Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 10
1.1 Гестоз. Клиническое описание 10
1.4 Результаты генетико-эпидемиологических исследований 15
1.5 Молекулярно-генетические аспекты патогенеза гестоза 17
1.6 Гены, ассоциированные с развитием гестоза 18
1.7 Выбор генов и полиморфных сайтов для настоящего исследования
1.7.1 Гены системы свертывания крови 22
1.7.2 Гены регуляции артериального давления 28
1.7.3 Гены дисфункции эндотелия 32
1.7.4 Гены метаболизма липидов 36
1.7.5 Межгенные и ген-средовые взаимодействия 39
ГЛАВА 2 Материалы и методы 43
2.2 Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала 45
2.3 Анализ полиморфных сайтов генов с помощью гибридизации на ДНК-биочипе 46
2.4 Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ГЩР-ПДРФ-метод)
2.6 Анализ образцов малых РНК на секвенаторе "Ion Torrent" 54
2.7 Статистическая обработка данных 55
3.1 Связь вариантов исследуемых полиморфных сайтов с развитием гестоза 58
3.1.2 Сравнительный анализ частот вариантов исследуемых полиморфных сайтов у беременных
3.1.3 Особенности ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов с риском развития различных клинических форм гестоза з
3.1.6 Ассоциация вариантов исследуемых полиморфных сайтов с клинико-лабораторными показателями 91
3.2.2 Анализ данных секвенирования 99
3.2.3 МикроРНК, содержание которых изменено в образцах плаценты при гестозе по сравнению с нормой 100
ГЛАВА 4 Обсуждение 102
Заключение
- Результаты генетико-эпидемиологических исследований
- Выбор генов и полиморфных сайтов для настоящего исследования
- Анализ полиморфных сайтов генов с помощью гибридизации на ДНК-биочипе
- Особенности ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов с риском развития различных клинических форм гестоза
Введение к работе
Актуальность. Гестоз представляет собой осложнение беременности, возникающее после 20-й недели гестации. Характерной для гестоза является триада клинических симптомов: артериальная гипертензия (АГ), протеинурия и отеки. Гестоз относится к числу самых распространенных осложнений беременности. Частота гестоза по разным оценкам составляет от 5 до 20% всех беременностей [Серов, 2005]. В России гестоз осложняет каждую 5-6 беременность [Айламазян, 2008]. Согласно Росстату в 2013 году симптомы гестоза были зарегистрированы у 15,9% женщин, закончивших беременность []. Особое значение гестоза обусловлено высоким уровнем материнской и детской заболеваемости и смертности. Неблагоприятные исходы для матери и плода при гестозе превышают средние показатели в несколько раз [Серов, 2005; Айламазян, 2008; Репина, 2005; Радзинский, 2007]. Отдаленный прогноз женщин, перенесших гестоз, связан с повышенной частотой развития сахарного диабета, ожирения, ишемической болезни сердца, инсультов [Bellamy et al., 2007; Pouta et al., 2004; Tenhola et al., 2006]. Дети женщин с гестозом чаще страдают различными метаболическими, гормональными и сердечно-сосудистыми заболеваниями [Duley et al., 2004; Tenhola et al., 2006].
Несмотря на длительную историю изучения, этиология и патогенез гестоза остаются по-прежнему малопонятными. В связи с этим большое значение имеют молекулярно-генетические исследования, которые позволяют приблизиться к выяснению причин возникновения гестоза, пониманию механизмов его развития, а в перспективе сделают возможным проведение ранней диагностики, своевременной профилактики и адекватного лечения этого осложнения беременности [Chappel et al., 2006; Mutze et al., 2008; Баранов, 2009; Павлова, 2011].
Степень разработанности темы. Наиболее распространенным направлением в области
молекулярной генетики гестоза является изучение полиморфизма ДНК. Основываясь на данных о
патогенезе гестоза, результатах исследований, полученных на модельных объектах,
полногеномном анализе сцепления и аллельных ассоциаций, идентифицировано свыше 100 генов-
кандидатов этого осложнения беременности []. К ним относятся гены
системы свертывания крови, гены, кодирующие белки ренин-ангиотензиновой системы,
ферменты системы детоксикации, плацентарные факторы, компоненты иммунной системы, гены,
ответственные за функцию эндотелия, метаболизм липидов, гены синтеза гормонов и другие. За
последние годы было проведено немало исследований, посвященных поиску ассоциаций
вариантов полиморфных сайтов генов-кандидатов с развитием гестоза. Тем не менее, проблема
наследственной предрасположенности к гестозу далека от решения. Точно не известны гены,
которые определяют развитие данной патологии. Недостаточно данных об этнических и
популяционных особенностях гестоза, ген-генных и ген-средовых взаимодействиях,
молекулярных механизмах развития этого осложнения беременности, о генетических предикторах гестоза, об ассоциации генетических факторов с различными клиническими формами гестоза.
Сравнительно недавно начаты исследования по изучению роли микрорибонуклеиновых кислот (микроРНК) в патогенезе гестоза. МикроРНК представляют собой малые некодирующие РНК длиной 19-24 нуклеотидов. Эти РНК участвуют в регуляции трансляции и деградации матричных РНК (мРНК). Показано, что микроРНК участвуют почти во всех биологических процессах, как в норме, так и при патологии [Chen and Wang, 2013; Zhao et al., 2013]. Существуют данные, что микроРНК играют важную роль при беременности [Chen and Wang, 2013; Zhao et al., 2013]. По оценкам разных авторов в тканях плаценте синтезируется более 300-600 типов микроРНК, дисрегуляция некоторых из них обнаружена при различных осложнениях беременности, в том числе и при гестозе [Chen and Wang, 2013; Zhao et al., 2013]. С 2012 для анализа содержания микроРНК в плацентарной ткани стали применять метод полногеномного секвенирования [Ishibashi et al., 2012;Weedon-Fekjr et al., 2014]. Однако все подобные работы выполнены за рубежом [Ishibashi et al., 2012;Weedon-Fekjr et al., 2014], в то время как в России таких исследований не проводили.
