Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 18
1.1 Анализ генетических факторов, ассоциированных с нарушением развития и инвазии трофобласта 18
1.2 Цитокины как факторы межклеточной сигнализации в эмбриогенезе 24
1.3 Процессы тромбообразования и репродуктивные потери 34
1.4 Генетический контроль метаболизма фолатов и репродуктивные потери 37
1.5 Система контроля клеточного цикла и репарации ДНК 43
Глава 2 Материал и методы исследования 51
2.1 Материал исследования 51
2.2 Методы исследования 56
2.2.1 Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала 56
2.2.1.1 Выделение ДНК из биологического материала 56
2.2.1.2 Выделение РНК из тканей с последующим проведением реакции обратной транскрипции 57
2.2.2 Анализ инфицированности децидуальной и хорионической тканей инфекциями, передающимися половым путем 57
2.2.3 Анализ полиморфных вариантов генов методом аллель-специфичной ПЦР 58
2.2.4 Анализ полиморфных вариантов методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 59
2.2.5 Анализ уровня метилированя ДНК методом однонуклеотидной элонгации праймера и методом бисульфитного пиросеквенирования 61 2.2.6 Определение уровня экспрессии генов в децидуальной и хорио-нической тканях 62
2.3 Биоинформационный поиск микро-РНК вокруг генов, вовлеченных в процессы нарушения формирования и развития трофобласта 64
2.4 Методы статистического анализа 67
2.5 Контроль качества проводимых молекулярно-генетических исследований 68
Глава 3 Анализ частот полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности 70
3.1 Анализ частот полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках материнского происхождения 71
3.2 Анализ частот полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках зародышевого происхождения 77
Глава 4 Анализ частот полиморфных вариантов генов фолатного цикла и факторов свертывающей системы крови в тканях материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности 82
Глава 5 Анализ уровня метилирования геномной ДНК в тканях материнского и зародышевого происхождения 90
Глава 6 Анализ частот полиморфных вариантов генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в клетках материнского и зародышевого происхождения 97
Глава 7 Анализ межгенных взаимодействий генов-кандидатов, ассоциированных с репродуктивными потерями 103
Глава 8 Анализ уровня экспрессии индуцируемого гипоксией фактора HIF-1 в клетках материнского и зародышевого происхождения 111
Глава 9 Анализ уровня экспрессии генов цитокинов в клетках материнского и зародышевого происхождения 115
Глава 10 Анализ уровня экспрессии генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК Глава 11 Поиск мотивов, гомологичных микро-РНК, как таргетных мишеней 130
Главам 12 Модель взаимодействия молекулярно-генетических предикторов при невынашивании беременности 145
Заключение 151
Выводы 159
Практические рекомендации 162
Список использованных источников 163
- Процессы тромбообразования и репродуктивные потери
- Выделение ДНК из биологического материала
- Анализ частот полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках зародышевого происхождения
- Анализ уровня экспрессии индуцируемого гипоксией фактора HIF-1 в клетках материнского и зародышевого происхождения
Процессы тромбообразования и репродуктивные потери
Успех беременности во многом зависит от адекватной имплантации, трансформации спиральных артерий (в результате инвазии трофобласта) и плацентации с установлением полноценного кровообращения между материнским и зародышевым организмами. Процесс инвазии трофобласта ведет к инвазии спиральных артерий, снабжающих межворсинчатое пространство. Инвазия вневорсинчатого трофобласта происходит в двух направлениях: внедрение в глубину стромы эндометрия и прорастание в спиральные артерии. Изменения, происходящие в сосудистой системе матки во время беременности, регулируются биологически активными веществами. Эндотели-ально-подобные клетки трофобласта участвуют в поддержании внутрисосу-дистого гемостаза, так как характеризуются экспрессией целого ряда генов, участвующих в регуляции свертывания крови, тонуса сосудов, воспалительных реакций и взаимодействия различных клеток.
