Введение к работе
Актуальность проблены. Процессы жизнедеятельности растительной клетки осуществляются в результате согласованного функционирования генома ядра и цитоплазматических факторов наследственности. Открытие хлоропластной ДНК более 30 лет назад привлекло особое внимание к изучению вопроса о роли пластома в регуляции процессов развития и жизнедеятельности целостного растительного организма. В геноме хло-ропластов на настоящий момент идентифицировано около 100 генов, кодирующих белки аппарата транскрипции-трансляции пластид, белки, принимающие участие в процессах фотосинтеза. Хлоропластный геном в значительной степени определяет устойчивость растений к различным сгрессорннм воздействиям. Внутривидовая цитоплазматическая изменчивость может существенно влиять на продуктивность растений, их устойчивость к возбудителям заболеваний, а также на частоту маркерных признаков в гибридных популяциях растений.
Пластидные нутации являются прекрасными моделями для изучения пластидно-ядерных взаимоотношений, например, принципов координации и регуляции экспрессии хлоропластных и ядерных генов б процессе биогенеза пластид. Открытие Ю.Д.Белецким (1969) способа направленного получения пластомных мутантов сделало возможным всестороннее изучение пластид как полуавтонокных генетических систем растительной клетки. В то же время индукция пластидных мутаций позволяет раскрыть механизмы химического мутагенеза, решить проблемы некоторых разделов биохимии и физиологии растений.
В настоящее время в отделе генетики НИИ биологии РГУ создана коллекция пластомных мутантов подсолнечника и горчицы. Шгастидная природа индуцированных мутаций была доказана результатами гибридологического анализа. Но ранее проведенный сравнительный анализ ряда пластомных мутантов подсолнечника не выявил существенных различий по некоторым биохимическим и молекулярным характеристикам по сравнению с исходной инбредной линией (Таран С, 1991; Усатов А.,1993). В качестве индуктора.пластидных нутаций был использован супермутаген Ы-нитрозо-И-метилмочевина (НМИ). Несмотря на то, что первые пластомные мутанты подсолнечника были индуцированы 30 лет назад, механизм действия НИМ до сих пор не ясен. Возможным подходом к изучению пластидного мутагенеза является модифицирование условий для
индукции мутаций.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы явилось изучение возможности модификации мутагенного эффекта НММ разобщителем дыхания и окислительного фос-форилирования 2,4-динитрофенолом и ингибитором хлоропластной РНК-полимеразы рифампицином, а также сравнительный цитогенетичес-кий, биохимический и молекулярный анализ ряда пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных НММ.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
определить эффективность индукции ИМИ хлорофилльных мутантов подсолнечника в зависимости от времени действия 2,4-динитрофенола или рифампицина;
привести доказательства пластидной природы индуцированных НММ хлорофилльных мутантов подсолнечника,-
провести сравнительный анализ устойчивости к НММ инбредной зеленой линии 3 629 и ряда пластомных мутантов подсолнечника;
исследовать активность антиоксидантних ферментов и содержание малонового диальдегида в тканях хлорофилльных мутантов подсолнечника ;
провести сравнительный рестрикционный анализ хлоропластной ДНК исходной линии 3629 и ряда пластомных мутантов подсолнечника.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Мутагенный эффект НММ может быть модифицирован ингибиторами метаболизма, в частности 2,4-динитрофенолом и рифампицином. Частота индуцированных мутантов подсолнечника и их природа зависят от времени действия вещества модификатора.
-
Пластомные мутанты подсолнечника более чувствительны к действию низких концентраций НММ на ранних сроках фиксации, однако характеризуются более стабильным клеточным циклом.
-
Природа индуцированных пластидных мутантов подсолнечника может быть обусловлена крупными делециями в молекулах хлоропластной ДНК.
-
Активность антиоксидантних ферментов и содержание малонового диальдегида в тканях пластомных мутантов подсолнечника достоверно отличаются от этих же показателей для исходной линии 3629.
Научная новизна результатов исследования. Впервые определены эффективные временные отрезки модификации мутагенного эффекта НММ
ингибиторами метаболизма. Показано, что в течение первых 6 часов роста проростки подсолнечника наиболее восприимчивы к действию внешнего стрессорного фактора. Природа индуцируемых мутаций в определенной степени зависит от времени действия вещества-модификатора.
Показано, что тшастомный мутант chlorina-5 и ядерно-цитоплаз-матический мутант chlorina-12 более чувствительны к низким дозам нитрозометилмочевины на ранних сроках фиксации по сравнению с линией 3629; однако данные линии характеризуются более стабильным клеточным циклом.
Впервые получены достоверные отличия активности антиоксидантних ферментов и содержания малонового диальдегида в тканях ряда индуцированных пластомкых и ядерно-цитоплазматичесхих мутантов подсолнечника по сравнению с исходной линией 3629.
С помощью рестрикционного анализа показаЕ-го, что природа индуцированных НММ пластидных мутаций подсолнечника может быть обусловлена крупными делецияки в хлоропластной ДНК.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты экспериментов расиирявт представления о механизмах образования пластидных мутаций. Показано, что эффективность индуцированного пластидного мутагенеза зависит от состояния белоксинтезирующей системы растительной клетки. Выявлены наиболее чувствительные временные интервалы онтогенеза подсолнечника для модификации мутагенного эффекта НММ, что может служить основой для получения пластидных мутаций у других видов высших растений. Маркированные на уровне фенотипа пластомные мутанты могут служить материалом для исследования механизмов участия пластсма в детерминации межгеномных взаимодействий при формировании морфологических, биохимических признаков и свойств растений. Целесообразно их использование для решения проблем теории мутагенеза, генетики фотосинтеза и экологической генетики. Пластомные мутанты могут быть использованы как исходный матери-- ал селекции для получения форм, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, возбудителям заболеваний.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной сессии биояого-почвенного факультета РГУ (1994, 1996), на 3 Европейском симпозиуме по биотехнологии подсолнечника (Германия, октябрь 1995), на VI Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, сентябрь 1997).
Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 3 научных работы.
Сруктура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками. Работа состоит из зведення, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения,.выводов, списка литературы, включающего 65 отечественных и 112 зарубежных источника.