Цель и задачи. Изучить ассоциацию вариантов полиморфных сайтов генов, контролирующих различные метаболические и функциональные системы (свертывание крови, артериальное давление, функции эндотелия и метаболизм липидов), а также изменений в содержании плацентарных микроРНК с развитием гестоза.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ частот вариантов полиморфных сайтов 7-и генов системы свертывания крови (F7 rs6046, F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918, ITGA2 rs1126643, PAI1 rs1799768), 6-и генов регуляции артериального давления (REN rs2368564, AGT rs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714), 2-х генов дисфункции эндотелия (NOS3 rs1800779, MTHFR rs1801133) и 5-и генов метаболизма липидов (LPL rs328, APOA1 rs4938303, SCARB1 rs5888, NR1H2 rs2695121 и CETP rs3764261) у женщин с гестозом и в группе сравнения.
-
Определить частоты вариантов этих полиморфных сайтов в зависимости от клинических форм гестоза.
-
Оценить влияние сочетаний вариантов изученных полиморфных сайтов на риск развития гестоза и его клинических форм.
4. Исследовать ассоциацию изученных изменений нуклеотидной последовательности c
клинико-лабораторными показателями у женщин с гестозом.
5. С помощью технологии полногеномного секвенирования провести сравнительный анализ
содержания микроРНК в плацентах с гестозом и в плацентах женщин без осложнений
беременности.
Научная новизна. В рамках данного исследования впервые у женщин Северо-Западного региона России проведен анализ ассоциации вариантов полиморфных сайтов генов F7 rs6046, F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918, ITGA2 rs1126643, REN rs2368564, AGT rs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714, NOS3 rs1800779, MTHFR rs1801133, LPL rs328, APOA1 rs4938303, SCARB1 rs5888, NR1H2 rs2695121 и CETP rs3764261 с риском гестоза в целом, в зависимости от тяжести, срока манифестации патологии и наличия фоновых заболеваний. Впервые выявлена ассоциация между риском развития гестоза и генотипом AA rs6046 гена F7. Впервые получены данные, свидетельствующие о роли сочетаний аллелей генов PAI1, AGT, AGTR2 и ADRB2 в развитии предрасположенности к гестозу. Впервые показано, что у гомозигот TT rs1126643 гена ITGA2 повышен риск развития тяжелых форм гестоза (артериальное давление более 160/110 мм.рт.ст.), у гомозигот AA rs4938303 гена APOA1 - риск раннего гестоза (до 34 недели беременности), у гомозигот TT и носителей аллели T rs5888 гена SCARB1 - риск гестоза на фоне ожирения. Установлено, что у гомозигот CC повышен, а у гетерозигот СT rs1126643 гена ITGA2 снижен риск гестоза на фоне сахарного диабета. Впервые показано, что определенные варианты полиморфных сайтов генов AGTR2, MTHFR, LPL и NR1H2 ассоциированы с гестозом на фоне различных заболеваний. Выявлены сочетания генотипов по исследуемым полиморфным сайтам, ассоциированные с риском развития гестоза при наличии фоновых заболеваний. Установлена ассоциация между изученными вариантами генов FGB, ITGB3, REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2, ADRB2, NOS3, PAI1, NR1H2, SCARB1, LPL и клинико-лабораторными показателями у беременных с гестозом.
Впервые в России с помощью технологии полногеномного секвенирования проведено исследование содержания микроРНК в плаценте при гестозе. Впервые получены результаты, свидетельствующие о повышении уровня miR-518a, miR-527, miR-518f, miR-4532 и снижении -miR-135b в плаценте при гестозе.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты настоящего исследования вносят вклад в общее представление о молекулярно-генетических механизмах развития гестоза. Полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований по идентификации генетических факторов риска развития гестоза, создания диагностических систем для выявления женщин с повышенным риском патологии и разработки патогенетически обоснованных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах вузов.
Методология и методы исследования. Диссертационное исследование основано на современных представлениях об этиологии и патогенезе гестоза и проведено в соответствии с мировым опытом научно-исследовательских работ в области молекулярной генетики.
У пациенток с гестозом и у женщин группы сравнения методами молекулярного типирования исследован 21 полиморфный сайт 20 генов-кандидатов гестоза: фактора свертывания крови VII F7 (rs6046), фактора свертывания крови V F5 (rs6025), фактора свертывания крови II F2
(rs1799963), бета субъединицы фибриногена FGB (rs1800790), интегрина бета 3 тромбоцитов ITGB3 (rs5918), интегрина альфа 2 тромбоцитов ITGA2 (rs1126643), ингибитора тканевого активатора плазминогена типа 1 PAI1 (rs1799768), ренина REN (rs2368564), ангиотензиногена AGT (rs699), рецептора к ангиотензину 2 типа 1 AGTR1 (rs5186), рецептора к ангиотензину 2 типа 2 AGTR2 (rs11091046), рецептора 2-го типа к брадикинину BKR2 (rs1799722), адренергического рецептора бета 2 ADRB2 (rs1042713 и rs1042714), синтазы оксида азота 3 NOS3 (rs1800779), метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR (rs1801133), липопротеинлипазы LPL (rs328), аполипопротеина A1 APOA1 (rs4938303), скэвенджер-рецептора класса B типа I SCARB1 (rs5888), рецептора X печени бета NR1H2 (rs2695121) и белкового транспортера эфиров холестерина CETP (rs3764261). Далее с помощью ассоциативного метода изучена связь вариантов исследованных полиморфных сайтов с развитием гестоза. На первом этапе проведен анализ ассоциации этих вариантов с риском гестоза и его отдельных клинических форм. На втором этапе проведен анализ совместного влияния исследуемых изменений на риск развития гестоза в целом и его отдельных клинических форм в частности. На заключительном этапе изучена связь всех исследуемых изменений нуклеотидной последовательности с вариабельностью 44-х клинико-лабораторных показателей при гестозе.