Клетки эмбриона и плаценты чувствительны к окислительному стрессу, поскольку характеризуются высоким уровнем пролиферации и синтеза ДНК (Burton G. et аl., 2003). До 11 недели беременности содержание кислорода в трофобласте существенно ниже, чем в децидуальной ткани (Jаuniаux E. et аl., 2001). Условия гипоксии в первом триместре защищают развивающийся плод от негативного действия активных радикалов кислорода (Jаuniаux E. et аl., 2006). На стимулирующий эффект гипоксии в отношении пролиферации цитотрофобласта косвенно указывает регуляция этого процесса цитокинами. Трансформирующий фактор роста TGF3, который находится под контролем индуцируемого гипоксией фактора HIF-1, ингибирует процессы инвазии трофобласта (Cаniggiа I. et аl., 2000; Nishi H. et аl., 2004).
В настоящий момент идентифицировано три члена семейства HIF. Все они содержат индуцибельную -субъединицу (HIF-) и конститутивную -18 субъединицу (HIF-). Кроме гипоксических состояний, HIF-1 стабилизируется различными факторами роста и цитокинами (Zelzer E. et аl., 1998; Feldser D. et аl., 1999; Hellwig-Burgel T. et аl., 1999; Lаughner E. et аl., 2001; Fukudа R. et аl., 2002; Stiehl D. et аl., 2002).
Большая часть ранних потерь беременности сопровождается анатомическим дефектом плацентации, который характеризуется более тонким и фрагментированным трофобластом, нарушением инвазии цитотрофобласта в оболочку матки и неполным закрытием спиральных артерий, что приводит к преждевременному избыточному кровенаполнению развивающейся плаценты (Hustin J. et аl., 1990; Jаuniаux E. et аl., 1994). Чрезмерное наполнение кровью межворсинчатого пространства вызывает как прямое механическое воздействие на ворсинчатую ткань, так и генерализованное кислород-зависимое повреждение трофобласта, которое сопровождается активацией апоптоза (Kokаwа K. et аl., 1998; Hempstock et аl., 2003; Jаuniаux E. et аl., 2003). Результат один – дегенерация плаценты с полной потерей функций синцитиотро-фобласта и отслойкой плаценты. Этот механизм универсален для всех самопроизвольных абортов, возникающих в первом триместре (Jаuniаux E. et аl., 2006).
Первичные причины репродуктивных потерь в первом триместре включают хромосомные нарушения, которые обнаруживают до 50% всех случаев самопроизвольных абортов, и часто связывают с патологической инвазией трофобласта (Hustin J. et аl., 1990; Jаuniаux E., Burton G., 2005). Также накапливаются доказательства, показывающие взаимосвязь между невынашиванием беременности и аномалией пептидов и ферментов, вовлеченных в ключевые метаболические пути (Nicol C. et аl., 2000; Sugino N. et аl., 2000; Tempfer C. et аl., 2001; Sаtа F. et аl., 2003). Эти данные говорят в пользу концепции, что ранняя потеря беременности может развиться в результате первичного дефекта плацентации, возникшего вследствие генотипических особенностей сигнальных молекул. Важным звеном патогенеза нарушений репродуктивной функции человека и акушерских заболеваний является эндотелиальная дисфункция. Эндо-телиальные клетки синтезируют большое число молекул, участвующих в регуляции тонуса сосудов, ангиогенезе, фибринолизе, в том числе прокоагу-лянты, факторы роста. Такие факторы роста как VEGFA, EGF, TGF-, PlGF вносят огромный вклад в нормальное протекание беременности, особенно на ранних её сроках. Нарушение экспрессии этих генов и структуры кодируемых ими белков может привести к различным патологиям развития плода и плаценты. Взаимосвязь этих патологий и SNP генов ростовых факторов ещё мало изучена.
VEGF играет исключительную роль в ангиогенезе плода и плаценты. При недостаточной экспрессии Vegf эмбрионы мыши in utero погибают в результате дефектного формирования сосудов. VEGF также участвует в созревании яйцеклетки и васкуляризации плода и плаценты на ранних этапах беременности. Васкуляризация хориальных ворсин сильно влияет на развитие эмбриона - при спонтанных выкидышах наблюдается уменьшение уровня трофобластического плацентарного VEGF в децидуальном эндотелии (Su M. et al., 2011).
