Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 История изучения ГФА 14
1.2 Молекулярные основы ГФА 17
1.2.1 Фенилаланингидроксилаза 17
1.2.2 Тетрагидробиоптерин 19
1.2.3 Белок, содержащий J-домен 26
1.3 Классификация ГФА 28
1.3.1 Клиническая классификация 28
1.3.2 Молекулярно-генетическая классификация 29
1.4 Характеристика различных форм гиперфенилаланинемии 30
1.5 Эпидемиология 36
1.6 Диагностика гиперфенилаланинемии 38
1.7 Лечение различных форм гиперфенилаланинемии 40
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1 Материалы 44
2.2 Методы 44
2.2.1 Выделение геномной ДНК 44
2.2.2 Метод мультиплексной амплификации лигированных проб 44
2.2.3 Массовое параллельное секвенирование 50
2.2.4 Поиск крупных делеций и дупликаций в гене РАН 52
2.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле 53
2.2.6 Прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру 53
2.2.7 Кастомная система MLPA 55
2.2.8 Статистическая обработка данных 57
2.2.9 Биоинформатический анализ 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 60
3.1. Установление спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие ГФА в РФ 60
3.1.1. Поиск 25 частых вариантов гена РАН 60
3.1.2 Поиск вариантов методом МПС 63
3.1.3 Поиск крупных перестроек методом количественной MLPA 67
3.1.4. Редкие варианты гена РАН 69
3.1.5. Новые варианты гена РАН 77
3.2 Тетрагидробиоптерин-дефицитные формы ГФА 80
3.3. Особенности спектра вариантов в различных субъектах РФ 84
3.4. Доли потенциально сапротерин-зависимых и сапроптерин-чувствительных пациентов 89
3.5. Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с ГФА в РФ 92
Заключение 95
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список публикаций по теме диссертации 100
Список используемой литературы 102
- История изучения ГФА
- Характеристика различных форм гиперфенилаланинемии
- Редкие варианты гена РАН
- Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с ГФА в РФ
История изучения ГФА
Первым хорошо изученным наследственным метаболическим заболеванием является фенилкетонурия. Заболевание описано в 1934 году норвежским врачом Асбьёрном Фёллингом [Folling et al. 1934]. Он описал биохимическую патологию, лежащую в основе развития ФКУ, обнаружив фенилпировиноградную кислоту в моче двух детей и назвал заболевание фенилпировиноградная олигофрения. Позже заболевание переименовано в фенилкетонурию Лайонелом Пенроузом, который установил, что болезнь носит аутосомно-рецессивный характер наследования [Penrose et al. 1935]. В 1937 году Джордж Джервис установил, что причиной развития гиперфенилаланинемии при ФКУ является нарушение работы фермента фенилаланингидроксилазы. В дальнейшем это подтвердили тестами, проведенными на клетках печени больных фенилкетонурией in vitro [Jervis et al. 1953]. В 1950х годах впервые успешно применено лечение пациентов с ФКУ. На основании предыдущих работ, посвященных исследованию ФКУ, доктор Бикель с коллегами приготовил первый аминокислотный заменитель животного белка без содержания фенилаланина и успешно применил его на практике. В качестве заменителя использовался гидролизат казеина, очищенный от фенилаланина [Bickel et al. 1953]. Таким образом, ФКУ – это первое наследственное заболевание, для которого найдено эффективное лечение путем модификации внешних факторов. Данный метод лечения остается наиболее эффективным и в настоящее время.
Благодаря работе доктора Роберта Гатри стало возможным проведение неонатального скрининга ГФА [Guthrie et al. 1963]. В основе метода лежит явление торможения роста Bacillus subtilis при посеве на питательную среду, содержащую специфические ингибиторы роста микроорганизмов. При содержании ФА в крови, превышающем нормальные значения (2-6 мг/дл), тормозящее влияние химического ингибитора снимается и бактерии начинают активно расти. Содержание фенилаланина в крови оценивается по диаметру образовавшейся колонии. Позже, на смену микробиологическому методу пришел иммуноферментный анализ и флуориметрия. В настоящее время клиническая диагностика почти повсеместно проводится методом тандемной масс-спектрометрии из-за скорости получения результата [Lukacs et al. 2006]. Неизменным остается только метод забора биоматериала для проведения скрининга, так как сухие пятна крови на фильтре просты в использовании и не требуют особых условий при транспортировке.
