Введение к работе
Настоящая работа посвящена исследованию предполагаемой области локализации гена ХГ1, ответственного за возникновение множественной экзостозной хондродисплазии (МЭХД).
Актуальность темы. Обнаружение и исследование генов, мутации в которых приводят к возникновению наследственных заболеваний человека, позволяют не только понять молекулярно-гене-тические механизмы возникновения этих заболеваний, но и разработать эффективные методы их диагностики.
МЭХД является достаточно распространенным аутосоыно-доминантным заболеванием, имеющим частоту 1 на 50000-100000 чалоеек в различных популяциях (Shmate et al , 1994), и составляет до 10% обращений в специализированные клиники. До 80% МЭХД составляют семейные случаи (Le Merrer et at., 1994). На эту патологию приходится около 27% всех доброкачественных опухолей, опухолеподобных и диспластических поражений скелета (Eder et al., 1993). Серьезным осложнением при множественных экзостозах (МЭ) является трансформация отдельных экзостозов во вторичную хондрому и/или хондросаркому. Частота таких случаев достигает 5% (Lackert-Wickland et al., 1994).
На сегодняшний день известно, что МЭ- гетерогенное заболевание. Гены, ответственные за возникновение этого заболевания, картированы на хромосомах 8, 11, 19. При генетическом картировании МЭХД с использованием микросателлитных маркеров показано, что примерно в 50% семей с МЭ предполагаемый ген заболевания локализуется в области хромосомы 8q24.11 (Cook el al , 1993; Blanton et al, 1996). Хромосома 8 человека содержит около 155 миллионов пар муклеотидов (м.п.н.) и составляет около 4% генома человека На ней локализовано 249 STR (Short Tandem Repeats) (Dib et al 1996). За последние годы на хромосоме 8 картировано около 200 генов, в том числе гены пигментного ретинита 2-го типа, атипичной макулярной дистрофии, аде-нилциклазы мозга человека, а также гены ответственные за возникновение опухоли предстательной железы, плейоморфной аде номы слюнных желез, рака прямой кишки и др. Участок длинного плеча хромосомы 8q23-24 12 имеет протяженность около 25 м п н., и на нем картированы 4 гена: рецептор тиреотропин-по-добного гормона, трихо-рино-фаланговый синдром І-типа; множественная экзостозная хондродисплазия; дистрофин-ассоциирован-ный пептид (Spurr et al., 1994; Chen et al., 1996).
\
Ранее было проведено делеционное картирование у в больных с синдромом Лангвра-Гидиона (СЛГ) и 3 больных с трихо рино-фаланговым синдромом І-типа (ТРФС-1). Показано, что наиболее вероятным районом локализации гена ЕХТ1 является локус O8S67(cm.phc.10.) из хромосомной области (Немцова v др., 1996). Из этого локуса был выделен и клонирован новый ДНК-маркер 49С2Н14 (далее М5). При использовании его в качестве ДНК-зонда был выявлен дополнительный гибридизационный сигнал, около 6.5 т.п.н., у 8 больных из 4 семей с МЭХД. Это позволило предположить, что этот маркер является внутригенным илу расположен в непосредственной близости от предполагаемогс гена ЕХТ1 (Немцова, 1994). Все выше сказанное определило цель и задачи настоящего исследования.
Основной целью исследования была молекулярно-генети-ческая характеристика локуса D8S67, которая является областьк предполагаемой локализации гена МЭХД (ХГ1). Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Характеристика ДНК-маркера М5 из локуса D8S67 на основе секвенирования и компьютерного анализа нуклеотидной последовательности;
-
Скрининг кДНК-библиотек человека с использованием ДНК маркера М5 для выявления клонов, содержащих кодирующую последовательность из локуса D8S67;
-
Молекулярно-генетическая характеристика отобранных кДНК-клоноа на основе секвенирования и компьютерного анализі нуклеотидных последовательностей;
-
Характеристика полиморфных районов локуса D8S67 в норме и при множественной экзостозной хондродисплаэии;
6. Поиск и характеристика мутаций в ДНК лимфоцитов и секционного материала экзостоза и хондросаркомы у больных МЭХД.
Научная новизна. Впервые проведен молекулярно-генетиче ский анализ нуклеотидной последовательности из локуса D8S67 і районе хромосомы , который является предполагаемое областью локализации гена МЭХД (БХГ1). Определена нуклеотид-ная последовательность ДНК-маркера М5 протяженностью 555! п.н., при помощи компьютерного анализа выявлены 3 вероятны) акзона а его составе. Определена нуклеотидная последовательность 5 отобранных кДНК-кпонов общей протяженностью болеї 4000 п.н. и проведен их компьютерный анализ. Один из кДНК-кло
нов локализован в последовательности ДНК-маркера MS. Получены 6 новых STS (Sequence Tagged Site- секввнированный маркерный участок) и один EST (Expressed Sequence Tag- экспресси-рующийся секвенированный маркер) для локуса D8S67. В районе этого локуса выявлен ранее не описанный, высокополиморфный несовершенный тетрануклеотидный повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п, охарактеризована вариабельность его аллелей в норме и у больных с МЭХД. Впервые проведен поиск мутаций в нескольких районах локуса D8S67 у больных с МЭХД и в секционном материале экзостоза и хондросаркомы. В результате исследования выявлены 4 случая вероятных мутаций и одна структурная перестройка в ДНК лимфоцитов и секционного материала экзостоза.
Практическая ценность. В результате проделанной работы охарактеризованы последовательность ДНК-маркера MS и новые STS и EST в локусе D8S67, которые могут быть использованы для физического и генетического картирования. Полученная информация является вкладом в программу "Геном человека". Разработана модификация метода окраски ДНК нитратом серебра, которая позволяет сократить время окрашивания с 2 часов до 30 мин. Нами получен и охарактеризован новый, уникальный для района хромосомы высокополиморфный тетрануклеотидный повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п. Повтор может быть использован для анализа сцепления района в семьях, для косвенной пренатальной и пресимптоматической ДНК-диагностики МЭХД, ТРФС-І и ТРФС-И Выявлены 4 случая вероятных мутаций в 4 семьях с МЭХД и структурная перестройка района в ДМК лимфоцитов и секционного материала экзостоза у больного еще одной семьи с заболеванием. Показана целесообразность использования ДНК-маркера М5 для характеристики состояния локуса D8S67 при МЭХД и в секционном материале экзостозов Дальнейшее изучение района позволит прояснить причину возникновения МЭХД и разработать прямую ДНК-диагностику этой патологии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Съезде медицинских генетиков России (Москва, 1094), на 11-ом Международном рабочвм совещании по картированию хро мосомы 8 (Великобритания, 1994), на 27-ой и 28-ой Европейских ежегодных конференциях по генетике человека (Париж, 1004, Берлин 1995), на научных семинарах Института клинической генетики МГНЦ РАМН в мае 1995 г. и в июне 1996 г., на IV и V Российских конференциях "Геном человека" (Черноголовка 1094, 1998).
Публикации, По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 105 работ.