Введение к работе
В данной работе продолжено исследование гипервариабельных районов ДНК человека, представленных танденно повторяющимися последовательностями, проводимое в течение последних нескольких лет в лаборатории нолекулярной генетики мозга НТШЭ FAHH. Диссертационный материал является целостным исследованием одного из семейств таких повторов, сходных по нуклеотидной последовательности с вариабельными элементами env-гена вируса hiv-i. в работу вошли: разработка экспериментальных путей поиска гипервариабельных участков ДЩ, геветический анализ, определение иуклеотидяой последовательности и хромосомной локализации таких участков. Практическим результатом явилось создание коллекции высокоэффективных полиморфных наркеров ДНК, пригодных для применения в анализе генетического спепления, популяпионных исследованиях, криминалистике и некоторых других областях.
Актуальность проблемы. Установление Феномена повышенной нестабильности определенных семейств геномных элементов, хромосомных локусов и доменов, является одним из центральных ВОПРОСОВ при исследовании нолекулярно-генетической природы наследственных заболеваний. Например, повышенный спонтанный мутагенез может являться объяснением причин также повышенной частоты встречаемости дефектных генов некоторых болезней, поддерживающейся в различных популяциях. С другой стороны, выделение нестабильных, гипервариабельных локусов, позволяет использовать их в качестве высокоинформативных генетических наркеров для анализа спепления с дефектными генами при наследственных заболеваниях. Поскольку высокая доля средовых Факторов, генетическая гетерогенность и воэножный полигенный характер болезни требуют проведения полного обсчета при анализе спепления на возможно более ограниченном числе сеней из
- г -генетических иэолятов, информативность маркерной системы (Polymorphic information Content) существенно зависит от велечины гетеро-зиготности (Н) локуса, выявляемого маркерон (Botstem et ai,
Наибольшее число маркеров сейчас основано на обнаружении замен или делепий/инсердий одного нуклеотида, что может выражаться в наличии или отсутствии сайта рестрикдии, определенном типе конФор-.нации анализируемого Фрагмента или показано прямым определением нуклеотидной последовательности интересующего участка ДНК при помоши полинеризапионной цепной реакпии ifcri. Поскольку в подав-ляюшем большинстве случаев удается обнаружить лишь два альтернативных варианта аллеля, гетероэиготиость в данном случае не ножет превышать 50/. крупные инсерпии и делепии, как правило, характеризуются также диаллельным состоянием локуса. Информативность таких наркерных систем невелика, что делает их непригодными для анализа большей части родословных.
Вариабельные тандемные повторы ("vtri - наиболее перспективный тип полиаллельного полиморфизма для генетического картирования. Главной основой такого типа полиморфизма является вариабильное число тэндемных повторов (vntr). VTR-аллели ногут отличаться также вышеперечисленными видами полиморфизма, создавая широчайший спектр межиндивидуальной полиаллельнои вариабильности twyman & White, igao |.
Первые полиаллельные локусспециФические vmtr лскусы были обнаружены в начале во-х годов в анонимной последовательности на (4-й хромосоме, а затем вблизи ряда кодирующих генов twyman я White, I9«0, Bell et al., 1981, Higgs et al. , 1981). С тех ПОР накоплена серия локусспепиФичных vntb маркеров. Выявлены vntk-локусы, гетероэиготиость которых достигает 9в-99х, а число аллелей более 60 (Jeffreys et al., І9И5, NaKamura et а]., 19В7]. Такие
чрезвычайно информативные маркеры гарантируют идентификацию отцовского и натерипского аллелей в сегрегационном анализе практически в любой анализируемой семье. Обнаружение таких проб ДНК явилось новым импульсон для развития генетики, позволило проводить систематическое изучение генетики человека, комплексные медико-генетические идентификации, изучение механизмов изменчивости геномных локусов в эволюции живых организмов, выяснение особенностей молекулярной структуры "горячих" точек рекомбинации.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка способов выявления сверхизненчивня участков генома человека, клонирование таких участков, оценка их популяпионной гетерогенности, изучение молекулярной и хромосомной организации и описание неизвестных ранее семемейств элементов генома, вызывающих повышенную изменчивость генетических локусов. На основе полученных результатов бнла создана коллекиия наркеров ДНК, характеризующихся локусспепиФической и мультилокусной локализацией в геноме, пригодных для использования в качестве проб в медико-генетических и популяиионных исследованиях. Для достижения поставленной пели решали следующие задачи:
1- Синтез олигонуклеотидных зондов и их клонирование для получения эффективных гибрилиээнионных проб, выделение клонированных вставок гипервариабельных участков ДНК.
-
Гибридизация зондов ДНК с несколькими библиотеками для анализа распространенности тандемно повторяющихся элементов в геноме человека и отбор клонов, несуших такие повторы.
-
Создание мини-библиотек из клонов кандидатов и отбор непосредственно участков, содержащих кластеры танлсмиых повторов-
Опенка сіепени полиморфизма клонированных участков и отбор гииернариабельных зондов
5. Секвенирование гипервариабельных участков ДНК человека.
е- Установление хромосомной локализации полученных полиморфных маркеров методом гибридизапии с ДНЕ клеток соматических гибридов.