В 1970-х годах описано, что гидроксилазная система печени, отвечающая за превращение ФА в тирозин, состоит из двух апоферментов – фенилаланингидроксилазы и дигидроптеридинредуктазы, а также необходимого кофактора L-эритро-5,6,7,8-тетрагидробиоптерина (BH4) [Massey V. et al. 1975]. C 1974 года описано несколько пациентов с атипичной ФКУ, клиническая картинка которых схожа с таковой при классической ФКУ, однако основным отличием являлось отсутствие улучшений при ограничении поступления ФА, а также несколько случаев смерти таких пациентов в течение первых лет жизни [Bartholome et al. 1974; Danks et al. 1975; Kaufman et al. 1978; Danks et al. 1978]. Исследование биопсии печени и биохимический анализ крови таких пациентов показали нормальную активность ФАГ, но низкую концентрацию биоптеринподобных соединений в сыворотке крови и печени [Leeming et al. 1976; Kaufman et al. 1978]. Очевидно, что гиперфенилаланинемия у таких пациентов вызвана дефицитом ВН4. В связи с этим заболевание получило название «злокачественная гиперфенилаланинемия», а позже переименовано в «дефицит ВН4» [Danks et al. 1978; Curtius et al. 1979]. В настоящее время насчитывают 5 генетических форм гиперфенилаланинемии с дефицитом ВН4 и одну форму без дефицита ВН4. Для дифференциальной диагностики дефицита ВН4 Данкс предложил тестировать всех пациентов, у которых отмечена гиперфенилаланинемия, введением ВН4 [Danks et al. 1978]. При введении ВН4 у таких пациентов высокая концентрация ФА в сыворотке снижалась. Впервые это продемонстрировано у 17-ти месячного пациента с дефицитом ВН4. При введении ВН4, фенилаланин сыворотки снизился с 7,2 до 5,6 мг/дл через два часа после введения 10 мг BH4. В течение следующих двух дней пациенту однократно ввели 50 мг в первый и 100 мг во второй день, после чего фенилаланин сыворотки снизился до 1,5 мг/дл [Danks et al. 1975]. В связи с этим проводились исследования, направленные на изучение ВН4 и его синтетических аналогов для лечения ГФА. По настоящее время для лечения ГФА с дефицитом ВН4 во всем мире используется синтетический аналог сапроптерин дигидрохлорид - Куван (Kuvan, BioMarin Pharmaceutical Inc, США). Позднее обнаружено, что некоторые пациенты с вариантами в гене РАН также отвечают на введение ВН4 [Kure et al. 1999], данный феномен получил название «ВН4 чувствительная ФКУ». Замечено, что у пациентов с такой формой ГФА отмечается высокая остаточная активность фермента ФАГ, что повлекло за собой предположение о связи типа вариантов с ответом на лечение тетрагидробиоптерином [Spaapen et al. 2003]. Кроме того, стало известно, что фенилкетонурия – конформационное заболевание, вызванное мисфолдингом белка ФАГ [Gersting et al. 2008]. Введение тетрагидробиоптерина пациентам с определенными вариантами в гене РАН приводило к восстановлению рабочей конформации ФАГ [Pey et al. 2004]. В таком случае, тетрагидробиоптерин, считавшийся до этого кофактором ФАГ, на самом деле является шапероном, что доказано позднее in vivo на модели мышей [Gersting et al. 2010]. Данное открытие в дальнейшем помогло в лечении других конформационных заболеваний.
К 1990-м годам установлено, что ген PAH человека локализован на 12 хромосоме (12q22-12q24.2) и окончательно определена молекулярная структура гена [DiLella et al. 1986; Lidksy et al. 1984].