С целью анализа содержания микроРНК при гестозе проведено секвенирование кДНК-копий малых РНК, выделенных из образцов плацентарной ткани от пациенток с гестозом и женщин без осложнений беременности. Далее выполнен сравнительный анализ полученных данных с помощью методов биоинформатики.
Положения, выносимые на защиту:
1. Варианты полиморфных сайтов генов системы свертывания крови, регуляции
артериального давления, функционирования эндотелия и метаболизма липидов, ассоциированы с
развитием гестоза у женщин, проживающих в Северо-Западном регионе России.
2. Определенные варианты исследуемых полиморфных сайтов и их сочетаний влияют на риск
развития гестоза.
3. Существуют различия в ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов и их
сочетаний с риском гестоза в зависимости от клинических особенностей и фоновых заболеваний.
4. Исследуемые вариации ДНК ассоциированы с клиническими и биохимическими
показателями у беременных с гестозом.
5. Плаценты от женщин с гестозом и без осложнений беременности отличаются по
содержанию микроРНК.
Степень достоверности и апробация результатов. Исследование выполняли с использованием современных молекулярно-генетических методов, включая «Кардио-Биочип» и «Фибр-Биочип» («Биочип-ИМБ», Москва) с высокой точностью анализа. Для «Кардио-Биочипа» она составляет 99,0% [Глотов, 2005], для «Фибр-биочипа» - 99,8%. В ходе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, использовали контрольные образцы ДНК, результаты генотипирования для которых были подтверждены секвенированием. Для анализа содержания микроРНК в образцах плаценты использовали технологию ионного полупроводникового секвенирования на приборе Ion Torrent PGM («Life technologies», США). Точность анализа составляет 99,5%. На всех этапах эксперимента (подготовка образцов к секвенированию) проводили контроль качества согласно инструкциям фирмы-производителя. Образцы, не отвечающие требованиям протоколов, исключались из исследования. Основные выводы работы обоснованы и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводов подтверждается корректной статистической обработкой данных.
Результаты были доложены на XX-ом Международном конгрессе по генетике (Berlin, 2008), на Европейских конгрессах по генетике человека (Barcelona, 2008; Amsterdam, 2011), на VI Съезде российских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на 1-ом международном семинаре для молодых учёных Балтийского региона (Tartu, 2010), на II-ой Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), на V Всероссийской конференции «Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), на VI-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону,
2014), на научных семинарах лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Работа поддержана грантами для студентов, аспирантов, молодых учёных, молодых кандидатов наук вузов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга. Работа также проводилась в рамках государственных тем НИР, выполняемых в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах и включает «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» (339 источника) и «Приложения А и Б». В тексте представлено 40 таблиц и 21 рисунок.
Результаты генетико-эпидемиологических исследований
В 1873 г G. Elliot впервые описал случай эклампсии у матери и ее пяти дочерей. В последующих публикациях были отражены отдельные семейные случаи эклампсии [Chesley, 1968]. Обширные эпидемиологические исследования по изучению генетических основ гестоза ученые стали проводить со второй половины 20 века [Павлов и Иванов, 2005].
В серии работ показано, что частота гестоза выше у сестер, дочерей, матерей, внучек женщин, которые имели это осложнение беременности [Humphries, 1960; Adams and Finlayson, 1961; Chesley, 1968; Cooper and Liston, 1979; Sutherland et al., 1981; Chesley and Cooper, 1986; Kilpatrick et al., 1989; Cincotta and Brennecke, 1998]. Эти исследования продемонстрировали возможность семейной передачи гестоза, однако не позволили однозначно определить тип его наследования. Arngrimsson R. et al. (1995) при анализе результатов предыдущих и собственных исследований показали, что модели с аутосомно-доминантным типом наследования с неполной пенетрантностью и полигенным наследованием лучше соответствуют наблюдаемым данным, чем отсутствие семейной передачи или аутосомно-доминантные и рецессивные модели наследования с полной пенетрантностью [Arngrimsson et al., 1995]. В 1996 году Folgero Т. et al. предложили гипотезу митохондриального типа наследования гестоза. Последующие клинико-эпидемиологические исследования ее опровергли [Lie et al., 1998]. В настоящее время считается, что гестоз является типичной мультифакторной патологией, развитие которой определяется сразу несколькими генами на фоне действия различных провоцирующих экзогенных факторов [Павлов и Иванов, 2005; Баранов и др., 2009].
Наследственная природа гестоза косвенно подтверждается повышенной частотой осложнения у женщин, которые перенесли гестоз при предыдущих беременностях. Так гестоз при повторных родах был зарегистрирован у 13,1% пациенток против 1,3% в контроле (0111=11,8; 95%ДИ: 11,1-12,6) [Lie et al., 1998]. Вероятность повторного гестоза по данным мета-анализа возрастает примерно в 7 раз (ОР=7,19; 95%ДИ: 5,85-8,83) [Duckitt and Harrington, 2005].
Более того, у родителей пациенток с гестозом чаще отмечаются различные патологии сердечно-сосудистой системы [Adams and Finlayson, 1961; Magnin et al., 1971]. Наряду с этим Magnussen E.B. et al. (2007) при обследовании 66140 женщин выявили почти двукратное повышение риска развития гестоза в случае положительного семейного анамнеза (родственников первой линии) по ишемической болезни сердца (0111=1,7; 95% ДИ: 0,0-3,0).
