные», с указанием места жительства, даты и краткого заключения последнего обследования для выбранного пациента (рисунок 69). Кроме того, из главной формы осуществляется ввод нового пациента и доступ к печатной форме заключения для каждого пациента.

   Форма «Паспортные данные» содержит фамилию, имя, отчество пациента, год рождения, пол, национальность, место рождения и проживания. Далее, в закладках этой формы находятся следующие разделы данных: «Диагноз», «Анамнез заболевания», «Клинические данные», «Молекулярно-генетический анализ», «Семья (данные о родственниках)» и «Заключение». В свою очередь каждый раздел также содержит определенный набор полей хранения информации (рисунок 70).

   В завершении обследования в соответствии с международной классификацией наследственных заболеваний заполняется полный диагноз, а также даются рекомендации для пациента.

   Автоматизированный регистр «Наследственная сенсоневральная тугоухость/глухота» - компьютерная база данных - разработан на платформе реляционной системы управления базами данных (СУБД) MYSQL версии 4.2 и выше. Минимальные требования к пропускной способности сети составляют 10 Mbit. Путь к файлу данных на сервере должен быть представлен в виде: //server/dir/dir2/data_fio.mdb, где «server» - имя сервера, «dir, dir2» - имена подкаталогов.

   Переход к использованию автоматизированного регистра не ведет к реорганизации работы лечебно профилактического учреждения и требует лишь наличия ГОМ-совместимого- компьютера не ниже РП-300 (объем оперативной памяти не менее 128 Mb, свободное место на жестком диске не менее 100 Mb) и соответствующего программного обеспечения (операционная система не ниже MS Windows 98). Стартовый объем памяти, занимаемый при установке программы, составляет 30 Mb, используемая емкость жесткого диска при месяце среднестатистической работы составляет от 10 до 100 Mb. При работе с программой рекомендуется одноразовое ежемесячное обслуживание специалистом автоматизации (установка на новые рабочие станции, резервное копирование, очистка неактуальных служебных данных и т.д.).

   Программа создана в соответствии с основными принципами создания и поддержки подобных систем [Кутуев И.А., Магжанов Р.В., 2001], проста в использовании, имеет удобный и интуитивно понятный интерфейс, что позволяет работать с ней даже начинающему пользователю. Внесение изменений в отчетные формы не ведет к нарушению работоспособности программы в целом, а изменения в остальных частях программного комплекса (формы, таблицы, запросы, программные модули, макросы, общие настройки программы) защищены паролями разграничения уровня доступа для работы медицинского персонала и специалиста автоматизации.

   База данных состоит из 283 полей, 19 таблиц, 38 запросов, 25 форм, 7 отчетов. Таблицы содержат все данные о пациентах, а также служебную информацию для функционирования программы. С помощью запросов просматриваются, анализируются и изменяются данные из различных таблиц, кроме того, они используются в качестве источника данных для форм и отчетов. Формы служат для просмотра и редактирования данных, а также для открытия других форм и отчетов. С помощью отчетов выводятся данные на экран и печать. Сведения для отчетов берутся из базовой таблицы, запроса или инструкции SQL (Structured Query Language). Программные модули содержат процедуры и функции, написанные в среде MS Visual Studio 7.1 на языке C++. Экспорт данных осуществляется в наиболее распространенные форматы хранения данных, кроме того, возможен экспорт и импорт данных, совместимый со всеми форматами современных СУБД.

   Все отчетные формы соответствуют требованиям, предъявляемым к оформлению медицинской документации, и могут быть использованы для работы лечебно-профилактических учреждений. Существует возможность формировать новые запросы в зависимости от возникающей необходимости пользователя.

   Программа предназначена для работы врача-сурдолога и врача-генетика в условиях поликлинической службы, стационаров, медицинской кафедры учебно-образовательного учреждения и для научных исследований. Использование регистра упрощает работу врача-сурдолога по выборке, сортировке и анализу данных, как для каждого пациента в отдельности, так и для определенной группы больных. Создание подобных регистров в ряде регионов Республики и объединение их в сеть сделают возможным: наблюдение за больными с наследственными повреждениями слуха, а также за их родственниками, являющимися потенциальными носителями патологических изменений в генах, с оценкой эффективности организации диспансерного наблюдения (на территориальном уровне обслуживания больных и консультирующихся по прогнозу потомства); оценку основных параметров, характеризующих состояние медико-генетической помощи; представление данных о распространенности наследственных повреждений слуха в регионе и эффективности работы территориальной медико-генетической службы для внутреннего анализа и выработки собственных управленческих решений; получение достоверных данных для принятия решений по совершенствованию специализированной медико-генетической помощи больным с тугоухостью/глухотой и их семьям; обмен информацией между регионами позволит получать данные для масштабных клинико-эпидемиологических исследований.