Характеристика различных форм гиперфенилаланинемии
Фенилкетонурия (OMIM:261600) – наследственное метаболическое заболевание, наследующееся по аутосомно-рецессивному типу. Причиной заболевания является недостаточность фермента фенилаланингидроксилазы, возникающая вследствие патогенных вариантов в гене PAH. Ген PAH расположен на коротком плече 12 хромосомы в регионе 12q22-12q24.2. При нарушении работы фермента в организме образуются токсичные продукты обмена ФА, которые накапливаются в головном мозге и приводят к возникновению вторичных нарушений обмена аминокислот.
Клинические проявления ФКУ отмечаются не сразу. При отсутствии своевременного лечения у пациентов развиваются тяжелые интеллектуальные расстройства, судороги, атаксия, моторный дефицит и поведенческие нарушения, а также признаки аутизма. Степень умственной отсталости пациентов зависит от тяжести клинических проявлений ФКУ и возраста, в котором начинается лечение. Также, у больных наблюдаются проблемы развития, которые могут сопровождаться аномальным поведением, включая самоповреждение, агрессию, импульсивность и психоз [Camp et al. 2014].
Патологические изменения при ФКУ почти полностью ограничиваются головным мозгом. Кроме влияния токсичных продуктов обмена ФА существуют и другие причины возникающих повреждений. Ниже представлены возможные пути патогенеза при ФКУ.
1) Окислительный стресс
Окислительный стресс возникает при нарушении баланса между работой антиоксидантных систем организма и продукцией активных форм кислорода. В связи с высокой потребностью тканей мозга в кислороде, они являются наиболее уязвимыми к влиянию окислительного стресса. В проводимых ранее исследованиях отмечается повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови пациентов, больных ФКУ. Из полученных данных можно сделать вывод, что при ФКУ происходит снижение работы антиоксидантных систем [Sanayama et al. 2011].
2) Синтез белков
Существует отрицательная корреляция между скоростью синтеза белков головного мозга и повышением концентрации ФА в плазме крови [Pardridge et al. 1998]. Причиной служит нарушение транспорта крупных нейтральных аминокислот (large neutral amino acids; LNAA) через гематоэнцефалический барьер и снижение включения тирозина в белки в центральной нервной системе (ЦНС) [de Groot et al. 2015]. Фенилаланин конкурентно связывается с белком-переносчиком LNAA в ЦНС, что приводит к повышению уровня ФА в мозге и снижению уровня других аминокислот, необходимых для синтеза белков и производства нейромедиаторов. Кроме того, высокие концентрации фенилаланина, уменьшение доступности других LNAA могут ингибировать развитие миелина. Отмечается нарушение синтеза допамина и серотонина вследствие нарушения биосинтеза биогенных аминов, тирозина и триптофангидроксилазы. Нарушение глутаматергической синаптической передачи и активности ключевых ферментов, таких как пируваткиназа, тирозин- и триптофангидроксилаза и ГМГ-КоА редуктаза [Feillet et al. 2010].
3) Липидный обмен
У пациентов с ФКУ наблюдается снижение уровня сывороточных липопротеинов, таких как общий холестерин, липопротеины высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП) и аполипопротеин AI / A-II и B [Nagasaka et al. 2014]. Данное изменение вызвано нарушением синтеза холестерина в связи со снижением экспрессии 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы, регулирующей скорость холестерогенеза [Shefer et al. 2000]. Также отмечается снижение уровня оксистеролов и витамина D [Nagasaka et al. 2013]. Фенилаланин и его метаболиты влияют на биосинтез длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот путем ингибирования реакции деоксигенации, снижая синтез арахидоновой и докозагексаеновой кислот [Infante et al. 2001].
4) Биоэнергетика
Изменения энергетического обмена в головном мозге играют важную роль в патофизиологии многих врожденных нарушений метаболизма. При ФКУ отмечено значительное снижение активности креатинкиназы – ключевого фермента, поддерживающего гомеостаз АТФ [Wallimann et al. 2011]. ФА и его метаболиты нарушают метаболизм кетоновых тел путем ингибирования 3-гидроксибутират-дегидрогеназы и сукцинил-КоА-трансферазы в головном мозге [Benavides et al. 1976]. Фенилпировиноградная кислота ингибирует окисление пирувата и малата в скелетных мышцах, посредством угнетения пируватдегидрогеназного комплекса, что связано с накоплением лактата у людей, больных ФКУ [Swierczynski et al. 1976]. Нарушения биоэнергетики также связаны с дефицитом ионов металлов (таких как цинк, железо, магний), являющихся кофакторами метаболических ферментов [Ragsdale et al. 2010].
