Введение к работе
В последние насколько лет достигнут большой прогресс в исследовании молекулярной, организации пигмент-белкового комплекса фотосистемы и. Зга было .обусловлено,, правде всего, успешным применением; методов молекулярной генетики, іслонировашіем и секвенированиэм генов, контролйрувдих фотосинтез у высших растений, водороорчй и цианобактерий, что позволило определить первичную структуру большинства белков аппарата фотосинтеза. Во-вторых,, большое .значение имело определение с помощью рентгеноструктурного анализа пространственной организации реакционного центра фотосистемы пурпурн. : бактерий (Deisenhofer et al.,1985). Кроме того, существенный и все возрастающий вклад в изучение, молекулярных основ оксигенного фотосинтеза вносит использование в качестве модельного объекта цианобактерий. Процесс фотосинтеза и структура фотосинтетического аппарата у этих микроорганизмов практически идентичны таковым у выспта растений и эукариотических водорослей. С другой стороны, прокариотический тип строения клетки, простота организации генома, способность некоторых штаммов к генетической трансформации открывают возможность широкого пименения методов молекулярной генетики и генной инженерии. Способность некоторых видов цианобактерий к гетеротрофному росту в отсутствие-активности фотосистемы ц позволяет получать жизнеспособные мутанты, дефектные по генам, контролирующим работу этого комплекса. Сайт-направленное изменение этих генов у цианобактерий Synechocystis 6803 оказалось чрезвычайно плодотворным подходом в исследовании тонкой организации реакционного центра ФС и и каталитического центра окисления HgO, определении молекулярной
природа некоторых элементов фотосиитетических мембран и цеп транспорта электронов (БеЬиз et al., 1988; Carpenter, Vermaas 1989; Pakrasl .і al., 1991).
Однако многие вопросы структурной организации . функционирования комплекса фотосистемы II пока нэ ясны., частности, мало известно о структурно-функциональной органпзаці хлорофилл а - связывающих белков фотосистемы II (СР47 и С.43), г имеющих прямых аналогов в реакционном центра пурпурных бакторй Это ограничивает возможность применения для их изучения .лето; сайт-направленного мутагенеза. Более удобным продставляак альтернативный подход - отбор спонтанных ила индуцированш мутантов с нарушениями в генах, кодирующих эти белки, последующей локализацией мутационных повреждений. Это позволз определить функционально важные домены и аминокислоты в структу] этих Оелков, для последунцего анализа которых можно буд использовать сайт-направленный мутагенез. Цель н задачи исследования. Данная работа посвяще: молекулярно-генетическому анализу гена psbB, кодаругаще хлорофилл а - связывающий белок СР47 фотосистемы II Synachocyst 6803. Основные задачи исследования:
-
создание геномного С~чка Synechocystie 6803 И выделение него рекомбинантных плазмид, трансформирующих к фотоавтотрофнос дефектные по фотосинтезу мутанты этой цианобактерии;
-
идентификация и локализация генов фотосинтеза в соста клонированных фрагментов ДНК Synechooystis 6803;
-
молекулярно-генетический анализ серии фотосинтетическнх (ФС мутантов Syneohocystis 6803, дефектных по гену psbB, определеї молекулярной природы мутационных повреждений;
4. определение функционально значимых районов "и отделы
аминокислот белка СР47, необходимых для обеспечения активної
комплекса фотосистемы II.
Научная новизна і практическая ценность. Клонирован ген pt Syneohocystis 6803, кодирующий 47 KDa хлорофилл а - связцвап белок фотосистемы II. Проведен молекулярно-генетический ана. , серии pabB-мутантов Synechocyetis 6803, позволивший локализові генетически. повреждения в пределах гена. Определеї молекулярной природа повреждений у ряда мутантов дало возможно выявить ' функционально важные» участки белка СР47. Се рзоВ-мутантов Synechocyetie 6803, охарактеризованных генетиче и биофизически в данной работе, может быть использована
детального изучения структурно-функциональной организации белка СР47 в составе фотосштетических мембран, для решения задач создания фотобиотехнических систем.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярной организации аппарата оксигенного фотосинтеза цианобактерий, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсувдения, заключения,, выводов и списка цитируемой литературы. Работа