В литературе встречаются публикации, в которых описаны единичные случаи пар монозиготных сестер-близнецов, страдавших гестозом [Lachmeijer et al., 1998; O Shaughnessy et al., 2000]. Вместе с тем, многие исследователи при изучении больших групп близнецов не нашли сестер, конкордантных по гестозу [Thornton and Onwude, 1991; Treloar et al., 2001]. Thornton J. G. and Macdonald A. M. (1999) изучили когорту близнецов женского пола из Великобритании. Комплекс обследований включал в себя опрос больных и изучение данных медицинской документации. В первом случае наследуемость гестоза составила лишь 0,221, а во втором - исследователям не удалось подтвердить гипотезу о влиянии генетических факторов на вероятность развития гестозов [Thornton and Macdonald, 1999]. В то же время Salonen R. Н., et al. (2000) при обследовании 917 монозиготных и 1199 дизиготных пар близнецов из Швеции оценили коэффициент наследуемости гестоза как 0,54. Но 95%-доверительный интервал этого значения оказался довольно большим (0,00-0,71) [Salonen et al., 2000]. Результаты другого исследования, выполненного в Швеции при изучении 244564 пар сибсов женского и мужского пола, показали, что основную роль в развитии гестоза играют генетические особенности самой беременной. Их вклад составляет 35% от всех факторов риска (на долю генетических факторов плода приходится примерно 20%, а совместный эффект генотипов матери и плода составляет около 13%) [Cnattingius et al., 2004].
Отмечены этнические особенности распространенности гестоза [Arngrimsson et al., 1999; Caughey et al., 2005]. Чаще это осложнение беременности встречается у чернокожих женщин, реже у представительниц Латинской Америки и Европы, самая низкая частота отмечена у азиатских женщин [Caughey et al., 2005]. Установлено, что этническая принадлежность влияет не только на частоту возникновения, но и на особенности клинического проявления гестоза и эффективность терапии [Goodwin and Mercer, 2005]. У чернокожих женщин гестоз характеризуется устойчивым гипертензивным синдромом и более высоким артериальным давлением (АД). Отличительной особенностью терапии является необходимость длительного применения внутривенных препаратов для снижения АД [Goodwin and Mercer, 2005]. У представительниц европеоидной расы гестоз чаще сопровождается тромбоцитопенией и выраженными нарушениями функций печени, выше риск развития HELLP-синдрома [Goodwin and Mercer, 2005].
В настоящее время не вызывает сомнений, что в развитии гестоза важную роль играют наследственные факторы. Однако, несмотря на многолетние исследования, вопрос о молекулярно-генетических механизмах, лежащих в основе патогенеза гестоза, остается до сих пор открытым.
Существенная роль в патогенезе гестоза отводится полиморфизму ДНК [Chappell and Morgan, 2006; Mutze et al., 2008; Баранов и др., 2009]. Наиболее частым в геноме человека является однонуклеотидный полиморфизм. Однонуклеотидные замены составляют значительную часть изменений первичной структуры ДНК и встречаются примерно через каждые 300-400 пар оснований [Баранов и др., 2009]. Замены в смысловых участках гена нередко приводят к замене аминокислот и появлению белков с несколько измененными или новыми функциональными свойствами. Замены, находящиеся в регуляторных областях гена, могут оказывать влияние на их экспрессию [Баранов и др., 2009]. Такие генетические вариации вносят важный вклад в индивидуальные особенности каждого человека [Баранов и др., 2009]. Многие варианты начинают проявлять себя только при беременности. Уже длительное время основной концепцией молекулярной генетики гестоза является представление о его ассоциации с однонуклеотидными заменами в генах, продукты которых могут быть вовлечены в развитие этого осложнения беременности (генах-кандидатах). На сегодняшний день в генах-кандидатах гестоза выявлено большое число замен, претендующих на роль генетических маркеров этого осложнения беременности [Chappell and Morgan, 2006; Зайнуллин и др., 2007; Mutze et al., 2008; Баранов и др., 2009; Мальцева и Павлова, 2011; Репина, 2014].
Почти все найденные замены локализованы в ядерном геноме. Вместе с тем, есть сведения, что возникновение и развитие гестоза может быть связано с вариациями митохондриального генома. Folgero Т. et al. (1996) в двух семьях с гестозом нашли однонуклеотидные замены в генах митохондриальных тРНК (A3243G (tRNAleu(UUR) и A12308G (tRNAleu(CUN)).
Помимо однонуклеотидных замен, выявлены делеции и инсерции единичных нуклеотидов, ассоциированных с риском развития гестоза [Chappell and Morgan, 2006; Зайнуллин и др., 2007; Mutze et al., 2008; Баранов и др., 2009; Мальцева и Павлова, 2011; Репина, 2014]. В дополнение к однонуклеотидным заменам, инсерциям и делециям небольшого числа нуклеотидов в качестве генетических факторов риска гестоза могут выступать вариации числа копий относительно больших фрагментов ДНК (CNVs). В исследовании Zhao et al. (2013b) были найдены несколько CNVs, ассоциированных с риском гестоза в различных популяциях (афро-карибы, испанцы и европейцы).
Кроме изменений первичной структуры молекулы ДНК, развитие гестоза может быть связано с различными эпигенетическими факторами. Некоторые авторы предсказывают, что в патогенезе гестоза определенную роль могут играть модификации гистонов [Choudhury and Friedman, 2012]. Гестоз может сопровождаться нарушениями в характере метилирования ДНК. Так, например, показано, что промотор гена SERPINA3 (сериновый ингибитор протеаз) гипометилирован в плацентах женщин, чья беременность осложнена гестозом [Chelbi et al., 2007]. Другой ген, который характеризуется измененным уровнем метилирования при гестозе, это ген TIMP3 (тканевой ингибитор металлопротеиназы 3 типа) - один из регуляторов инвазии трофобласта. Промотор этого гена гипометилирован в плацентах от пациенток с ранним гестозом, что может приводить к повышенной экспрессии TIMP3, и, как следствие, к ингибированию металлопротеиназ и недостаточной инвазии трофобласта [Xiang et al., 2013].
Одним из интенсивно развивающихся в последние годы направлений в области молекулярной генетики гестоза является изучение микроРНК - недавно открытых регуляторов синтеза белков на уровне трансляции мРНК. Ряд исследований установили важность конкретных микроРНК в развитии гестоза [Chen and Wang, 2013; Zhao et al., 2013a].