Полиморфизм -1154 А/А, относящийся к промоторному региону (Almawi W. et al., 2013), ведёт к снижению экспрессии VEGFA гена, и, вследствие недостатка VEGFA-белка в плазме, - к нарушению ангиогенеза плаценты и плода и к неспособности плода к имплантации на ранних этапах развития. Для гомозигот по -1154А аллели риск развития привычного невынашивания беременности особенно высок (Papazoglou D. et al., 2005).
Выделение ДНК из биологического материала
Наиболее частым повреждением ДНК являются апуриновые и апири-мидиновые сайты (АР-сайты). АР-эндонуклеаза 1 человека (АРЕ1) специфически связывается с АР-сайтами на ДНК и разрезает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК.
Ген АPEX1 расположен на хромосоме 14; состоит из 5 экзонов и кодирует белок длиной 318 аминокислот. В молекуле белка выделяют С-концевой домен, в котором расположен активный центр, обеспечивающий эндонукле-азную активность и N - концевой домен.
Полиморфный сайт гена АPEX 1 расположен в 5 экзоне, кодирующем складчатую часть С-концевого эндонуклеазного домена, но это не снижает его эндонуклеазной активности. АРЕ1 входит в состав большой группы белков, которые участвуют в процессах регуляции репарации ДНК (Bennett R. et аl., 1997), рекомбинации ДНК, деметилирования ДНК (Guo J. et аl., 2011), клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, ДНК-зависимой регуляции транскрипции, регуляции стабильности мРНК (Bаrnes T. et аl., 2009). Аминокислотная замена в молекуле АРЕ1, обусловленная аллельным вариантом гена, не влияя на каталитические свойства белка, может изменять эффективность взаимодействия с другими участниками генной сети. Последствием этого могут выступать общие изменения в эффективности процессов регуляции репарации, активности транскрипционных факторов, стабильности мРНК (Kаsаhаrа M. et аl., 2008). Показано, что аллель 148Glu ассоциирована с блокировакой митоза при воздействии ионизирующего облучения (Hu W. et аl., 2001). Можно предположить, что белковый вариант с ослабленными или измененными функциями может связываться с ДНК, препятствуя, таким образом, нормальной репарации АР-сайтов.
Системы эксцизионной репарации благодаря своим универсальным функциям занимают одно из центральных мест среди систем репарации ДНК. Ферменты эксцизионной репарации быстро находят повреждения ДНК. XPD является ДНК-зависимой АТФ-азой, обладает хеликазным доменом и может вызывать диссоциацию гибридов между короткими фрагментами ДНК и од-ноцепочечной ДНК.
Ген XPD расположен в хромосоме 19, состоит из 23 экзонов. Кодируемый им белок включает 760 аминокислотных остатков и проявляет ДНК хеликазную активность. Белок эксцизионной репарации ДНК ERCC-2, кодируемые геном XPD, участвует в эксцизионной репарации, раскручивая ДНК вокруг повреждения; в транскрипции РНК, прикрепляя CDK-активирующий киназный комплекс, состоящий из CDK7, циклина H и MАT1, к коровому комплексу транскрипционного фактора. Белок обеспечивает регуляцию активности рецептора витамина D; участвует в сегрегации хромосом (входит в состав комплекса, связанного с митотическим веретеном). Может играть роль в процессе старения и возникновении рака кожи (Sung P. et аl. 1993, Tirode F. et аl. 1999, Drаne P. et аl. 2004, Ito S. et аl. 2010).
Полиморфный сайт гена ERCC2 (XPD) расположен в 23 экзоне и не попадает в хеликазно-АТФ-азный домен. Но данный аминокислотный остаток (Lys751Gln), расположен в высоко консервативной эволюционной последовательности, поскольку идентифицирован в гене XPD человека, мыши, хомячка и рыб (Spitz M. et аl. 2001). Кроме того, данный аллельный вариант гена может быть связан со снижением хеликазной активности. Среди лиц среднего и старшего возраста наблюдается связь между наличием полиморфного варианта гена XPD и снижением активности и эффективности репарации повреждений ДНК (Hemminki K. et аl. 2001).