Научная новизна- Для детального изучения представленности и молекулярной организации в геноме человека были выбраны повторяющиеся элементы, сходные с тандемными повторами в env-гене вируса hiv-i twong-staai et а і. , 1905 і. Показано, что у человека имеются участки ДНК, гомологичные повторам hiv-i (названные повторами Red-от англ. Repeat Envelope Deletion), многие ИЗ которых ЯВЛЯЮТСЯ высокополиморфныни. В делом характер раевределения гомологичных фрагментов при гибридизапии по Сауэерну напоминает таковой для повторов из гена ш бактериофага мі з по количеству Фрагментов и степени их вариабельности, но отличается набором детектируемых локусов.
Было выделено несколько индивидуальных участков генома, предположительно содержащих повторы Bed-семейства, дальнейший молекулярно -генетический анализ отобранных клонов показал, что некоторые из них действительно несут такие Фрагменты, характеризующиеся высокой нестабильностью в геноме- Различные варианты повторов Red-семейства оказались по-разному распределены в геноме человека, что касается как количества копий, так и расположения родственных локусов.
Определение нуклеотидной последовательности одного из участков показало наличие в нен кластера повторявшихся элементов- При сравнении структуры этих повторов с известными мотивами было установлено, что семейство Red-повторов относится к широкому классу мини-сателлитов, напоминающих по нуклеотидной последовательности рекон-бинапионный сигнал е. сои, или сы-нинисателлитов, впервые описанных А. джеффрисон t Jeffreys et ai. , ige5). ряд свойств выделенного повтора позволяет предположить эволюдионную и Функциональную значимость данной последовательности и могут быть полезны при
построении классификации минисателлитон как таковых и простых тандемных повторов в целом. Впервые описан минисателлит с минимальным периодом 7-е пар оснований и показана гомология всей последовательности с телсмерными структурами и генами Функционально важного класса различных глобинов и некоторых онкогенов.
Определена локализация участка повторявшихся элементов на хромосоме человека 21 нетодом гибридизации с ДНК клеточных линий соматических гибридов хомяк/человек-
Научно-практическое значение. На основании полученных результатов сказалось возможным создать коллекцию гипервариабель-ных маркеров, характеризующихся моно- и нультилокусной специфичностью Впервые описаны нультилскусные маркеры, детектирующие сложные индиЕидоспениФические профили распределения вариабельных фрагментов генома человека в жестких условиях гибридизации с высокой воспроизводимостью. Эффективность идентификации индивидуальных генотипов по оценкан, сделанным в нашей лаборатории, превышает описанную в мировой литературе на несколько порядков. В нескольких совместных исследованиях было показано, что разработанные тест-системы являются эффективными при анализе генетических изменений при злокачественных изменениях, эволюционных И ПОПУЛЯПИ-онных исследованиях, или при оценке генетической нестабильностии в ралианионно неблагоприятных районах. С использованием разработанных тюб проводятся криминалистические экспертизы и установление отоонстм в Экепертно-Криминалистическом Центре МВД России- Для анализа сиеплености геномных локусов, ответствнных за шизофрению и болезнь Лльшеимера, в нашей лаборатории проводилось тестирование отягощенных семей при помощи получении гипервариабельных мар-кгрон- На основании накопленных данных можно утверждать, что разработанные системы генетической идентификации не только не уступают, но по дФФектииности анализа несколько превосходят широко
- « -
используемые во всем мире для генотипирования нинисателлиты А- ДжеФФриса и олигонуклеотидные пробы и.Зпплена. Разработанные нонолокусные гипервариабельные пробы - еше одна из многих точка отсчета для построения полной генетической карты генома человека-
Положения, выдвигаемые на зашиту.
«. Обнаружено несколько вовых семейств повторяющихся последовательностей ДНК человека и проведен анализ их представленности в геноме и некоторых отдельных хромосомах.
-
выделены индивидуальные участки генома человека, содержащие последовательности, гомологичные повторам из env-гена вируса Hiv-i (Bed-семействоі. Показано, что варианты таких повторов гомологичны различным гипервариабельным локусан в геноме человека.
-
Определена нуклеотидная последовательность неизвестной ранее вариабельной области генома человека Hed-2.
-
определена хромосомная локализация участка Rea-г методом гибридизапии с ДНК клеток соматических гибридов человек/хомяк.
s. создана коллекция новых гипервариабельных маркеров ДНК, пригодных для ДНК-фингерпринтинга, популяционных и недико-генетических исследований
Апробация работы Результаты исследования были представлены на межлабораторном семинаре Института Клинической Психиатрии нцпз РАИН (1992 г. ), Первой международной конференции по ДНК-Фингер-принтингу (Берн, 1990 г. 1, 24 Европейской конференции по генетике человека (Эльсинор, 1992 г- I, Второй международной конференции по ДНК-Фингерпринтингу і Белу-Оризонте, «992 I'. |.
Публикации. Но теме диссертации опубликовано 19 печатных работ-
Структура и объем работы Работа изложена на /ZE страницах машинописного текста-, состоит vr- ниглепия, обзора литературы, экс-