Данные литературы показывают, что в патогенезе гестоза могут быть задействованы различные молекулярно-генетические механизмы. Настоящая работа посвящена изучению связи изменений в нуклеотидной последовательности ДНК и в содержании плацентарных микроРНК с развитием этого осложнения беременности.
Выбор генов и полиморфных сайтов для настоящего исследования
Выделение ДНК из венозной крови. ДНК выделяли в соответствии с описанным в литературе фенольным методом [Sambrook et al., 1989] с некоторыми модификациями. Для этого кровь (500-1000 мкл) смешивали с равным объемом лизирующего буфера (0,32 М сахароза ("Merck", Германия), 5 мМ MgCb , 1% Тритон Х-100М, 0,1 М Трис-HCl рН 7,5 (все комноненты "Serva", Германия)) и центрифугировали в течение 10 минут при 8 тыс. об/мин. Далее сливали надосадочную жидкость, а осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера для протеиназы К (10 мМ Трис-HCl рН 10.5, 0,15 М NaCl, 1 мМ ЭДТА рН 8,0) (все комноненты "Serva", Германия). Затем к нему добавляли 10%-ый раствор додецилсульфата натрия (SDS) ("Serva", Германия) до конечной концентрации 0,5% (20 мкл), а также 10 мкл свежеприготовленного раствора протеиназы К (концентрация 20 мкг/мл) ("Sigma", США) и оставляли на ночь при 37С. После инкубации к лизату добавляли равный объем фенола (рН 8.0) ("Panreac Applichem", Испания, Германия). Смесь перемешивали 15 минут и центрифугировали 5 минут при 5 тыс. об/мин. Затем осуществляли отбор водной фазы, содержащей ДНК. На следующем этапе повторяли депротеинизацию один раз со смесью равных объемов фенола (рН 8.0) ("Panreac Applichem", Испания, Германия) и хлороформа ("Компонент-Реактив", Россия) и один раз с хлороформом ("Компонент-Реактив", Россия). После чего водную фазу осаждали 2,5 объемами охлажденного 95%-го этанола ("Химзаказ", Россия) в присутствии 0,2 М ацетата Na и оставляли на час при -70С для формирования осадка. Далее осторожно сливали этанол, а преципитат ДНК дважды промывали в 1 мл охлажденного 70%-го этанола и собирали центрифугированием 10 минут при 12 тыс. об/мин. Полученный осадок подсушивали и растворяли в 50-150 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl pH 7.5, 1 мМ ЭДТА) ("Serva", Германия) или ампулированной воды. Концентрацию и чистоту ДНК определяли с помощью спектрофотометра (NanoDrop 2000, "Thermo Fisher Scientific Inc.", США). Раствор ДНК хранили при температуре -20 С.
Выделение малых РНК из плацентарной ткани. Выделение малых РНК проводили с помощью набора "PureLink miRNA Isolation Kit" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США) согласно протоколу. Для этого исследуемый образец (не более 10 мг) гомогенизировали в 300 мкл лизирующего буфера "L3". Полученный лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем 70% этанола (300 мкл), далее полученный раствор (600 мкл) перемешивали с помощью вортекса и наносили на колонку ("Spin Cartridge"). Колонку помещали в пробирку и проводили центрифугирование 1 минуту при 14000 тыс. об/мин. К собранному в пробирке раствору добавляли 95% этанол ("Химзаказ", Россия) до конечной концентрации 70% (700 мкл). Эту смесь перемешивали с помощью вортекса, наносили на новую колонку (650 мкл) и центрифугировали 1 минуту при 14000 тыс. об/мин. Далее удаляли жидкость из пробирки и повторяли процедуру. Затем на колонку наносили 500 мкл буфера для отмывки "W5", проводили центрифугирование 1 минуту при 14000 тыс. об/мин, удаляли жидкость из пробирки и повторяли отмывку еще раз. Колонку переносили в новую пробирку и центрифугировали 1 минуту при 14000 тыс. об/мин с целью полного удаления буфера "W5". РНК элюировали 40 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз. Раствор РНК хранили при -70С до приготовления библиотек. Концентрацию РНК определяли на флуориметре "Qubit 2.0" ("Invitrogen", США) с набором RNA BR Assay Kit ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США). Качество РНК оценивали с помощью системы капиллярного электрофореза "2200 TapeStation Instrument" ("Agilent technologies", США), используя чипы "RNA ScreenTape" и реактивы "RNA ScreenTape Sample Buffer", "RNA ScreenTape Ladder" ("Agilent technologies", США).
Для анализа образцов ДНК использовали биочип, позволяющий исследовать полиморфные сайты генов регуляции АД "Кардио-биочип", созданный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН совместно с ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д.О.Отта" [Глотов, 2005]. Также нами был разработан "Фибр-биочип" для тестирования последовательностей генов системы свертывания крови [Вашукова и др., 2008; Вашукова и др., 2011].
Анализ полиморфных сайтов генов регуляции АД с помощью "Кардио-биочипа". "Кардио-биочип" использовали для анализа полиморфных сайтов генов REN rs2368564, AGT rs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rsl 1091046, BKR2 rsl799722, ADRB2 rsl042713 и rsl042714, MTHFR rsl801133. Анализ образцов ДНК пациенток с гестозом и женщин группы сравнения с помощью "Кардио-биочипа" проводили в соответствии с инструкцией к набору ("Биочип-ИМБ", Россия). Продукты амплификации, полученные с помощью двухэтапной мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), гибридизировали с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидными зондами.
Первый этап мультиплексной ПЦР. На первом этапе ПЦР получали специфические продукты амплификации с участков ДНК, содержащих интересуемые полиморфные сайты. Амплификационная смесь (25 мкл) включала Taq-буфер (30 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ (NH4)2SC 4,) ("Силекс", Россия), 1,5 мМ MgCb ("Силекс", Россия), по 0,2 ммоль каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дезоксиАТФ, -ГТФ, -ЦТФ, -ТТФ) ("Силекс", Россия), 2 мкл смеси оригинальных праймеров [Глотов, 2005], 2,5 ед. акт. Taq-полимеразы ("Силекс", Россия), не менее 10 нг ДНК. ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 95С в течение 5 минут; далее 35 циклов по схеме: 95С - 30 секунд, 60С - 30 секунд, 72С - 1 минута; затем 72С в течение 5 минут.