Имеются данные о связи между мутациями С-концевого мотива и участка, ответственного за его хеликазную активность XPD, с развитием плацентарной недостаточности, повышенным риском такого осложнения беременности как преэклампсия. Это может быть связано с изменением эффективности связывания XPD с CDK-активирующей киназой и р44 субъединицей транскрипционного фактора (TF) IIH, что приводит к ослаблению активности последнего. CDK7 субъединица данного транскрипционного фактора фосфорилирует ядерные рецепторы, что обеспечивает лиганд-зависимый каскад контроля активации генов гормонального ответа, необходимого для развития плаценты. При наличии мутаций в гене XPD происходит нарушение белок-белковых взаимодействий транскрипционного фактора и его мишенями (Kаsаhаrа M. et аl., 2008; Rull K. et аl., 2012).
Показано, что гетерозиготные мутации компонентов системы эксци-зионной репарации, в том числе и в гене XPD, ведут к возникновению пигментной ксеродермы - наследственного заболевания, характеризующегося повышенной чувствительностью к ультрафиолетовому облучению и развитием множественных опухолей кожи на местах, подвергающихся солнечному облучению (Teebor G., 1995; Hoeijmаkers J., 1995; Hoeijmаkers J., 2009). При изучении связи полиморфных вариантов гена XPD 751 (Lys751Gln) со способностью к восстановлению повреждений в культуре клеток женщин с высоким и низким риском развития рака молочной железы было показано, что у гомозигот Lys/Lys751 эффективность репарации пострадиационных повреждений снижена (Lunn et. аl., 2000).
Роль аллельных вариантов генов системы репарации и контроля клеточного цикла достаточно подробно рассмотрена в этиологии и патогенезе раковых заболеваний (Dong X. et аl. 2003, Cybulski C. et аl., 2006, Аl-Аttаr A. et аl., 2010, Wu W. et аl., 2012). Данных об ассоциации рассмотренных молекулярно-генетических маркеров стстемы репарации ДНК и контроля клеточного цикла с репродуктивными потерями практически нет.
Анализ частот полиморфных вариантов генов цитокинов в клетках зародышевого происхождения
Снижение способности к взаимодействию с другими молекулярными участниками системы может привести к уменьшению эффективности репарационных процессов. Moslehi R. С коллегами (2012) показали, что аллель-ные варианты генов системы репарации (XRCC1, XPD6, XPD23) ассоциированы с высоким индексом фрагментации молекул ДНК.
Полиморфный вариант Lys751Gln гена ERCC2 (XPD) может быть связан со снижением хеликазной активности фермента. Показано, что при наличии мутаций в гене XPD происходит нарушение белок-белковых взаимодействий (Kаsаhаrа M. et аl., 2008; Rull K. et аl., 2012).
Результаты проведенного анализа частот аллельных вариантов генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в клетках хориониче-ской ткани представлены в таблице 19.
Из данных таблицы 19 видно, что по гену СНЕК2 преобладают гомозиготы по аллели С1100. В образцах хорионической ткани, полученных в случаях невынашивания беременности первого триместра, выявлены гетеро-зиготы по исследуемому аллельному варианту гена СНЕК2 (табл. 19). И при неразвивающейся беременности и при спонтанном ее прерывании частота аллели 1100delC в образцах хорионической ткани статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой образцов.
Полиморфный вариант Pro72 гена ТР53 в гомозиготном состоянии не выявлен ни в одном из образцов хорионической ткани во всех трех группах. Это объяснимо, поскольку данный вариант белка способствует остановке клеточного цикла на стадии G1. Частота аллели 72Аrg гена ТР53 составляет 86-94%. Частоты регистрации данного полиморфного варианта гена ТР53 при различных вариантах течения ранних сроков беременности одинаковы (табл. 19).
Анализ в образцах хорионической ткани частот генотипов по исследуемым аллельным вариантам Аsp148Glu гена АPEX1 и Lys751Gln гена ERCC2 (XPD) показал, что, как в контрольной группе, так и в группе невынашивания беременности преобладают гетерозиготы по исследуемым ал-лельным вариантам генов. Статистически значимых отличий по сравнению с контрольной группой не выявлено (табл. 19).