5) Гомеостаз кальция
Гомеостаз кальция имеет решающее значение в функционировании головного мозга. Обнаружено снижение кальцитонина в сыворотке крови у больных ФКУ, но при этом увеличение паратиреоидного гормона (регулирует метаболизм кальция), остеокальцина и дегидрохолекальциферола [Бушуева Т. В. и др. 1993]. В другом исследовании Ю (Yu Y.G.) и его коллеги показали, что ФА изменяет внутриклеточные концентрации свободного кальция путем модуляции кальциевых АТФаз плазматической мембраны корковых нейронов [Yu et al. 2007].
Редкие варианты гена РАН
В настоящей работе с использованием всех доступных методов выявлено 108 редких вариантов гена РАН в выборке российских больных. Среди этих вариантов 10 ранее не описаны в литературе. Все выявленные варианты приведены в таблице 20 с указанием аллельных частот. Аллельные частоты вариантов рассчитывались на выборке из 2516 хромосом, без учета хромосом с установленными вариантами в гене PTS.
Среди редких вариантов обнаружены варианты, встречающиеся в выборке чаще, чем вариант p.Ser349Pro, входящий в систему детекции 25 частых вариантов. Обнаружено 10 редких вариантов гена РАН, которые встретились на 7 и более хромосомах (таб. 24). В связи с этим возможно редактирование существующей системы детекции частых вариантов для повышения ее эффективности. Данный вопрос рассмотрен ниже.
Всего в ходе работы в гене РА Н обнаружено 133 варианта, включая 25 частых вариантов, 94 редких варианта, 4 крупные перестройки и 10 ранее не описанных вариантов. Варианты гена РАН обнаружены на 2471 хромосоме (97,8% от всех хромосом). Основная часть выявленных вариантов представлена миссенс-вариантами (82,2%). Варианты сплайсинга составляют 10,1%, небольшие делеции и дупликации 3,2%, нонсенс варианты 3,2%. Крупные перестройки встречаются с частотой 1,3% (рис. 11).
Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с ГФА в РФ
Суммарная аллельная частота повторяющихся редких вариантов, встретившихся в данной работе более 6 раз, составляет 3,4% (таблица 24). Выявлено 10 таких повторяющихся редких вариантов гена РАН. Добавление этих вариантов в существующую систему детекции частых вариантов не является целесообразным. Создание новой системы не имеет смысла, учитывая низкую частоту встретившихся вариантов и высокие временные и экономические затраты.
Исходя из результатов, полученных в ходе работы, предложен усовершенствованный протокол молекулярно-генетической диагностики ГФА (рис. 15).
На первом этапе проводится поиск 25 частых мутаций в гене РАН. Также, поиск частых вариантов можно проводить в «горячих» экзонах (6, 7, 12) гена РАН, в отсутствие специализированных диагностических систем. Если у пациента обнаружена одна мутация в гене РАН, рекомендуется проведение прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена РАН. Для пациентов, у которых не найдено частых мутаций в гене РАН, рекомендуется проведение поиска редких вариантов методом массового параллельного секвенирования в генах PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12. В случае, если, после проведения секвенирования по Сэнгеру или использования метода МПС обнаружена только одна мутация в гене РАН или мутаций не найдено, рекомендуется проведение поиска крупных делеций и дупликаций в гене РАН методом MLPA. Такой протокол позволит точно и своевременно устанавливать молекулярно-генетические причины гиперфенилаланинемии у каждого конкретного пациента. А также сократить экономические затраты на проведение необязательных диагностических анализов.
В случае, если у пациента не выявлено два частых варианта в гене РАН, существует вероятность, что гиперфенилаланинемия вызвана вариантами в других известных генах, и более целесообразно направить пациента на поиск вариантов методом МПС. Таким образом удастся сократить время, которое ранее затрачивалось на последовательный поиск вариантов в каждом из генов интереса, и позволит проводить дифференциальную диагностику в отсутствии рутинных тест-систем.