Второй раунд мультиплексной ПЦР. Второй этап применяли для получения флуоресцентно меченного одноцепочечного ПЦР-продукта. Состав реакционной смеси (25 мкл) был таким же, как описано предыдущем пункте. Только в нее, в отличие от смеси для первого этапа, добавляли меченные цианиновым красителем дезоксиуридинтрифосфаты (Cy5-dUTP, ("Биочип-ИМБ", Россия)) до конечной концентрации 16 пМ/мкл и 2 мкл смеси оригинальных праймеров для второго раунда [Глотов, 2005]. В качестве матрицы использовали амплификат первого этапа ПЦР (1-2 мкл). Амплификацию проводили при следующих условиях: денатурация при 94С в течение 5 минут, далее 35 циклов по схеме: 94С - 30 секунд, 62С - 30 секунд, 72С - 1 минута; затем 72С, 5 минут.
Гибридизация продуктов ПЦР с биочипом. ПЦР-продукты второго этапа наносили на биочип. Для этого готовили 40 мкл гибридизационной смеси (10 мкл формамид ("Serva", Германия), 10 мкл 20х SSPE ("Promega", США) и 20 мкл амплификат), которую денатурировали при 95С в течение 5 минут и охлаждали на льду (2-3 минуты). Далее смесь наносили на биочип и оставляли на ночь при 37 С. После инкубации гибридизационную смесь удаляли, а биочип отмывали в lxSSPE в течение 10-15 минут при комнатной температуре и высушивали.
Анализ полиморфных сайтов генов с помощью гибридизации на ДНК-биочипе
В подгруппе больных отмечалось увеличение частоты аллели Т по сравнению с выборкой женщин без осложнений беременности (39,7% и 24,2%) (ОШ=2,05, 95%ДИ: 1,25-3,37). Гетерозиготы СТ чаще встречались в подгруппе больных (62,2%), чем в группе сравнения (34,3%) (р=0,0009, df=l; рсог=0,0027; 0111=3,13, 95%ДИ: 1,60-6,13). Частота генотипа СС, наоборот, была меньше, в подгруппе больных (29,3%) по сравнению с группой женщин без осложнений беременности (58,6%) (р=0,0005, df=l; рсог=0,0015; 0111=0,29, 95%ДИ: 0,15-0,59). Аналогичные результаты были получены при сравнении частот аллелей и генотипов между подгруппами пациенток с гипертонической болезнью и без таковой (р=0,0233, df=l; pcor=0,0699; 0111=1,80, 95%ДИ: 1,10-2,93 и 2=8,008, р=0,0182, df=2; рсог=0,0546). Частота генотипа СТ была выше, а генотипа СС - ниже в подгруппе с гипертонической болезнью по сравнению с альтернативной подгруппой (41,4% и 52,5%; р=0,0138, df=l; рсог=0,0414; 0111=2,31, 95%ДИ: 1,19-4,50 и р=0,0050, df=l; рсог=0,0150; ОШ=0,37, 95%ДИ: 0,19-0,75).
У беременных с гестозом на фоне вегето-сосудистой дистонии в сравнении с женщинами без осложнений беременности отмечалось некоторое повышение частоты генотипа AG по rsl042713 гена ADRB2 (49,0% и 31,3%) (р=0,0451, df=l; ОШ=2,10, 95%ДИ: 1,03-4,29), которое после коррекции на множественные сравнения оказалось статистически не значимым (рсог 0,05) (приложение Б, таблица 4). Наиболее выраженные различия были установлены для rsl799768 геиа РАП и rsl 1091046 геиа AGTR2 (таблица 16).
Частоты генотипов и аллелей rsl799768 гена PAI1 (-675 5G 4G) и rsl 1091046 гена AGTR2 (3123А С) в подгруппах пациенток с гестозом в зависимости от наличия вегето-сосудистой дистонии (ВСД) 1 Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р 0,05, точный тест Фишера). 2 Цветом выделены ячейки со статистически значимыми различиями (р 0,05) в распределении частот генотипов, полученными при сравнении подгруппы больных с ВСД и группы сравнения (критерий у2). 3 Слева и справа от значений частот в виде подстрочных индексов указаны границы 95 % ДИ. Для rsl799768 гена РАП обнаружены различия в распределении частот генотипов между исследуемыми подгруппами ( 2=10,176, р=0,0062, df=2; рсог=0,0186). Генотип 5G5G реже встречался среди больных с гестозом на фоне вегето-сосудистой дистонии (10,6%), чем у беременных группы сравнения (26,3%) (р=0,032 3, df=l; рСог 0,05; ОШ=0,33, 95%ДИ: 0,12-0,94). В то же время частота генотипа 5G4G была выше в подгруппе больных (70,2%) по сравнению с выборкой женщин без осложнений беременности (42,4%) (р=0,0024, df=l; рсог=0,0072; ОШ=3,20, 95%ДИ: 1,52-6,67) и подгруппой пациенток без вегето-сосудистой дистонии (51,8%) (р=0,0360, df=l; рСог 0,05; ОШ=2,19, 95%ДИ: 1,06-4,54). Анализ rsl 1091046 гена AGTR2 показал, что частота аллели С повышена в подгруппе больных (56,7% против 43,4% в группе сравнения) (р=0,0421, df=l; рсог 0,05; 0111=1,70; 95%ДИ: 1,03-2,82). Также наблюдались различия в распределении частот генотипов между исследуемыми группами (%2=6,73 4, р=0,0345, df=2; рсог 0,05). В подгруппе с гестозом на фоне вегето-сосудистой дистонии отмечалось увеличение частоты генотипа СС по сравнению с группой женщин без осложнений беременности (35,6% против 16,2%) (р=0,0163, df=l; рсог=0,0489; 0111=2,86; 95%ДИ: 1,27-6,44).
Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфных сайтов исследуемых генов в подгруппах пациенток в зависимости от наличия заболеваний почек показал увеличение почти вдвое частоты аллели A rs2368564 гена REN у пациенток с этими заболеваниями по сравнению с беременными без осложнений (20,2% и 11,1%) (р=0,0342, df=l; ОШ=2,02; 95%ДИ: 1,08-3,77), однако, с учетом поправки на множественные сравнения данные различия достоверными не являются (рсог 0,05) (приложение Б, таблица 5). В то же время в подгруппе с заболеваниями почек чаще встречалась аллель С rsl 1091046 гена AGTR2 (62,9%) по сравнению с группой женщин без осложнений беременности (43,4%) (р=0,0009, df=l; рсог=0,0027; 0111=2,21; 95%ДИ: 1,39-3,50) и выборкой больных без заболеваний почек (46,2%) (р=0,0050, df=l; рсог=0,0150); 0111=1,98; 95%ДИ: 1,24-3,16). При анализе частот генотипов rsl 1091046 гена AGTR2 были выявлены различия между подгруппой беременных с гестозом на фоне заболеваний почек и группой сравнения ( 2=12,535, р=0,0019, df=2; рсог=0,0057), а также подгруппой больных без патологий почек (х2=8,234, р=0,0163, df=2; рсог=0,0489) (рисунок 11). пациенток с гестозом в зависимости от наличия заболеваний почек (ЗП) Примечание - обозначены статически значимые отличия (р 0,05, точный тест Фишера), полученные при сравнении подгруппы с ЗП и группы сравнения, обозначены статически значимые отличия (р 0,05, точный тест Фишера), полученные при сравнении подгрупп с и без ЗП, планки погрешностей указывают 95%ДИ. В подгруппе с заболеваниями почек частота генотипа СС (38,7%) превышала таковую в группе сравнения (16,2%) (р=0,0024, df=l; рсог=0,0072; 0111=3,28; 95%ДИ: 1,56-6,87). Генотип АА, наоборот, реже встречался у больных с заболеваниями почек (12,9%) по сравнению с таковой у женщин без осложнений беременности (29,3%) (р=0,0204, df=l; ОШ=0,36; рСОг=0,0612; 95%ДИ: 0,15-0,84) и пациентками без заболеваний почек (31,9%) (р=0,0074, df=l; Рсог=0,0222; ОШ=0,32; 95%ДИ: 0,13-0,75).
У беременных с гестозом на фоне ожирения в сравнении с беременными без осложнений отмечалось повышение частот аллелей A rs2368564 гена REN (20,9% против 11,1%) (р=0,0186, df=l; ОШ=2,11; 95%ДИ: 1,15-3,88) и Ггз1801133 ren&MTHFR (33,6% против 24,2%) (р=0,0376, df=l; ОШ=1,58, 95%ДИ: 0,97-2,56). Генотип СС rsl801133 гена MTHFR встречался несколько реже в подгруппе пациенток с ожирением (41,8% против 58,6% в группе сравнения) (р=0,0332, df=l; ОШ=0,51, 95%ДИ: 0,27-0,95). Однако значения рсог для данных различий были больше 0,05 ( 00 0,05) (приложение Б, таблица 6). Наиболее выраженные различия были установлены для rsl799768 гена РАН и rs5888 гена SCARB1 (таблица 17).
Особенности ассоциации вариантов исследуемых полиморфных сайтов с риском развития различных клинических форм гестоза
Для оценки прогностических качеств выявленных маркеров риска гестоза нами был проведен ROC-анализ. Согласно экспертной шкале для значений AUC [Румянцев и др., 2009], наибольшее прогностическое значение имеют маркеры раннего гестоза {АРОА1 (rs4938303) АА), гестоза на фоне заболеваний почек (AGTR2 (rsl 1091046) СС), гипертонической болезни {MTHFR (rsl801133) СС; MTHFR (rsl801133) СТ) и сахарного диабета (ITGA2 (rsl 126643) СТ). Среди сочетаний генетических маркеров самый высокий диагностический потенциал показали комбинации генотипов изученных полиморфных сайтов РАН (rsl799768) 5G4G + LPL (rs328) СС и РАН (rsl799768) 5G4G + ITGA2 (rsl 126643) СС при прогнозировании гестоза у женщин с заболеваниями щитовидной железы и сахарным диабетом, соответственно. Величины AUC для указанных генетических маркеров и сочетаний находились в переделах значений 0,61-0,65, что свидетельствует об их средней диагностической ценности при прогнозировании риска соответствующих форм гестоза и возможности их использования в качестве тест-систем в медицинской практике.
К сожалению, остальные выявленные маркеры риска гестоза имеют плохие прогностические качества (AUC 0,6) и являются малопригодными для использования в клинической практике. Тем не менее, обнаруженные ассоциации указывают на возможное участие белковых продуктов изученных генов в становлении гестоза, важны для понимания путей и механизмов этого осложнения беременности, а также могут объяснить противоречивость данных литературы. Кроме того, полученные результаты позволяют предположить, что существуют как общие генетические факторы риска гестоза, так и специфические, предрасполагающие к определенным формам патологии. Эта гипотеза поднимает проблему нозологического единства гестоза. Поскольку наибольший вклад в развитие гестоза вносят именно специфические факторы, вероятно, что гестоз в какой-то степени представляет собой совокупность различных патологических состояний со сходными фенотипическими проявлениями, но имеющих разные причины возникновения на молекулярно-генетическом уровне. С другой стороны вероятность гестоза повышается при взаимодействии специфических и общих факторов риска, следовательно, существует единая причина, предрасполагающая к гестозу.