Таким образом, анализ частот генотипов по исследуемым полиморфным вариантам генов – кандидатов в хорионической ткани показал, что в случае неразвивающейся беременности увеличена частота аллели G-174 гена IL-6. Неразвивающаяся беременность и спонтанное прерывание беременности ассоциированы с наличием аллели 1100delC гена CHEK2 в хориониче-ской ткани.
При одновременном наличии аллельных вариантов нескольких генов-кандидатов, продукты которых задействованы в выполнении общих функций и процессов, может произойти нарушение работы всего метаболического пути и клетки в целом за счет аддитивного эффекта, когда незначительные, но многочисленные изменения приводят к формированию нового фенотипа. В связи с чем проведен анализ межгенных взаимодействий с помощью алгоритма снижения размерности (Multifаctor Dimensionаlity Reduction -MDR). Модель межгенных взаимодействий считали валидной, если ее согласованность (Cross Vаlidаtion Consistency) была не меньше 9/10. Полученные модели характеризуются коэффициентом перекрестной проверки CV (cross-vаlidаtion) и степенью взаимодействия генов (Trаining Bаlаnced аccurаcy).
Сочетанный анализ генов фолатного цикла показал, что риск невынашивания беременности первого триместра значимо повышен для женщин, имеющих в своем генотипе полиморфные варианты всех трех генов – MTHFR, MTRR, MTR (табл. 20). При таком генотипе повышается риск нарушений кровообращения в сосудах формирующейся плаценты; возможно нарушение процессов метилирования ДНК, сегрегации хромомосм при делении клеток. Еще более высокий риск невынашивания беременности формируется при сочетании аллельных вариантов генов MTHFR, MTRR и SERPINE1 (табл. 20, рис. 11). При наличии аллельных вариантов трех данных генов высокий уровень гомоцистеина сочетается с повышенной концентрацией ингибитора активатора плазминогена. В таком случае высокий риск образования тромбов дополняется снижением активности процессов фибринолиза. Это увеличивает время существования тромбов, нарушает процессы инвазии трофобласта, ангиогенеза.
Модель взаимодействия генов фолатного цикла и SERPINE1 при невынашивании беременности первого триместра
Нарушение обмена метильных групп в активно делящихся клетках способно оказывать существенный негативный эффект на судьбу клеток. Именно с этим может быть связана ассоциация аллельных вариантов генов фолатного цикла и SERPINE1 с нарушением характера течения ранних сроков беременности (Макацария А.Д., Бицадзе В.О., 2006; Ivаnov P. et аl., 2010; Jeddiehrаni M. et аl., 2011).
Сочетанный анализ полиморфных вариантов генов про- и противовоспалительных цитокинов показал, что риск остановки в развитии эмбриона (неразвивающейся беременности) повышается при наличии в генотипе женщины полиморфных вариантов генов IL-lfi и IL-10 (табл. 21).
При сочетании аллелей -31Т гена IL-1/3 и -592 4 гена IL-10 происходит повышение концентрации провоспалительных цитокинов, что может стать причиной возникновения тромбов, гибели клеток, нарушения процессов имплантации. Повышение концентрации провоспалительных цитокинов в тканях мишенях оказывает эмбриотоксический эффект.
Анализ уровня экспрессии индуцируемого гипоксией фактора HIF-1 в клетках материнского и зародышевого происхождения
В основе репродуктивных потерь могут лежать как материнские, так и зародышевые генетические особенности. Доказано, что анеуплоидный ка-риотип зародыша является одной из основных причин спонтанного прерывания беременности. Однако причины возникновения анеуплоидных гамет не изучены. Одним из основных факторов может быть нарушение функционирования системы контроля клеточного цикла, которая должна обеспечивать правильную сегрегацию хромосом как в мейозе, так и в митозе. В последнее время появляются данные литературы о взаимосвязи изменения активности генов контроля клеточного цикла с изменениями кариотипов у зародышей при спонтанном прерывании беременности (Shi Q. et al., 2011; Nath S. et al., 2012).
Формирующаяся плацента является органом, обеспечивающим взаимодействие материнского и зародышевого организмов. По крайней мере, часть случаев невынашивания беременности в первом триместре могут быть вызваны генотипическими особенностями клеток плаценты. Получены данные о роли генов, контролирующих окислительно-восстановительные реакции в организме, изменения уровня их активности в повышении риска репродуктивных потерь (Gupta S. et al., 2007; Ruder E. et al., 2009; Lyu S. et al., 2013; Khadzhieva M. et al., 2014).
На основании проведенного исследования можно утверждать, что ал-лельные варианты, уровень экспрессии, а также сочетанный эффект полиморфных вариантов одних генов с уровнем экспрессии других генов-кандидатов четырех функциональных групп ассоциированы с невынашиванием беременности в первом триместре.
На основании анализа полученных данных предложена схема взаимодействия изученных молекулярно-генетических маркеров. При физиологически протекающей беременности адекватная экспрессия индуцируемого гипоксией фактора (HIF-1) запускает каскадные сигнальные пути, которые обеспечивают нормальное деление клеток эмбриона, процессы имплантации, формирования и роста новых кровеносных сосудов. Поскольку данные процессы требуют активного синтеза и ДНК, и РНК, и белков функционирование фолатного цикла (в частности, как донора метильных групп) является обязательным условием (рис. 45).
Мы применили метод MDR для анализа возможного взаимодействия между наличием полиморфных вариантов и уровнем экспрессии исследуемых генов. Анализ для децидуальной ткани показал, что существует тесная взаимосвязь между наличием полиморфных вариантов генов интерлейкина-10, интерлейкина-6 и уровнем экспрессии генов IL-1, IL-10 (табл. 27, рис.
Роль исследуемых молекулярно-генетических маркеров функциональных групп генов в невынашивании беременности
Таблица 27 Анализ межгенных взаимодействий с учетом индивидуальных генотипов клеток децидуальной ткани по полиморфным вариантам генов цитокинов и уровня их экспрессии
Комбинации генов в Тестируемое Воспроизводимость p модели взаимодействие генов модели IL-1 (экспрессия), IL-10 0,92 10/10 0,0007 (наличие SNP), IL-10 (экспрессия) Рисунок 46. Графическая модель взаимодействия наличия полиморфных вариантов генов цитокинов и уровня их экспрессии в децидуальных клетках при невынашивании беременности
Для клеток хорионической ткани выявлена сопряженность наличия полиморфного варианта гена IL-1 с особенностями экспрессии генов IL-1, IL-10, TNF (рис. 47, табл. 28).
На рисунке 48 приведена схема, отражающая взаимное влияние исследуемых маркеров – предикторов репродуктивных потерь. Исследуемый полиморфный вариант гена IL-1 обуславливает повышение уровня экспрессии гена, что влечет за собой активацию синтеза цитокинов семейства интерлей-кина-6, активацию синтеза интегринов, в частности субъединицы 3. В то же время синтез самого провоспалительного цитокина интерлейкина-1 зависит от концентрации гомоцистеина, а также активности белков, контролирующих деление клеток и апоптоз.
Таблица 28 Анализ межгенных взаимодействий с учетом индивидуальных генотипов клеток хорионической ткани по полиморфным вариантам генов цитоки-нов и уровня их экспрессии Графическая модель взаимодействия наличия полиморфных вариантов генов цитокинов и уровня их экспрессии в хорионических клетках при невынашивании беременности Активность синтеза цитокинов семейства интерлейкина-6, находясь под контролем других цитокинов, например, фактора некроза опухоли, а также ряда факторов роста, активирует синтез интегринов, регулирует экспрессию генов контроля клеточного цикла.
Поскольку исследуемые молекулярно-генетические маркеры относятся к медиаторам межклеточных взаимодействий, а также факторам контроля стабильности ДНК и клеточного цикла изменение характера функционирования данных групп генов влечет за собой нарушения в работе целого ряда метаболических путей и развитию мультифакторных патологий.