Наряду с большим числом исследований, посвященных поиску ассоциаций нуклеотидных вариаций с риском гестоза, в настоящее время идет накопление сведений о связи генетических факторов с данными лабораторных исследований [Мозговая, 2003; Павлова, 2013]. Для установления возможного влияния изменений в последовательности исследуемых генов на особенности клинических проявлений гестоза данные генотипирования были
113 сопоставлены с результатами клинико-лабораторных исследований. Для большинства генов были обнаружены неслучайные ассоциации их полиморфных сайтов с изменчивостью клинических параметров у пациенток с гестозом (по критерию Краскела-Уоллиса или F-критерий Фишера). К сожалению, практически во всех случаях интерквартильные (25-й и 75-й процентили) и 95%-е доверительные интервалы для исследуемых переменных пересекались, что свидетельствует об относительно слабой роли изученных генетических вариаций в изменчивости клинических параметров. Тем не менее, некоторые обнаруженные нами ассоциации были найдены в работах других авторов.
Так, выявленная нами ассоциация полиморфных сайтов генов FGB rsl800790, BKR2 rsl799722 и ITGB3 rs5918 с уровнем сахара в крови в зависимости от генотипа (р 0,05) ранее была описана в нескольких работах [Wong et al., 2008; Alvim et al., 2012]. Механизм этих связей точно не установлен [Wong et al., 2008; Alvim et al., 2012]. Однако известно, что брадикинин усиливает фосфорилирование субстрата инсулинового рецептора IRS1 и тем самым может принимать участие в регуляции уровня сахара в крови. Кроме того, брадикинин активирует NOS3, благодаря чему усиливается кровоток и увеличивается приток сахара к периферическим тканям [Alvim et al., 2012].
В работе Карпенко М. А. и др. (2007) показана ассоциация вариантов rsl800790 гена FGB - с ПТИ и показателями, отражающими функцию печени, rs5186 гена AGTR1 с уровнем фибриногена и фибринолитической активностью крови. В нескольких публикациях [Niemiec et al., 2008; Turgut et al., 2011] сообщается об ассоциации замены 704Т С гена AGT (rs699) с показателями метаболизма липидов.
Помимо перечисленных ассоциаций, нами впервые были получены данные, свидетельствующие о связи изменений в нуклеотидной последовательности генов FGB rsl800790, ITGB3 rs5918, ADRB2 rsl042713 и rsl042714 с показателями коагулограммы, генов AGT rs699 и BKR2 rsl799722 - с показателями водно-солевого обмена, гена NOS3 rsl800779 - с показателями дисфункции эндотелия, гена AGT rs699 - с оценкой по шкале Апгар у новорожденных, гена ADRB2 rsl042713 и rsl042714 - с биохимическими показателями, позволяющими оценить функциональное состояние печени (р 0,05).
Заслуживают внимание результаты изучения полиморфных сайтов, варианты которых показали связь с риском гестоза при анализе ассоциаций.
Выявлена связь замены 807ОТ (rsl 126643) гена ITGA2 с величиной САД в зависимости от генотипа (р 0,05). У гомозигот ТТ наблюдались более высокие значения САД по сравнению с гомозиготами СС (р=0,0226) и гетерозиготами СТ (р=0,0159), что соответствует результатам, полученным нами при анализе ассоциаций.
Анализ биохимических и клинических параметров у носителей разных генотипов РАН показал ассоциацию rsl799768 (-675 5G 4G) с уровнем фактора Виллебранда в крови беременных с гестозом (р 0,05). У пациенток с генотипами 5G4G гена РАН наблюдалось более высокое содержание фактора Виллебранда по сравнению с гомозиготами 5G5G (р=0,0170) и 4G4G (р=0,0908), что согласуется с данными наших более ранних исследований [Мозговая, 2003].
Показано, что у носителей аллели A rs2368564 (83G A) гена REN повышен уровень триглециридов крови по сравнению с гомозиготами по аллели G (р=0,0371), вследствие чего, вероятно, аллель А связана с повышенной вероятностью развития кардиоваскулярных осложнений при беременности [Austin et al., 1998].
Для rsl 1091046 гена AGTR2 (3123А С) установлена ассоциация генотипов с уровнем общей щелочной фосфатазы и концентрацией калия, а также с весом плаценты (р 0,05). У беременных с гестозом, гомозиготных и гетерозиготных по аллели С, отмечено повышение уровня общей щелочной фосфатазы и калия по сравнению с гомозиготами АА (р=0,0034 и р=0,0225; р=0,0315 и р=0,0098). Вес плаценты был выше у пациенток с генотипами АС и СС по сравнению с носителями генотипа АА (р=0,0337 и р=0,0061), что, по мнению некоторых авторов, может являться фактором риска развития гестоза [Гайдуков и Аверина, 2011].
Выявлена ассоциация генотипов rs5888 гена SCARB1 (1050ОТ) с весом и ИМТ новорожденных (р 0,05). У пациенток с генотипом ТТ отмечались большие значения веса и ИМТ новорожденного по сравнению с носителями двух других генотипов СС (р=0,0059 и р=0,0080) и СТ (р=0,0431 и р=0,0551). Это согласуется с данными литературы об ассоциации аллели Тс метаболическим синдромом у детей [Juarez-Meavepena et al., 2012].
Также rs5888 SCARB1 (1050C T) вместе с rs328 гена LPL (1595C G) показали ассоциацию с уровнем антитромбина III (р 0,05). У носителей генотипов, содержащих аллели Т rs5888 и С rs328, отмечено снижение концентрации антитромбина III в крови, что, вероятно, способствует активации свертывающей системы крови [Демьяненко и др., 2013] и, как следствие, развитию гестоза.
Для пациенток с гестозом, гомозиготных по аллели С rs2695121 гена NR1H2, отмечено снижение уровня альбумина в крови (р 0,05). Уменьшение концентрации альбумина в крови влечет за собой появление отеков, может служить основой развития синдрома эндогенной интоксикации и свидетельствует о прогрессировании гестоза [Мороз и др., 2005; Gojnic et al., 2004; Сидорова, 2007].